KR20230004466A - 황산화된 다당류의 제조 방법 및 paps의 제조 방법 - Google Patents

황산화된 다당류의 제조 방법 및 paps의 제조 방법 Download PDF

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료스케 가토
마사히로 구라츠
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신-이치 하시모토
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Abstract

본 발명의 목적은 황산마그네슘과 같은 저렴한 원료의 혼합 시 미생물 또는 이의 처리물의 대사 활성을 이용하는 PAPS 생산/재생 시스템을 황산화 효소를 발현하는 미생물 또는 이의 처리물 또는 추출물과 반응시켜 황산화된 다당류를 용이하게 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 저렴한 원료로부터 PAPS를 제조하는 실용적인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 황산화된 다당류의 제조 방법 및 PAPS의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법들은 발현 가능한 방식으로 도입된 ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나아제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 세균의 형질전환체(a)로서, 상기 형질전환체(a)의 세포 원형질막이 물질-투과성인 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물을 제조하는 단계; 및 ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계를 포함한다.

Description

황산화된 다당류의 제조 방법 및 PAPS의 제조 방법
본 발명은 ATP 설퍼릴라제(sulfurylase) 및 APS 키나제(아데닐릴설페이트 키나제)를 발현하는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 세균을 사용하여 글루코스 및 아데닌과 같은 저렴한 원료로부터 3'-포스포아데노신 5'-포스포설페이트(이하, PAPS로 지칭됨)를 제조하는 방법, 및 코리네박테리움 속의 세균 및 다양한 황산화 효소를 발현하는 원핵생물에 속하는 미생물을 사용하여 황산화된 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다.
PAPS는 미생물부터 고등 유기체에 이르는 광범위하게 존재하는 조효소이며 생체내에서 설페이트 기의 공여체로서 기능을 한다. 고등 유기체에서, PAPS는 콘드로이틴 설페이트 및 헤파란 설페이트와 같은 글리코사미노글리칸의 생합성을 위해 요구된다. 황산화된 생체내 대사산물은 다양한 생리적 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있으며, PAPS 자체는 육모제(PTL 1), 보습 효과를 갖는 피부용 외용제(PTL 2) 등으로 사용될 것으로 기대된다.
PAPS의 제조 방법으로서, 원료로서 ATP를 사용하여, 정제된 효모로부터 유래된 ATP 설퍼릴라제, 푸른 곰팡이로부터 유래된 APS 키나제 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유래된 피로포스파타제를 사용하는 방법(NPL 1); 상기 방법에서와 같이 원료로서 ATP를 사용하여 호열성 세균으로부터 유래된 열안정성 ATP 설퍼릴라제, APS 키나제 및 효모로부터 유래된 피로포스파타제를 사용하는 방법(PTL 3); 원료로서 아데노신 5'-모노포스페이트(이하 AMP로 지칭)를 사용하여, 열안정성 세균으로부터 유래된 ATP 설퍼릴라제, APS 키나제 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래된 폴리포스페이트 키나제를 사용하는 방법(PTL 4); 등이 알려져 있다.
한편, 글루코스 및 아데닌 등과 같은 저렴한 원료의 사용 시, 세균 세포의 막을 크실렌 또는 계면활성제를 처리하여 그에 대한 투과성을 부여한 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)의 돌연변이 균주를 이용하여 ATP를 산업적으로 생산하는 방법이 알려져 있다(NPL 2).
PAPS는 매우 불안정한 화합물이다. 심지어 조효소(crude enzyme)를 이용하는 방법에서도, 숙주로서 에스케리키아 콜라이에 의해 재조합적으로 발현되는 열안정성 세균으로부터 유래된 ATP 설퍼릴라제 및 APS 키나제의 조효소를 제조한 후, 반응 전에 가열 처리하고 이를 통해 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 오염 효소의 활성을 억제함으로써 PAPS가 제조된다(PTL 4)
PTL8은 PAPS가 에스케리키아 콜라이의 조효소 용액에서 분해된다고 개시하고 있다. 에스케리키아 콜라이는 PAPS의 분해와 관련된 일부 효소를 가지고 있으며, 이러한 효소의 유전자를 결실시켜 PAPS의 분해를 억제할 수 있다.
황산화된 다당류인 헤파린은 주요 항응고제이며 혈전색전증 및 파종성 혈관내 응고 증후군을 위해 및 인공 투석 동안 및 체외 순환 시 응고 방지 등을 위해 사용된다. 산업적으로, 대부분의 헤파린은 돼지의 장 점막으로부터 추출 및 정제된다. 2008년에 돼지 유래의 헤파린이 불순물로 오염됨으로 인해 발생한 사망 사고 이후, 비동물 유래 생산관리/품질관리 헤파린에 대한 연구개발이 수행되어 왔다.
구체적 예로서, 일부 그람-음성 미생물의 협막 다당류인 발효적으로 생산 및 정제된 N-아세틸헤파로산(이하 헤파로산으로 지칭)을 화학적으로 N-탈아세틸화 및 N-황산화한 후, 효소적 에피머화 및 황산화하여, 돼지로부터 유래된 것과 동일한 구조 및 항응고 활성을 갖는 헤파린을 산출하는 방법이 있다(PTL 5 내지 7 및 NPL 3 및 4).
콘드로이틴 설페이트는 또 다른 유용한 황산화된 다당류로서 알려져 있으며, 관절통용 약물 및 각막 표면층 보호를 위한 점안제로서 사용되어 왔다. 다양한 동물 조직으로부터 추출 및 정제된 콘드로이틴 설페이트가 사용되었지만, 최근에는 헤파린과 동일한 방식으로 원료로서 에스케리키아 콜라이로부터 유래된 협막 다당류를 사용하는, 황산화 효소를 사용하는 방법이 보고되었다(NPL 5 및 6).
원료로서 미생물의 협막으로부터 유래된 다당류를 사용하는, 정제된 효소를 사용하여 황산화를 수행하는 방법에서, PAPS는 황산화 효소의 반응에서 설페이트 기의 공여체로서 역할을 하고 조효로서 요구된다. 원료로서 미생물의 협막으로부터 유래된 협막 다당류를 사용하여 황산화된 다당류를 제조하는 상기 언급한 방법에서, 기질 다당류로의 PAPS의 설페이트 기 전이에 의해 3'-포스포아데노신 5'-포스페이트(이하, PAP로 지칭)가 생성되고 p-니트로페닐 설페이트의 설페이트 기가 PAP로 효소적으로 전이됨으로써 PAPS가 재생되고 다당류의 효소적 황산화 반응이 진행된다(PTL 6 및 NPL 3).
PTL 1; WO2012/057336 PTL 2: JP-A-2012-201665 PTL 3: JP-A-H5-137588 PTL 4: 일본 특허 제 4505011호 PTL 5: 일본 특허 제 5830464호 PTL 6: 미국 특허 제8771995호 PTL 7: WO2018/048973 PTL 8: WO2020/013346
NPL 1: Glycobiology vol. 21, no. 6, pp. 771-780, 2011 NPL 2: Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 (3), 644-650, 2001 NPL 3: Carbohydrate Polymers 122 (2015) 399-407 NPL 4: Advanced Drug Delivery Reviews 97 (2016) 237-249 NPL 5: Metabolic Engineering 27 (2015) 92-100 NPL 6: Biotechnology and Bioengineering 115 (2018) 1561-1570
NPL 1과 PTL 1 및 2에 기재된 종래의 PAPS 제조 방법은 각각 원료로서 ATP 및 AMP와 같은 비교적 고가의 뉴클레오티드를 사용하고, 세균을 배양한 후 세균 세포를 분리하고 초음파 처리 등에 의해 세균 세포를 파괴하고 원심분리함으로써 제조되는 효소 또는 조효소를 사용한다. 따라서, 이러한 방법들을 산업적 규모로 수행하는 것은 쉽지 않다.
반면, 상술한 바와 같이, PAPS의 제조를 위해 원료로서 ATP 또는 AMP를 사용하는 정제된 효소 또는 조효소를 사용하는 방법이 알려져 있지만, 미생물 자체를 사용하여 PAPS를 제조하는 예는 알려져 있지 않다. 또한, 상술한 바와 같이 PAPS는 매우 불안정한 화합물이며, 종래 기술에서는 조효소가 사용되는 경우에 효소를 오염시키는 활성을 열 처리에 의해 억제하는 것과 같은 복잡한 단계가 수행된다.
상기 사항을 고려하면, 숙주로서 코리네박테리움 속의 세균에서 ATP 설퍼릴라제 및 APS 키나제를 단순히 발현시킴으로써 산업적으로 ATP를 제조하는 방법과 유사한 방법으로 PAPS를 제조할 수 있다고 예측하기는 어렵다. 이는 에스케리키아 콜라이의 경우와 마찬가지로, 코리네박테리움 속도 PAPS의 분해와 관련된 일부 효소를 갖기 때문이다.
또한, 상술한 바와 같이, 다당류를 효소적으로 황산화하는 종래의 방법은 황산화 효소를 발현하는 미생물을 배양한 후, 수집 및 초음파 처리 등을 수행하여 생성되는 세포 용해물로부터 정제된 복수의 황산화 효소를 사용한다. 이들 방법은 산업적 규모로 구현하기가 쉽지 않았다. 또한 원료로서 고가의 PAPS 및 p-니트로페닐 설페이트가 요구되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 황산마그네슘과 같은 저렴한 원료의 혼합 시 미생물 또는 이의 처리물의 대사 활성을 이용하는 PAPS 생산/재생 시스템을 황산화 효소를 발현하는 미생물 또는 이의 처리물 또는 추출물과 반응시켜 황산화된 다당류를 용이하게 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 저렴한 원료로부터 PAPS를 제조하는 실용적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 다음의 발견 (1) 및 (2)에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
(1) PAPS는, 숙주로서 ATP 생산능을 갖는 코리네박테리움 속의 세균을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 ATP 설퍼릴라제 및 APS 키나제 활성이 향상된 균주를 배양하고 계면활성제 등으로 그에 대해 막 투과성을 부여하고 글루코스 및 아데닌과 같은 원료를 첨가함으로써 관련 분야의 방법에 비해 보다 쉽고 저렴하게 제조될 수 있다.
(2) 황산화된 다당류는, (1)에 기재된 ATP 설퍼릴라제 및 APS 키나제 활성이 향상된 균주를 PAPS 생산/재생 반응을 책임지는 미생물 세균 세포로서 사용하고 에피머라제 및/또는 황산화 효소를 발현하는 원핵생물에 속하는 미생물에 막 투과성을 부여하고 혼합 반응을 수행함으로써, 효소 정제 또는 PAPS 첨가 없이 세균 세포 및 황산마그네슘과 같은 저렴한 원료를 사용하여 제조될 수 있다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
1. 하기 단계 (1-1) 및 (1-2)를 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
(1-1) 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물을 제조하는 단계; 및
(1-2) ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계.
2. 1에 있어서, 하기 단계 (2-1) 및 (2-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
(2-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(2-2) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 C5-에피머화를 수행하는 단계.
3. 1 또는 2에 있어서, 발현 가능한 방식으로 도입된 설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 처리물 또는 추출물에 의해 황산화를 수행하는 단계를 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법.
4. 3에 있어서, 하기 단계 (3-1) 및 (3-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
(3-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(3-2) 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 2-O-황산화를 수행하는 단계.
5. 3 또는 4에 있어서, 하기 단계 (3'-1) 내지 (3'-3)을 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
(3'-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계;
(3'-2) 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(3'-3) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물, 및 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 C5-에피머화 및 2-O-황산화를 수행하는 단계.
6. 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계 (4-1) 및 (4-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
(4-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 6-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(d) 또는 형질전환체(d)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(4-2) 형질전환체(d) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 6-O-황산화를 수행하는 단계.
7. 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계 (5-1) 및 (5-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
(5-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 3-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(e) 또는 형질전환체(e)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(5-2) 형질전환체(e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 3-O-황산화를 수행하는 단계.
8. 황산화된 다당류의 제조 방법으로서,
발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물과, 하기로부터 선택된 적어도 하나를, ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물,
발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물,
발현 가능한 방식으로 도입된 6-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(d) 또는 형질전환체(d)의 처리물 또는 추출물, 및
발현 가능한 방식으로 도입된 3-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(e) 또는 형질전환체(e)의 처리물 또는 추출물.
9. 7에 있어서, 형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법.
10. 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 헤파린을 제조하기 위한 것인 황산화된 다당류의 제조 방법.
11. 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는, PAPS의 제조 방법:
(i) 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 처리물을 제조하는 단계; 및
(ii) ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원, 및 단계 (i)에서 제조된 형질전환체 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계.
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에 따르면, 황산화된 다당류는 미생물의 대사 활성을 이용하는 PAPS 생산/재생 시스템 및 황산화 효소를 발현하는 미생물 또는 이의 처리물 또는 추출물을 이용하여 쉽고 저렴하게 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 PAPS의 제조 방법에 따르면, PAPS는 미생물 또는 이의 처리물의 대사 활성을 이용하여 쉽고 저렴하게 제조될 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법에서 코리네박테리움 속을 사용함으로써, PAPS의 분해를 피하기 위해 복잡한 방식으로 유전자를 변형할 필요가 없다.
[도 1] 도 1은 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 염색체 상의 헤파로산 합성 유전자 클러스터의 개략도를 도시한다.
[도 2] 도 2는 헤파로산 생산에 관여하는 효소의 개략도를 도시한다.
[도 3] 도 3은 헤파로산 생합성 경로의 개략도를 도시한다.
[도 4] 도 4는 N-설포헤파로산의 2-O-황산화 반응 시험에서 반응 용액의 상청액에 함유된 PAPS 농도의 시간-의존적 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 5] 도 5는 N-설포헤파로산의 2-O-황산화 반응 시험에서 불포화 이당류 HPLC 분석에서의 델타-UA, 2S-GlcNS의 면적비의 시간-의존적 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 6] 도 6은 2-O-황산화 N-설포헤파로산의 6-O-황산화 반응 시험에서 반응 용액의 상청액에 함유된 PAPS 농도의 시간-의존적 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 7] 도 7은 2-O-황산화 N-설포헤파로산의의 6-O-황산화 반응 시험에서 불포화 이당류 HPLC 분석에서의 델타-UA, 2S-GlcN, 6S의 면적비의 시간-의존적 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 8] 도 8은 2-O-황산화된 N-설포헤파로산의 6-O-위치 및 3-O-위치 황산화 반응 시험에서 반응 용액의 상청액에 함유된 PAPS 농도의 시간-의존적 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 9] 도 9는 PAPS 생산 시험에서 반응 용액의 상청액에 함유된 PAPS 농도의 시간-의존적 변화를 나타내는 그래프이다.
<형질전환체>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법은 1) PAPS 공급/재생의 단계가 세균세포를 이용한 반응에 의해 수행됨을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에서, 바람직하게는, 2) C5-에피머화, 3) 2-O-황산화, 4) 6-O-황산화 및 5) 3-O-황산화의 단계 중 적어도 하나도 세균 세포를 이용한 반응에 의해 수행된다. 이하, 각 반응에 사용되는 형질전환체(a) 내지 (e)를 설명할 것이다.
<<형질전환체(a): PAPS의 공급/재생>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, PAPS의 공급/재생은 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물의 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물을 이용하여 수행된다.
코리네박테리움 속의 박테리아 종의 예는 코리네박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 크레나툼(Corynebacterium crenatum) 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)(코리네박테리움 이피션스(Corynebacterium efficiens)) 및 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)를 포함한다.
코리네박테리움 속의 균주의 예는 코리네박테리움 암모니아게네스(코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis)) ATCC 6871 및 ATCC 6872, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806, 코리네박테리움 알카놀리티쿰 ATCC 21511, 코리네박테리움 칼루나에 ATCC 15991, 코리네박테리움 크레나툼 AS1.542, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869 및 FERM BP-734, 코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965, 코리네박테리움 이피션스(코리네박테리움 써모아미노게네스) AJ12340 (FERM BP-1539), 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868, 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC 14020, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC 13826, ATCC 14067, 및 AJ12418(FERM BP-2205) 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC 13869를 포함한다.
코리네박테리움 속에 속하는 세균은 또한 종래에는 브레비박테리움 속으로 분류되었지만 현재는 코리네박테리움 속에 통합된 세균을 포함한다(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). 또한, 코리네박테리움 스테셔니스는 또한 종래에는 코리네박테리움 암모니아게네스로 분류되었으나 현재는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열 분석 등에 의해 코리네박테리움 스테셔니스로 재분류된 세균을 포함한다[Int. J Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)].
이들 균주는 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(주소: 미국 20852 메릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301, 사서함 1549, 버지니아주 20108 마나사스)으로부터 입수 가능하다. 즉, 각 균주마다 등록번호가 부여되고, 이 등록번호를 이용하여 균주를 취득할 수 있다(https://www.atcc.org/ 참조). 각 균주에 해당하는 등록 번호는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그에 설명되어 있다. 또한, 이들 균주는 예를 들어 각 균주가 기탁된 기탁기관으로부터 입수할 수 있다. 코리네박테리움 속의 세균은 야생형 균주, 이의 돌연변이 균주 또는 인공 재조합체일 수 있다.
본 발명에서, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자는 발현 가능한 방식으로 코리네박테리움 속의 세균에 도입된다.
ATP 설퍼릴라제는 하기 반응식에 의해 설페이트로부터 아데노신 5'-포스포설페이트(APS)를 생성한다.
[반응식 1]
Figure pct00001
(상기 식에서, ATP는 아데노신 5'-트리포스페이트를 나타낸다.)
ATP 설퍼릴라제의 일 양상은 MET3이다. ATP 설퍼릴라제의 기원은 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 쉬조사카로마이세스 폼베(Shizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 푸사리움 푸지쿠로이(Fusarium fujikuroi), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 또는 아시비아 고시피이(Ashbya gossypii)로부터 유래된 ATP 설퍼릴라제를 포함하며, 그 중에서도 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 ATP 설퍼릴라제가 바람직하다.
ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자의 예는 서열번호 22에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이의 예는 ATP 설퍼릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 22에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 특히 바람직하게는 98% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 및 ATP 설퍼릴라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 22에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 추가로 포함한다. 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 지칭한다. 이의 예는 보다 높은 수준에서 서로 동일한 DNA, 예를 들어 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 97% 이상 및 특히 바람직하게는 99% 이상 서로 동일한 DNA가 서로 혼성화하고 보다 낮은 수준에서 서로 동일한 DNA가 서로 혼성화하지 않는 조건; 또는 세척이 60℃, 1 x SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS, 및 보다 바람직하게는 68℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도 및 온도에서 1회, 바람직하게는 2 내지 3회 수행되는, 표준 서던 혼성화에서 세척을 위한 조건인 조건을 포함한다.
형질전환체에서의 ATP 설퍼릴라제 활성은 형질전환체의 세포 추출액에서 ATP 설퍼릴라제 활성 값의 증가에 의해 확인된다. ATP 설퍼릴라제 활성은 문헌[[Medina DC et al., Temperature effects on the allosteric transition of ATP sulfurylase from Penicillium chrysogenum. Arch. Biochem. Biophys. 1; 393 (1): 51-60 (2001)]에 설명된 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서 동일성에 관한 수치는 달리 특정되지 않는 한 당업자에게 알려진 상동성 검색 프로그램을 이용하여 계산된 수치일 수 있다. 뉴클레오티드 서열에 대한 수치의 예는 BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]의 디폴트 파라미터를 사용하여 계산된 수치를 포함하며, 아미노산 서열에 대한 수치의 예는 BLAST2[Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997), Genome Res., 7, 649 (1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL]의 디폴트 파라미터를 사용하여 계산된 수치를 포함한다.
APS 키나제는 하기 반응식에 따라 APS로부터 PAPS를 생성한다.
[반응식 2]
Figure pct00002
(상기 식에서, ADP는 아데노신 5'-디포스페이트를 나타낸다.)
APS 키나제의 일 양상은 MET14를 포함한다. APS 키나제의 유래는 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 사카로마이세스 세레비지애, 캔디다 알비칸스, 쉬조사카로마이세스 폼베, 야로위아 리폴리티카, 뉴로스포라 크라싸, 페니실리움 크리소게눔, 클루이베로마이세스 락티스, 푸사리움 푸지쿠로이, 아스퍼질러스 오리재 또는 아시비아 고시피이로부터 유래된 APS 키나제를 포함하며, 그 중에서도 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 APS 키나제가 바람직하다.
APS 키나제를 코딩하는 유전자의 예는 서열번호 23에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이의 예는 추가로 APS 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 23에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 특히 바람직하게는 98% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 및 APS 키나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 23에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 추가로 포함한다.
형질전환체에서 APS 키나제 활성은 형질전환체의 세포 추출액에서 APS 키나제 활성 값의 증가에 의해 확인된다. APS 키나제 활성은 문헌[Renosto F. et al., Adenosine 5'-phosphosulfate kinase from Penicillium chrysogenum. Purification and kinetic characterization. J. Biol. Chem. 259 (4): 2113-2123 (1984)]에 설명된 방법에 의해 확인될 수 있다.
ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 속의 세균 내로 도입하는 것은 상술한 DNA를 각각 숙주의 염색체에 혼입하거나 상술한 DNA를 숙주에서 증폭될 수 있는 적절한 플라스미드 벡터에 클로닝하고 벡터를 숙주 내로 도입함으로써 수행될 수 있다.
플라스미드 벡터는 코리네박테리움 속의 세균에서 자율 복제 기능을 제어하는 유전자를 갖는 한 임의의 플라스미드 벡터일 수 있다. 이의 구체적 예는 브레비박테리움 락토퍼멘툼 2256[JP-A-S58-67699], [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)], 및 [Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16: 265-267 (1985)]; pHM1519[Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903 (1984)] 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3058로부터 유래되는 pCRY30[Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57: 759-764 (1991)]; pCG4[JP-A-S57-183799] 및 [Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol., 159: 306-311 (1984)], pAG1, pAG3, pAG14 및 pAG50[JP-A-S62-166890], 및 코리네박테리움 글루타미쿰 T250으로부터 유래되는 pEK0, pEC5, 및 pEKEx1[Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102: 93-98 (1991)] 등을 포함한다.
프로모터는 숙주 또는 이종 프로모터로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 이의 예는 코리네박테리움 글루타미쿰 R로부터 유래되는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제 A 유전자(gapA)의 프로모터 PgapA, 말레이트 데하이드로게나제 유전자(mdh)의 프로모터 Pmdh, 락테이트 데하이드로게나제 A 유전자(ldhA)의 프로모터 PldhA 등을 포함한다.
터미네이터의 예는 에스케리키아 콜라이 rRNA 오페론의 rrnB T1T2 터미네이터, 에스케리키아 콜라이의 trpA 터미네이터, 브레비박테리움 락토퍼멘툼의 trp 터미네이터 등을 포함한다.
본 발명의 일 양상으로서, PAPS의 분해와 관련된 효소의 유전자 발현은 감쇠되지 않는다. PAPS의 분해와 관련된 효소의 유전자의 예는 cysQ 유전자 및 CP01850 유전자를 포함한다. 형질전환체(a)의 일 양상으로서, cysQ 유전자 및 CP01850 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현이 감쇠되지 않는다.
<<형질전환체(b): C5-에피머화>>
본 발명에 따른 황산화된 다당류의 제조 방법에서, N-설포헤파로산의 C5-에피머화는 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물을 사용하여 수행된다.
C5-에피머라제는 글루쿠론산(GlcUA) 잔기의 이두론산(IdoA) 잔기로의 이성질화를 촉매할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. C5-에피머라제는 동물, 식물, 미생물 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 C5-에피머라제가 C5-에피머라제로서 사용될 수 있다.
C5-에피머라제를 코딩하는 유전자의 예는 서열번호 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이의 예는 C5-에피머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 특히 바람직하게는 98% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA; 및 C5-에피머라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 24에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 추가로 포함한다.
형질전환체에서의 C5-에피머라제 활성은 형질전환체의 세포 추출액에서 C5-에피머라제 활성 값의 증가에 의해 확인된다. C5-에피머라제 활성은 문헌[Babu P. et al., A rapid, nonradioactive assay for measuring heparan sulfate C-5 epimerase activity using hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry. Methods. Mol. Biol. 1229: 209-219 (2015)]에 설명된 방법에 의해 측정될 수 있다.
이하, 설포트랜스퍼라제를 발현하는 형질전환체를 설명할 것이다. 본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, 황산화는 발현 가능한 방식으로 도입된 설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 처리물 또는 추출물을 사용하여 수행된다. 본 발명에서, 설포트랜스퍼라제는 설페이트 기를 다당류에 전이시켜 황산화된 다당류를 생성하는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 설포트랜스퍼라제의 예는 2-O-설포트랜스퍼라제(2-OST), 6-O-설포트랜스퍼라제(6-OST) 및 3-O-설포트랜스퍼라제(3-OST)를 포함한다.
<<형질전환체(c): 2-O-황산화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, 2-O-황산화는 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제(2-OST)를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 사용하여 수행된다.
2-OST는 O-2 위치에서 IdoA 잔기의 황산화를 촉매할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 또한, 2-OST는 동물, 식물, 미생물 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 햄스터로부터 유래된 2-OST가 2-OST로서 사용될 수 있다.
2-OST를 코딩하는 유전자의 예는 서열번호 19에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이의 예는 2-OST 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 19에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 특히 바람직하게는 98% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 및 2-OST 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 19에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 추가로 포함한다.
형질전환체에서의 2-OST 활성은 형질전환체의 세포 추출액에서 2-OST 활성 값의 증가에 의해 확인된다. 2-OST 활성은 문헌[Zhang J. et al., High cell density cultivation of recombinant Escherichia coli strains expressing 2-O-sulfotransferase and C5-epimerase for the production of bioengineered heparin. Appl. Biochem. Biotechnol. 175(6): 2986-2995 (2015)]에 설명된 방법에 의해 확인될 수 있다.
<형질전환체(d): 6-O-황산화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, 6-O-황산화는 발현 가능한 방식으로 도입된 6-O-설포트랜스퍼라제(6-OST)를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(d) 또는 형질전환체(d)의 처리물 또는 추출물을 사용하여 수행된다.
6-OST는 O-6 위치에서 N-황산화된 글루코사민(GlcNS) 잔기의 황산화를 촉매할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 6-OST는 동물, 식물, 미생물 등 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 6-OST의 예는 햄스터로부터 유래된 6-OST-1 및 마우스로부터 유래된 6-OST-3을 포함한다.
6-OST를 코딩하는 유전자의 예는 서열번호 25에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이의 예는 6-OST 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 22에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 특히 바람직하게는 98% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 및 6-OST 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 25에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 추가로 포함한다.
형질전환체에서의 6-OST 활성은 형질전환체의 세포 추출액에서 6-OST 활성 값의 증가에 의해 확인된다. 6-OST 활성은 문헌[Zhang J. et al., High cell density cultivation of a recombinant Escherichia coli strain expressing a 6-O-sulfotransferase for the production of bioengineered heparin. J. Appl. Microbiol. 118(1): 92-98 (2015)]에 설명된 방법에 의해 확인될 수 있다.
<<형질전환체(e): 3-O-황산화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, 3-O-황산화는 발현 가능한 방식으로 도입된 3-O-설포트랜스퍼라제(3-OST)를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(e) 또는 형질전환체(e)의 처리물 또는 추출물을 사용하여 수행된다.
3-OST는 O-3 위치에서 N-황산화/6-O-황산화된 글루코사민 잔기의 황산화를 촉매할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 3-OST는 동물, 식물, 미생물 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 마우스로부터 유래된 3-OST-1이 3-OST로서 사용될 수 있다.
3-OST를 코딩하는 유전자의 예는 서열번호 26에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이의 예는 3-OST 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 26에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상 및 특히 바람직하게는 98% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 및 3-OST 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 서열번호 26에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건 하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 추가로 포함한다.
형질전환체에서의 3-OST 활성은 형질전환체의 세포 추출액에서 3-OST 활성 값의 증가에 의해 확인된다. 3-OST 활성은 문헌[Jin W. et al., Increased soluble heterologous expression of a rat brain 3-O-sulfotransferase 1 - A key enzyme for heparin biosynthesis. Protein Expr. Purif. 151:23-29 (2018)]에 설명된 방법에 의해 확인될 수 있다.
<<원핵생물에 속하는 미생물>>
본 발명에서 형질전환체의 숙주로서 사용되는 원핵생물에 속하는 미생물은 본 발명의 소정의 유전자를 발현할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 에스케리키아 속, 세라티아(Serratia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 코리네박테리움 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 및 슈도모나스 속에 속하는 미생물과 같은 세균을 포함하고, 에스케리키아 속의 세균이 바람직하게 사용된다.
본 발명에서 사용하는 에스케리키아 속에 속하는 세균은 특별히 제한되지 않고, 이의 예는 미생물학의 전문가에게 알려진 분류에 의해 에스케리키아 속으로 분류된 세균을 포함한다. 에스케리키아 속에 속하는 세균의 예는 문헌[Backmann, BJ 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, DC]에 설명된 세균을 포함한다.
에스케리키아 속에 속하는 세균의 예는 에스케리키아 콜라이를 포함한다. 에스케리키아 콜라이의 예는 W3110 균주(ATCC 27325) 및 MG1655 균주(ATCC 47076)와 같은 에스케리키아 콜라이 K-12주; 에스케리키아 콜라이 K5 균주(ATCC 23506); BL21(DE3) 균주와 같은 에스케리키아 콜라이 B 균주; 에스케리키아 콜라이 니슬( Nissle) 1917 균주(DSM 6601); 및 이들의 유도체 균주를 포함한다.
이들 균주는 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(주소: 미국 메릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301, 사서함 1549, 버지니아주 20108 마나사스)으로부터 입수 가능하다. 즉, 각 균주마다 등록번호가 부여되고, 이 등록번호를 이용하여 균주를 취득할 수 있다(https://www.atcc.org/ 참조). 각 균주에 해당하는 등록 번호는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그에 설명되어 있다. 또한, BL21(DE3) 균주는 예를 들어 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(제품 번호 C6000-03)로부터 입수할 수 있다.
유전자를 발현 가능한 방식으로 도입할 목적으로, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환에 사용되는 벡터로서 숙주에서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 다중카피 벡터이다. 또한, 벡터는 형질전환체를 선택하기 위해 바람직하게는 문헌[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]에 설명된 항생제 내성 유전자 또는 다른 유전자와 같은 마커를 갖는다. 게다가, 벡터는 삽입된 유전자를 발현하기 위해 프로모터 또는 터미네이터를 가질 수 있다. 벡터의 예는 세균 플라스미드로부터 유래된 벡터, 효모 플라스미드로부터 유래된 벡터, 박테리오파지로부터 유래된 벡터, 코스미드, 파지미드 등을 포함한다.
에스케리키아 콜라이 속 세균에서 자가 복제할 수 있는 벡터의 구체적 예는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, 및 pSTV29(모두 Takara Bio Inc.로부터), pACYC184 및 pMW219(Nippon Gene), pTrc99A(Pharmacia), pPROK 벡터(Clontech), pKK233-2(Clontech), pET 벡터(Novagen), pQE 벡터(Qiagen) 및 넓은 숙주 범위 벡터 RSF1010을 포함한다.
프로모터는 숙주 또는 이종 프로모터로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 프로모터는 도입될 유전자의 내인성 프로모터 또는 다른 유전자의 프로모터일 수 있다.
터미네이터의 예는 T7 터미네이터, T4 터미네이터, fd 파지 터미네이터, tet 터미네이터 및 trpA 터미네이터를 포함한다.
상기 언급한 형질전환체(b) 내지 (e)에서, 원핵생물에 속하는 미생물에 도입된 유전자 중 2개 이상이 하나의 형질전환체에 도입될 수 있다. 보다 구체적으로, 예를 들어, C5-에피머라제를 코딩하는 유전자 및 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 원핵생물에 속하는 하나의 미생물에 도입하여 하나의 형질전환체를 형성할 수 있다.
<<형질전환체의 처리물>>
본 발명에서 형질전환체의 처리물은 그 안에서 세균 세포의 세포 원형질막이 투과성이 되는 물질을 지칭한다. 본 발명에서, 세포 원형질막이 물질-투과성이라 지칭될 때, 이는 다양한 작은(이온 등) 및 큰(단백질 등) 분자가 확산에 의해 세포 막을 투과함으로써 세포 막을 자유롭게 출입할 수 있음을 의미한다. 본 발명에서 형질전환체의 처리물은 바람직하게는 막 투과성을 부여하기 위한 처리로 인해 성장 능력을 상실한 휴지기 세균 세포이다.
형질전환체 처리물의 예는 형질전환체인 세균 세포의 계면활성제 처리물, 세균 세포의 용매 처리물, 세균 세포의 효소 처리물, 효소 공급원으로서 세균 세포의 배양물과 동일한 기능을 유지하는 살아있는 세균 세포를 함유하는 처리물, 예컨대 세균 세포의 고정된 생성물, 세균 세포의 초음파 처리물 및 세균 세포의 기계적으로 분쇄된 처리물을 포함한다.
세포 원형질막을 물질-투과성으로 만드는 방법의 예는 화학적 처리 및 기계적 처리를 포함한다. 본 발명의 제조 방법에서, 형질전환체의 세포 원형질막을 물질 투과성으로 만드는 시기는 본 발명의 효과가 나타나는 한 특별히 제한되지 않는다. 각 형질전환체의 세포 원형질막은 미리 물질-투과성으로 만들거나, 반응에 사용되는 형질전환체를 서로 접촉되게 하여 반응을 수행할 때 이루어질 수 있다.
화학 처리의 예는 계면 활성제를 사용하는 방법, 유기 용매를 사용하는 방법 및 효소를 사용하는 방법을 포함한다. 계면활성제로서, 단백질 등에 대한 작용이 (이온성 계면활성제에 비해) 더 약하기 때문에, 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 계면활성제의 예는 디지토닌, 사포닌, Triton X100, Triton X114, Tween 20, Tween 80, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드[BIGCHAP], N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필) 데옥시콜아미드[데옥시-BIGCHAP], NIKKOLBL-9EX[폴리옥시에틸렌(9)라우릴에테르], 옥타노일-N-메틸글루카미드[MEGA-8], 염화벤잘코늄 등을 포함한다.
유기 용매의 예는 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 기타 알코올 등을 포함한다. 효소의 예는 리소자임, 아크로모펩티다제 등을 포함한다.
상술한 물질로의 처리 농도, 온도, 시간 등과 같은 조건은 세포의 종류에 따라 다르며, 원하는 분석을 수행하기 위해서는 적절한 조건을 설정해야 하지만 일반적인 처리 농도는 2℃ 내지 37℃의 온도 및 1분 내지 30분의 시간에서 10 내지 1000 마이크로그램/ml 및 보다 일반적으로 20 내지 200 마이크로그램/ml이다.
기계적 처리의 예는 초음파 처리 및 기계적 연마 처리를 포함한다.
<<형질전환체의 추출물>>
본 발명에서 형질전환체의 추출물의 예는 형질전환체인 세균 세포로부터 수득한 조효소 추출물, 상기와 같이 처리된 세균 세포로부터 수득한 정제된 효소(예를 들어, 화학적 또는 기계적으로), 상술한 형질전환체 또는 이의 처리물을 배양하여 수득한 배양물의 농축물 및 배양물의 건조 생성물을 포함한다. 형질전환체 추출물의 예는 또한 배양물을 원심분리 또는 여과하여 수득한 세균 세포, 건조된 세균 세포 및 동결건조된 세균 세포를 포함한다.
<<형질전환 방법 및 형질전환체의 배양 방법>>
공지된 형질전환 방법이 제한 없이 사용될 수 있다. 이러한 공지된 방법의 예는 염화칼슘/염화루비듐 방법, 인산칼슘 방법, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 전기 펄스 방법 등을 포함한다. 그 중에서, 코리네형 세균에 대해서는 전기 펄스 방법이 적합하며, 전기 펄스 방법은 공지된 방법[Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)]에 의해 수행될 수 있다.
형질전환체는 각각의 반응 전에 미생물을 배양하기 위해 일반적으로 사용되는 배지를 사용하여 배양함으로써 성장시키는 것이 바람직하다. 배지로서, 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염류 및 기타 영양 물질을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다.
탄소 공급원은 ATP 공급원일 수 있다. 탄소 공급원의 예는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 만노스, 말토스, 만니톨, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 전분, 당밀, 소르비톨 및 글리세린과 같은 탄수화물 또는 당 알코올; 아세트산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 말레산 및 글루콘산과 같은 유기산; 에탄올 및 프로판올과 같은 알코올을 포함한다. 탄소 공급원으로서, 1종을 단독으로 사용할 수 있거나, 이의 2종 이상을 혼합할 수 있다. 일반적으로, 배지 중 이들 탄소 공급원의 농도가 약 0.1 내지 10(w/v%)이면 충분하다.
질소 공급원의 예는 염화암모늄, 황산암모늄, 암모늄 니트레이트 및 암모늄 아세테이트, 요소, 암모니아수, 나트륨 니트레이트, 칼륨 니트레이트 등과 같은 무기 또는 유기 암모늄 화합물을 포함한다. 또한, 옥수수 침지액, 육류 추출물, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산과 같은 질소-함유 유기 화합물 등을 사용하는 것도 가능하다. 질소 공급원으로서, 1종을 단독으로 사용할 수 있거나, 이의 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 배지 중의 질소 공급원의 농도는 사용되는 질소 화합물에 따라 다양하지만, 일반적으로 0.1 내지 10(w/v%)이다.
무기 염의 예는 황산마그네슘, 황산망간, 황산아연 및 황산코발트와 같은 황산 이온 공급원 이외에도, 제1인산칼륨, 제2인산칼륨, 질산제1철, 염화나트륨, 탄산칼슘 등을 포함한다. 무기염으로서, 1종을 단독으로 사용할 수 있거나, 이의 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 배지 중 무기 염의 농도는 사용되는 무기염에 따라 다양하지만, 일반적으로 약 0.01 내지 1(w/v%)이다.
영양 물질의 예는 육류 추출물, 펩톤, 폴리펩톤, 효모 추출물, 건조 효모, 옥수수 침지액, 탈지분유, 탈지 대두 염산염 가수분해물, 동물 및 식물 또는 미생물 세균 세포의 추출물 및 이들의 분해 생성물 등을 포함하며, 이의 농도는 일반적으로 약 0.1 내지 10(w/v%)이다. 또한, 필요한 경우 비타민이 첨가될 수 있다. 비타민의 예는 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 포함한다. 배지의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 8이다.
미생물을 위한 배양 배지의 바람직한 예는 A 배지를 포함한다[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)], BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)] 등을 포함한다. 구체적인 배양 조건으로서, 예를 들어 배양 온도는 약 15℃ 내지 45℃이고, 배양 시간은 약 1일 내지 7일이다.
<황산화된 다당류의 제조 방법>
본 발명에 따른 황산화된 다당류의 제조 방법의 일 양상은 황산화된 다당류의 제조 방법으로서, 형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이들의 처리물 또는 추출물로부터 선택된 적어도 하나를 ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명에 따른 황산화된 다당류의 제조 방법의 일 양상으로서, 이의 예는 황산화된 다당류의 제조 방법으로서, ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이들의 처리물 또는 추출물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 황산화된 다당류의 제조 방법의 일 양상은 황산화된 다당류의 제조 방법으로서, 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이들의 처리물 또는 추출물로부터 선택된 적어도 하나를 PAPS 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 포함하는 방법이다.
본 발명의 제조 방법에서, 각 형질전환체는 초기에 반응 용액에 첨가될 수 있거나, 순차적으로 첨가될 수 있거나, 초기에 그리고 순차적으로 첨가될 수 있다. 각 형질전환체를 초기에 반응 용액에 첨가하는 양상의 구체적 예는 형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이들의 처리물 또는 추출물을 ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 초기에 첨가함으로써 황산화된 다당류가 생성되는 양상을 포함한다.
형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 사용하는 본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, 1) 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 사용한 PAPS의 공급/재생, 2) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 사용한 C5-에피머화, 3) 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 사용한 2-O-황산화, 4) 형질전환체(d) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 사용한 6-O-황산화 및 5) 형질전환체(e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 사용한 3-O-황산화를 수행할 수 있다.
이하, 각각의 단계를 개별적으로 설명할 것이지만, 원하는 황산화된 다당류가 수득될 수 있는 한 2) C5-에피머화, 3) 2-O-황산화, 4) 6-O-황산화 및 5) 3-O-황산화의 순서는 특별히 제한되지 않는다.
또한, 이하, 1) PAPS의 공급/재생, 2) C5-에피머화, 3) 2-O-황산화, 4) 6-O-황산화 및 5) 3-O-황산화의 각 반응을 개별적으로 설명할 것이지만, 이들 반응 중 2가지 이상이 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 이들 반응은 형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이들의 처리물 또는 추출물을 모두 함유하는 반응 용액을 사용하여 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에 의해 제조되는 황산화된 다당류의 예는 헤파린을 포함한다.
<<PAPS의 공급/재생>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법은 하기 단계 (1-1) 및 (1-2)를 포함함을 특징으로 한다:
(1-1) 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물을 제조하는 단계; 및
(1-2) ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계.
형질전환체(a) 또는 이의 처리물에 의해 발현되는 ATP 설퍼릴라제 및 APS 키나제가 형질전환체(a) 또는 이의 처리물에서 ATP 또는 ATP 공급원 및 황산 이온 공급원과 반응하고 이를 통해 PAPS가 생산된다. PAPS는 황산화된 다당류 생산에서 설페이트 기의 공여체로서 기능을 한다. 또한, 형질전환체(a) 또는 이의 처리물에 의해 생산되는 PAPS가 황산화된 다당류의 제조 방법에 사용되고 이를 통해 PAP가 수득된다. 형질전환체(a) 또는 이의 처리물에 의해 이 PAP로부터 PAPS가 생산될 수 있다. 따라서, 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 반응 용액에 혼입함으로써 PAPS가 공급/재생될 수 있다.
<<C5-에피머화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법은 바람직하게는 하기 단계 (2-1) 및 (2-2)를 포함한다:
(2-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(2-2) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 C5-에피머화를 수행하는 단계.
단계 (2-2)에서, N-설포헤파로산의 C5-에피머화는 C5-에피머라제를 발현하는 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물에 의해 수행된다.
<<2-O-황산화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법은 바람직하게는 하기 단계 (3-1) 및 (3-2)를 포함한다:
(3-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(3-2) 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 2-O-황산화를 수행하는 단계.
단계 (3-2)에서, N-설포헤파로산의 2-O-황산화는 설페이트 기의 공여체로서 형질전환체(a) 또는 이의 처리물에 의해 생산된 PAPS를 사용하여 2-O-설포트랜스퍼라제를 발현하는 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물에 의해 수행된다.
단계 (2-2)에서 제조된 황산화된 다당류가 반응 용액에 존재하는 경우, 이 단계에서 제조된 황산화된 다당류의 2-O-황산화가 수행된다. 예를 들어, C5-에피머화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화를 갖는 N-설포헤파로산의 2-O-황산화가 수행된다.
상기 언급된 C5-에피머화 및 2-O-황산화는 동시에 수행될 수 있다. 즉, 본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법의 일 양상은 바람직하게는 하기 단계 (3'-1) 내지 (3'-3)을 포함한다:
(3'-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계;
(3'-2) 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(3'-3) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물, 및 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 C5-에피머화 및 2-O-황산화를 수행하는 단계.
<<6-O-황산화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법은 바람직하게는 하기 단계 (4-1) 및 (4-2)를 포함한다:
(4-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 6-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(d) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(4-2) 형질전환체(d) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 6-O-황산화를 수행하는 단계.
단계 (4-2)에서, N-설포헤파로산의 6-O-황산화는 설페이트 기의 공여체로서 형질전환체(a) 또는 이의 처리물에 의해 생산된 PAPS를 사용하여 6-O-설포트랜스퍼라제 또는 이의 처리물 또는 추출물을 발현하는 형질전환체(d) 또는 이의 처리물 또는 추출물에 의해 수행된다.
단계 (2-2), (3-2) 또는 (3'-3)에서 제조된 황산화된 다당류가 반응 용액에 존재하는 경우, 이 단계에서 제조된 황산화된 다당류의 6-O-황산화가 수행된다.
예를 들어, C5-에피머화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화를 갖는 N-설포헤파로산의 6-O-황산화가 수행된다. 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로손이 존재하는 경우, 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 6-O-황산화가 수행된다.
C5-에피머화 및 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화 및 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 6-O-황산화가 수행된다.
<<3-O-황산화>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법은 바람직하게는 하기 단계 (5-1) 및 (5-2)를 포함한다:
(5-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 3-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(e) 또는 형질전환체(e)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
(5-2) 형질전환체(e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 3-O-황산화를 수행하는 단계.
단계 (5-2)에서, N-설포헤파로산의 3-O-황산화는 설페이트 기의 공여체로서형질전환체(a) 또는 이의 처리물에 의해 생산된 PAPS를 사용하여 3-O-설포트랜스퍼라제를 발현하는 형질전환체(e) 또는 이의 처리물 또는 추출물에 의해 수행된다.
단계 (2-2), (3-2), (3'-3) 또는 (4-2)에서 제조된 황산화된 다당류가 반응 용액에 존재하는 경우, 이 단계에서 제조된 황산화된 다당류의 3-O-황산화가 수행된다.
예를 들어, C5-에피머화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다. 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다. 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다.
C5-에피머화 및 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화 및 2-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다. C5-에피머화 및 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화 및 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다. 2-O-황산화 및 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, 2-O-황산화 및 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다.
C5-에피머화, 2-O-황산화 및 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산이 존재하는 경우, C5-에피머화, 2-O-황산화 및 6-O-황산화를 갖는 N-설포헤파로산의 3-O-황산화가 수행된다.
<<반응 조건>>
상기 언급한 1) PAPS의 공급/재생, 2) C5-에피머화, 3) 2-O-황산화, 4) 6-O-황산화 및 5) 3-O-황산화의 반응 조건을 하기에서 설명할 것이다.
반응 용액의 pH는 바람직하게는 약 6 내지 8이다. 반응 동안, 암모니아 수용액, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액 등과 함께 반응 용액의 pH를 중성에 가깝게, 특히 약 7로 제어하기 위한 pH 제어제를 사용하여 반응을 수행하는 것이 바람직하다.
반응 동안의 반응 온도, 즉 형질전환체의 생존 온도는 바람직하게는 20℃ 내지 50℃ 및 보다 바람직하게는 25℃ 내지 47℃이다. 반응 시간은 바람직하게는 약 1 내지 7일 및 보다 바람직하게는 약 1 내지 3일이다. 배양은 회분식, 유가식 및 연속식 중 임의의 것일 수 있다. 그 중에서도 회분식이 바람직하다.
통기 조건 반응은 환원 조건 또는 미호기 조건 하에 수행될 수 있다. 환원 조건은 반응 용액의 산화-환원 전위로 정의된다. 반응 용액의 산화-환원 전위는 바람직하게는 약 -200mV 내지 -500mV 및 보다 바람직하게는 -250mV 내지 -500mV이다.
반응 용액의 환원 상태는 레자주린 지시제를 사용하여 용이하게 추정할 수 있고, 산화-환원 전위차계를 사용하여 정확하게 측정할 수 있다. 환원 조건 하에 반응 용액을 제조하는 방법으로서, 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
구체적으로, 반응 용액을 위한 수용액은 증류수 등을 열 처리 또는 감압 처리하여 용존 가스를 제거함으로써 환원 조건 하에 수득할 수 있다. 또한, 적절한 환원제(예를 들어, 티오글리콜산, 아스코르브산, 시스틴 하이드로클로라이드, 머캅토아세트산, 티올아세트산, 글루타티온, 황화나트륨 등)를 첨가하여 환원 조건 하에 반응 용액을 위한 수용액을 제조할 수 있다. 이들 방법의 적절한 조합도 환원 조건 하에 반응 용액을 위한 수용액을 제조하는 효과적인 방법이다.
반응 동안 환원 조건이 유지되는 경우, 반응 시스템의 외부로부터 산소의 혼합을 가능한 한 방지하는 것이 바람직하고, 이러한 방법의 구체적 예는 반응 시스템을 질소 가스 또는 이산화탄소 가스와 같은 불활성 가스로 봉입하는 방법을 포함한다.
반응 동안 미호기성 조건이 유지되는 경우, 반응은 통기 속도가 0.5 vvm 등의 값 또는 보다 낮은 값으로 설정되고 교반 속도가 500 rpm 등의 낮은 값 또는 보다 낮은 값으로 설정되는 조건 하에 수행될 수 있다. 일부 경우에, 반응은 반응 개시 후 적절한 시기에 통기가 중단되고 혐기성 상태의 정도가 100 rpm 이하의 교반 속도의 조건 하에 증가되는 상태와 조합하여 수행될 수 있다.
<<황산화된 다당류의 수집>>
황산화된 다당류는 상술한 바와 같이 배양함으로써 반응 용액에서 생산된다. 황산화된 다당류는 반응 용액을 회수함으로써 수집될 수 있고, 또한 황산화된 다당류는 공지된 방법에 의해 반응 용액으로부터 분리될 수 있다. 이러한 공지된 방법의 예는 증류법, 막 투과법, 유기 용매 추출법 등을 포함한다.
<<N-설포헤파로산의 제조>>
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에 사용되는 N-설포헤파로산은 헤파로산을 탈아세틸화, 해중합 및 N-황산화함으로써 수득된다. 헤파로산의 제조 및 헤파로산으로부터의 N-설포헤파로산 제조는 공지된 방법(예를 들어 WO2018/048973)에 의해 수행될 수 있다.
헤파로산의 제조 방법의 예는 하기 (a1)의 유전자 변형을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물을 배지에서 배양하여 배지에서 헤파로산을 제조하고 그 배지로부터 헤파로산을 수집하는 방법을 포함한다:
(a1) kpsS 유전자의 발현 수준을 증가시키는 유전자 변형.
원핵생물에 속하는 미생물은 (a1) 이외에도 하기 유전자 변형(a2) 및 (a3) 중 적어도 하나를 추가로 가질 수 있다:
(a2) kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 수준을 증가시키는 유전자 변형; 및
(a3) yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형.
kpsS 유전자는 영역 I, 영역 II 및 영역 III의 유전자 군 중 영역 I에 의해 코딩되는 유전자이다. kpsS는 헤파로산 합성의 개시에 관여한다. 헤파로산 생산에서, kpsS는, kpsC와 함께, 내막의 포스파티딜글리세롤에 다수의 Kdo 링커를 첨가하는 역할을 한다.
kpsS 유전자로서, 에스케리키아 속으로부터 유래된 kpsS 유전자가 바람직하다. 이의 구체적 예는 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kpsS 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kpsS 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 취득할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kpsS 유전자는 진뱅크(GenBank) 수탁번호 CAA52659.1로 등록되어 있다.
kpsS 유전자의 예는 서열번호 27에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 27에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에서 발현 수준이 증가될 때 미생물의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD는 영역 I, 영역 II 및 영역 III의 유전자 군 중 영역 II에 의해 코딩되는 유전자이다. 도 2에 도시된 바와 같이, kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD는 헤파로산 합성에 관여하며, 당류를 첨가하여 헤파로산을 합성하는 역할을 한다.
kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자로서, 에스케리키아 속으로부터 유래된 kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자가 바람직하다. 이의 구체적 예는 에스케리키아 콜라이 K5균주의 kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K5 균주의 kfiA, kfiB, kfiC 또는 kfiD 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. kfiA는 진뱅크 수탁번호 CAA54711.1로서 등록되어 있고; kfiB는 진뱅크 수탁번호 CAE55824.1로 등록되어 있고; kfiC는 진뱅크 수탁번호 CAA54709.1로 등록되어 있고; kfiD는 진뱅크 수탁번호 CAA54708.1로 등록되어 있다.
kfiA 유전자의 예는 서열번호 28에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 28에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에서 발현 수준이 증가될 때 미생물의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiB 유전자의 예는 서열번호 29에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 29에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에서 발현 수준이 증가될 때 미생물의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiC 유전자의 예는 서열번호 30에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 30에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에서 발현 수준이 증가될 때 미생물의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
kfiD 유전자의 예는 서열번호 31에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 31에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에서 발현 수준이 증가될 때 미생물의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
도 3은 헤파로산 생합성 경로의 개략도를 도시한다. GlmS는 헤파로산의 전구체인 UDP-N-아세틸글루코사민 공급 경로의 제1 효소이며 프럭토스-6-포스페이트에서 글루코사민-6-포스페이트로의 반응을 촉매하는 효소이다. YhbJ는 GlmS를 음성적으로 조절하는 효소이다.
yhbJ 유전자로서, 에스케리키아 속으로부터 유래된 yhbJ 유전자가 바람직하다. 이의 구체적 예는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 yhbJ 유전자를 포함한다. 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 yhbJ 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 취득할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 K-12 균주의 yhbJ 유전자는 진뱅크 수탁번호 BAE77249.1로 등록되어 있다.
yhbJ 유전자의 예는 서열번호 32에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 32에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에서 발현 수준이 증가될 때 미생물의 헤파로산 생산능을 증가시키는 특성을 갖는 DNA를 포함한다.
상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자는 예를 들어 상술한 각 유전자의 뉴클레오티드 서열을 사용하는 BLAST 검색 또는 FASTA 검색에 의해 공개 데이터베이스로부터 용이하게 취득할 수 있다. 또한, 예를 들어 주형으로서 세균과 같은 미생물의 염색체를 사용하고 프라이머로서 이들 공지된 유전자 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의해 각 유전자의 상동체를 수득할 수 있다.
상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자는, 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 본래 기능(예를 들어, 활성 또는 특성)이 유지되는 한, 유전자의 변이체일 수 있다. 유전자의 변이체에 의해 코딩된 단백질이 이의 본래 기능을 유지하는지 여부를 확인할 수 있다; 구체적으로, 예를 들어 본래 기능이 헤파로산 생산 능력을 향상시키는 것인 경우, 유전자의 변이체를 헤파로산 생산능을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에 도입함으로써 확인할 수 있다.
상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자의 변이체는 코딩된 단백질의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 첨가되도록 유전자의 코딩 영역을 변형시킴으로써 부위 지향적 돌연변이유발 방법에 따라 수득될 수 있다. 또한, 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자의 변이체는 예를 들어 돌연변이 처리에 의해서도 수득될 수 있다.
상기 유전자(a1) 내지 (a3) 각각은 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 하나 또는 수개의 위치에 있는 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 첨가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 코딩된 단백질에서 이의 N-말단 및/또는 C-말단은 연장되거나 단축될 수 있다. 어구 "하나 또는 수개"는 단백질의 3차원 구조에서 아미노산 잔기의 위치와 유형에 따라 상이하다. 이의 구체적 예는 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개를 포함하고, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 5개 및 특히 바람직하게는 1 내지 3개이다.
상술한 바와 같은 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가는 단백질의 기능이 정상적으로 유지시키는 보존적 돌연변이이다. 보존적 돌연변이의 대표는 보존적 치환이다. 보존적 치환은 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에 Phe, Trp, Tyr 사이에 치환이 발생하는 돌연변이이고, 치환 부위가 소수성 아미노인 경우에 Leu, Ile, Val 사이에 치환이 발생하는 돌연변이이고, 치환 부위가 극성 아미노산인 경우에 Gln 및 Asn 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 염기성 아미노산인 경우에 Lys, Arg 및 His 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 산성 아미노산인 경우에 Asp 및 Glu 사이에 치환이 발생하고, 치환 부위가 하이드록실 기를 갖는 아미노산인 경우에 Ser 및 Thr 사이에 치환이 발생한다. 보존적 치환으로 고려되는 치환의 특정 예는 Ala의 Ser 또는 Thr로의 치환; Arg의 Gln, His 또는 Lys로의 치환; Asn의 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환; Asp의 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환; Cys의 Ser 또는 Ala로의 치환; Gln의 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환; Glu의 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환; Gly의 Pro로의 치환; His의 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환; Ile의 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환; Leu의 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환; Lys의 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환; Met의 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환; Phe의 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환; Ser의 Thr 또는 Ala로의 치환; Thr의 Ser 또는 Ala로의 치환; Trp의 Phe 또는 Tyr로의 치환; Tyr의 His, Phe 또는 Trp로의 치환; 및 Val의 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 포함한다. 또한, 상술한 바와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가, 이의 역전 등은 유전자가 유래된 유기체에서의 개체 차이 또는 종 차이에 기초한 돌연변이와 같은 천연 발생 돌연변이에 의해 유발되는 치환, 결실, 삽입 및 첨가, 역전 등(돌연변이체 또는 변이체)을 포함한다.
또한, 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자는 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 전체 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 97% 이상 및 특히 바람직하게는 99% 이상 동일한 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자는 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부분에 상보적인 서열과 같은 공지된 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브와 엄격한 조건 하에 혼성화하는 DNA일 수 있다. 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 지칭한다. 이의 예는 보다 높은 수준에서 서로 동일한 DNA, 예를 들어 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 97% 이상 및 특히 바람직하게는 99% 이상 서로 동일한 DNA가 서로 혼성화하고 보다 낮은 수준에서 서로 동일한 DNA는 서로 혼성화하지 않는 조건; 또는 세척이 60℃, 1 x SSC 및 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS, 및 보다 바람직하게는 68℃, 0.1 x SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도 및 온도에서 1회, 바람직하게는 2 내지 3회 수행되는, 표준 서던 혼성화에서 세척을 위한 조건인 조건을 포함한다.
상기 혼성화에 사용되는 프로브는 각 유전자의 상보적 서열의 일부분일 수 있다. 이러한 프로브는 프라이머로서 공지된 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드를 사용하고 주형으로서 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자를 함유하는 DNA 단편을 사용하는 PCR에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 약 300bp 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용될 수 있다. 약 300bp 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 혼성화에서 세척을 위한 조건의 예는 50℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS의 조건을 포함한다.
또한, 코돈 축퇴성은 숙주에 따라 상이하기 때문에, 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자는 이들의 본래 기능이 유지되는 한, 임의의 코돈을 동등한 코돈으로 대체하여 수득한 유전자일 수 있다. 예를 들어, 표 1 내지 3의 유전자는 사용되는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적의 코돈을 갖도록 변형될 수 있다.
돌연변이 처리의 예는 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법; 상기 (a1) 내지 (a3)의 각 유전자를 보유하는 미생물을 X선, 자외선, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸 메탄설포네이트(EMS) 및 메틸 메탄설포네이트(MMS)와 같은 돌연변이원으로 처리하는 방법 등을 포함한다.
<<<유전자 발현을 증가시키기 위한 유전자 변형>>>
어구 "유전자 발현의 증가"는 유전자의 발현이 비변형 균주의 것과 비교하여 상승되는 것을 의미한다. 유전자의 발현을 증가시키는 일 양상의 예는 유전자의 발현이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가되고, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가되고, 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가되는 양상을 포함한다.
또한, 어구 "유전자 발현이 증가된다"는 표적 유전자가 본래 발현되는 균주에서의 표적 유전자의 발현 증가뿐만 아니라, 표적 유전자가 본래 발현되지 않는 균주에서 표적 유전자가 발현되는 것을 의미한다. 즉, 어구 "유전자 발현이 증가된다"는 예를 들어 표적 유전자를 갖지 않는 균주 내로 표적 유전자가 도입되고 그 안에서 표적 유전자가 발현되는 경우를 포함한다. 또한, 어구 "유전자 발현이 증가된다"는 어구 "유전자 발현이 향상된다" 또는 "유전자 발현이 상승된다"로도 지칭된다.
유전자 발현의 증가는 예를 들어 유전자의 카피 수를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 카피 수를 증가시키는 것은 유전자를 숙주의 염색체 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 염색체 내로의 유전자 도입은 예를 들어 상동 재조합을 사용하여 수행될 수 있다(Miller I, J.H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). 유전자의 하나의 카피만이 도입될 수 있거나, 이의 2개 이상의 카피가 도입될 수 있다.
예를 들어, 염색체 상에 다수의 카피를 갖는 서열을 표적화하면서 상동 재조합을 수행함으로써 유전자의 다수의 카피를 염색체 내로 도입할 수 있다. 염색체 상에 다수의 카피를 갖는 서열의 예는 반복 DNA 서열(반복 DNA) 및 트랜스포존의 양 말단에 존재하는 역 반복체를 포함한다.
대안적으로, 상동 재조합은 표적 물질의 생산에 불필요한 유전자와 같은 염색체 상의 적절한 서열을 표적화하면서 수행될 수 있다. 상동 재조합은 예를 들어 선형 DNA를 사용하는 방법, 감온성 복제 기점을 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달이 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터를 사용하는 방법 또는 파지를 사용한 형질도입 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유전자는 트랜스포존 또는 Mini-Mu를 사용하여 염색체 내로 무작위로 도입될 수도 있다(JP-A-H2-109985).
표적 유전자가 염색체 내로 도입되었는지 여부는 유전자의 전체 또는 일부분에 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용한 서던 혼성화, 유전자의 서열에 기초하여 제조된 프라이머를 사용한 PCR 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 유전자의 카피수는 유전자를 함유하는 벡터를 숙주 내로 도입함으로써 증가시킬 수도 있다. 예를 들어, 표적 유전자를 함유하는 DNA 단편을 숙주에서 기능하는 벡터에 라이게이션(ligating)하여 유전자에 대한 발현 벡터를 작제하고 숙주를 이 발현 벡터로 형질전환함으로써 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있다. 표적 유전자를 함유하는 DNA 단편은, 예를 들어 주형으로서 표적 유전자를 갖는 미생물의 게놈 DNA를 사용한 PCR에 의해 수득할 수 있다. 형질전환 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
벡터로서, 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 바람직하게는 다중카피 벡터이다. 또한, 형질전환체를 선택하기 위해 벡터는 바람직하게는 문헌[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]에 설명된 항생제 내성 유전자 또는 다른 유전자와 같은 마커를 갖는다. 또한, 벡터는 삽입된 유전자를 발현하기 위해 프로모터 또는 터미네이터를 가질 수 있다. 벡터의 예는 세균 플라스미드로부터 유래된 벡터, 효모 플라스미드로부터 유래된 벡터, 박테리오파지로부터 유래된 벡터, 코스미드, 파지미드 등을 포함한다.
에스케리키아 콜라이와 같은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)의 세균에서 자가 복제할 수 있는 벡터의 구체적 예는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322 및 pSTV29(모두 Takara Bio Inc.로부터), pACYC184 및 pMW219(Nippon Gene), pTrc99A(Pharmacia), pPROK 벡터(Clontech), pKK233-2(Clontech), pET 벡터(Novagen), pQE 벡터(Qiagen) 및 넓은 숙주 범위 벡터 RSF1010를 포함한다.
유전자를 도입하는 경우, 본 발명에서 유전자 변형을 갖는 원핵생물에 속하는 미생물에 유전자가 보유되면 충분하다. 구체적으로, 본 발명의 세균에서 기능하는 프로모터 서열의 제어 시 발현되도록 유전자가 도입되면 충분하다. 프로모터는 숙주로부터 유래된 프로모터 또는 이종 프로모터일 수 있다. 프로모터는 도입될 유전자의 내인성 프로모터 또는 다른 유전자의 프로모터일 수 있다. 프로모터로서, 예를 들어 후술하는 보다 강력 프로모터를 사용할 수 있다.
전사를 종결시키기 위한 터미네이터는 유전자의 하류에 배치될 수 있다. 터미네이터는 본 발명의 세균에서 기능하는 한 특별히 제한되지 않는다. 터미네이터는 숙주로부터 유래된 터미네이터 또는 이종 터미네이터일 수 있다. 터미네이터는 도입될 유전자에 특이적인 터미네이터일 수 있거나 다른 유전자의 터미네이터일 수 있다. 터미네이터의 구체적 예는 T7 터미네이터, T4 터미네이터, fd 파지 터미네이터, tet 터미네이터 및 trpA 터미네이터를 포함한다.
다양한 미생물에서 사용될 수 있는 벡터, 프로모터, 터미네이터는 예를 들어 문헌["Basic Lecture 8 on Microbiology, Gene Engineering, KYORITSU SHUPPAN, 1987"]에 상세히 설명되어 있으며, 이들을 사용할 수 있다.
또한, 2개 이상의 유전자가 도입된 경우, 각 유전자가 본 발명의 세균에서 발현 가능한 방식으로 유지되면 충분하다. 예를 들어, 각 유전자는 단일 발현 벡터에 모두 보유될 수 있거나 염색체 상에 모두 보유될 수 있다. 또한, 각 유전자는 복수의 발현 벡터 상에 개별적으로 보유될 수 있거나, 단일 또는 복수의 발현 벡터 및 염색체 상에 개별적으로 보유될 수 있다. 또한, 2개 이상의 유전자가 오페론을 형성하여 도입될 수 있다. "2개 이상의 유전자가 도입되는 경우"의 예는 2개 이상의 효소를 각각 코딩하는 유전자를 도입하는 경우, 단일 효소를 형성하는 2개 이상의 서브유닛을 각각 코딩하는 유전자를 도입하는 경우 및 이들의 조합을 포함한다.
도입될 유전자는 숙주에서 기능하는 단백질을 코딩하는 한 특별히 제한되지 않는다. 도입될 유전자는 숙주로부터 유래된 유전자 또는 이종 유전자일 수 있다. 도입될 유전자는 예를 들어 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머를 사용하고 주형으로서 유전자를 갖는 유기체의 게놈 DNA 또는 유전자를 보유하는 플라스미드 등을 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다. 또한, 도입될 유전자는 예를 들어 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 전체적으로 합성될 수 있다[Gene, 60(1), 115-127(1987)].
또한, 유전자의 전사 효율을 향상시킴으로써 유전자 발현의 증가가 달성될 수 있다. 유전자의 전사 효율을 개선하는 것은 예를 들어 염색체 상의 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 대체함으로써 달성될 수 있다. "강력한 프로모터"는 천연 발생 야생형 프로모터에 비해 유전자 전사를 향상시키는 프로모터를 지칭한다.
"강력한 프로모터"의 예는 uspA 프로모터, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, thr 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터, tet 프로모터, araBAD 프로모터, rpoH 프로모터, PR 프로모터 및 PL 프로모터와 같은 공지된 고발현 프로모터를 포함한다.
또한, 보다 강력한 프로모터로서, 종래의 고활성 유형의 프로모터를 다양한 리포터 유전자를 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 프로모터 영역의 -35 및 -10 영역을 컨센서스 서열(consensus sequence)에 더 가깝게 함으로써 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있다(WO2000/18935).
고활성 유형 프로모터의 예는 다양한 tac-유사 프로모터(Katashkina JI et al. 러시아 연방 특허출원 2006134574) 및 pnlp8 프로모터(국제 WO2010/027045)를 포함한다. 프로모터 강도를 평가하는 방법 및 강력한 프로모터의 예는 공지된 문헌[Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995) 등]에 설명되어 있다.
또한, 유전자 발현 수준의 증가는 유전자의 번역 효율을 향상시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 번역 효율의 개선은 예를 들어 염색체 상의 유전자의 샤인-달가노(Shine-Dalgarno: SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)로도 불림)을 보다 강력한 SD 서열로 대체함으로써 달성될 수 있다.
"보다 강력한 SD 서열"은 mRNA 번역이 천연 발생 야생형 SD 서열보다 개선된 SD 서열을 지칭한다. 보다 강력한 SD 서열의 예는 파지 T7의 유전자 10의 RBS를 포함한다[Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235]. 또한, RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역, 특히 개시 코돈(5'-UTR)의 바로 상류 서열에서의 수개 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실은 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 따라서 유전자의 번역 효율은 이들을 변형함으로써 향상될 수 있다.
본 발명에서, 프로모터, SD 서열 및 RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역과 같이 유전자의 발현에 영향을 미치는 부위는 "발현 제어 영역"으로도 총칭된다. 발현 제어 영역은 프로모터 검색 벡터 또는 GENETYX와 같은 유전자 검색 소프트웨어를 사용하여 결정될 수 있다. 이들 발현 제어 영역의 변형은 예를 들어 감온성 벡터를 사용한 방법 또는 Red 구동 통합(Red driven integration) 방법(WO2005/010175)에 의해 수행될 수 있다.
유전자 번역 효율의 개선은 또한, 예를 들어 코돈 변형에 의해 달성될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 유전자의 이종 발현이 수행되는 경우 등에서, 유전자의 번역 효율은 유전자에 존재하는 희귀 코돈을 보다 빈번하게 사용되는 동의 코돈(synonymous codon)으로 대체함으로써 개선될 수 있다.
코돈 치환은 예를 들어 표적 돌연변이를 DNA의 표적 부위 내로 도입하는 부위 지향적 돌연변이유발 방법에 의해 수행될 수 있다. 부위 지향적 돌연변이유발 방법의 예는 PCR을 이용한 방법[Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)] 및 파지를 이용한 방법[Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)]을 포함한다. 대안적으로, 코돈이 치환된 유전자 단편이 전체적으로 합성될 수도 있다. 다양한 유기체에서 코돈 사용 빈도는 "코돈 사용 데이터베이스" [http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)]에 설명되어 있다.
또한, 유전자의 발현은 유전자의 발현을 증가시키는 조절인자를 증폭시키거나 유전자의 발현을 감소시키는 조절인자를 결실 또는 약화시킴으로써 증가될 수도 있다. 상술한 바와 같은 유전자의 발현을 증가시키는 기술은 단독으로 사용될 수 있거나 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
유전자의 발현 증가는 예를 들어 유전자의 전사량 증가를 확인하거나 유전자로부터 발현되는 단백질 양의 증가를 확인함으로써 확인될 수 있다. 또한, 유전자의 발현 증가는 예를 들어 그 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성 증가를 확인함으로써 확인될 수 있다.
유전자 전사량의 증가를 확인하는 것은 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 야생 균주 또는 모 균주와 같은 비변형 균주와 비교함으로써 수행될 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법의 예는 노던 하이브리드화, RT-PCR 등[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001]을 포함한다. mRNA 양의 증가는 예를 들어 mRNA 양이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가 및 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가한 경우를 지칭한다.
단백질 양의 증가는 예를 들어 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 확인될 수 있다. 단백질 양의 증가는 예를 들어 단백질 양이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가 및 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가한 경우를 지칭한다.
단백질 활성의 증가는 예를 들어 단백질 활성을 측정함으로써 확인될 수 있다. 단백질 활성의 증가는 예를 들어 단백질 활성이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 1.5배 이상 증가, 보다 바람직하게는 2배 이상 증가 및 보다 더욱 바람직하게는 3배 이상 증가한 경우를 지칭한다.
상술한 유전자의 발현을 증가시키는 기술은 상기 유전자(a1) 및 (a2) 각각의 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 바람직하게는 kpsS 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 카피 수를 증가시키는 유전자 변형 중 적어도 하나이다. kpsFEDUCS 유전자는 헤파로산 생산 유전자 군으로서 존재하지만, 실시예에서 후술하는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 그 중에서도 kpsS 유전자만의 발현을 증가시킴으로써 헤파로산 생산을 특히 개선하는 효과가 수득된다는 것을 밝혀냈다. 따라서, kpsS 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형으로서, kpsS 유전자의 카피수를 증가시키는 유전자 변형이 특히 바람직하다.
kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 바람직하게는 kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 발현 제어 영역의 변형 및 유전자의 카피 수 증가 중 적어도 하나이다. 도 1에 도시된 바와 같이, kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자는 오페론을 구성한다. kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자로 구성된 전체 오페론을 향상시키는 유전자 변형이 바람직하고, kfiA, kfiB, kfiC 및 kfiD 유전자의 발현 제어 영역의 변형이 보다 바람직하다.
<<<유전자 기능 상실을 유발하는 유전자 변형>>>
상기 (a3)의 yhbJ 유전자의 기능 상실을 유발하는 유전자 변형의 예는 yhbJ에 상응하는 부분에 의해 코딩되는 단백질의 기능이 숙주로서 원핵생물에 속하는 미생물의 게놈 DNA 내의 yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA를 변형시킴으로써 감소되거나 완전히 정지되는 유전자 변형을 포함한다.
본 발명의 방법에서, yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA에 첨가되는 변형의 형태는 yhbJ에 상응하는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능이 감소되거나 완전히 정지되는 한 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법이 적절히 사용될 수 있다.
yhbJ에 상응하는 부분에 의해 코딩되는 단백질의 기능을 감소시키거나 완전히 정지시키는 형태의 예는 하기 변형 (I) 내지 (III) 중 어느 하나를 포함한다:
(I) yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA의 전부 또는 일부분이 제거된다.
(II) 하나 또는 수개의 치환, 결실 또는 첨가가 yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA에 대해 이루어진다.
(III) yhbJ에 상응하는 부분을 코딩하는 DNA가 변형 전에 DNA 서열과 80% 미만 동일한 DNA 서열로 대체된다.
yhbJ 유전자의 기능 상실의 예는 yhbJ 유전자의 활성이 비변형 균주의 것에 비해 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하 및 보다 더욱 바람직하게는 5% 이하인 경우를 포함한다. yhbJ의 활성은 노던 블로팅 방법, 웨스턴 블로팅 방법 등에 의해 glmS의 발현 수준을 조사함으로써 확인될 수 있다[Kalamorz F. et al, (2007) "Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli." Mol Microbiol. 65 (6):1518-33].
본 발명의 황산화된 다당류의 제조 방법에서, 반응 용액의 경우에, 헤파로산을 공지된 방법에 의해 화학적으로 변형시켜 수득되는 N-설포헤파로산을 사용할 수 있으며, 여기서 헤파로산은 상술한 헤파로산 제조 방법에 의해 수득된다.
<PAPS의 제조 방법>
본 발명의 PAPS의 제조 방법은 PAPS 제조 반응이 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 상술한 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 반응 용액에 혼입하여 수행됨을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 PAPS 제조 방법은 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함한다:
(i) 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체로서, 상기 형질전환체의 세포 원형질막이 물질-투과성인 형질전환체 또는 이의 처리물을 생성하는 단계; 및
(ii) ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 상기 단계 (i)에서 제조된 형질전환체 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계.
본 발명의 PAPS의 제조 방법에 따르면, PAPS는 ATP 설퍼릴라제 및 APS 키나제를 발현하는 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체 또는 이의 처리물을 사용하여 세균 세포 반응에 의해 제조될 수 있다.
실시예
하기에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 다음의 실시예로 제한되지 않는다.
실시예 1
코리네박테리움 암모니아게네스 DE3 플라스미드의 작제
코리네박테리움 암모니아게네스 야생 균주 ATCC 6872의 염색체 상의 gltD-purT 사이에 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 함유하는 람다 DE3을 삽입하기 위한 플라스미드를 다음과 같이 작제하였다. gltD 측면을 증폭시키기 위한 2종의 프라이머[gltD-purT_1(서열번호 1) 및 gltD-purT_2BX(서열번호 2)] 및 purT 측면을 증폭시키기 위한 2종의 프라이머[gltD-purT_3BX](서열번호 3) 및 gltD-purT_4(서열번호 4)]를 설계하였다.
이때, 1차 PCR에서 증폭된 gltD 플랭킹 단편과 purT 플랭킹 단편을 연결하기 위한 2차 PCR(융합 PCR)을 수행하기 위해, purT 플랭킹 단편을 증폭시키기 위한 5' 프라이머(gltD-purT_4; 서열번호 4)의 3' 측면의 약 25개 염기의 서열에 상보적인 서열을 gltD 플랭킹 단편을 증폭시키기 위한 3' 프라이머(gltD-purT_2BX; 서열번호 2)의 5' 측면에 첨가하였다. 또한, In-Fusion 클로닝을 위한 서열을 gltD 플랭킹 단편을 증폭시키기 위한 5' 프라이머(gltD-purT_1)와 purT 플랭킹 단편을 증폭시키기 위한 3' 프라이머(gltD-purT_4)의 5' 측면에 첨가하였다. 추가로, BglII 및 XhoI 인식 서열을 gltD 측면 및 purT 측면의 선호하는 부분에 첨가하여 람다 DE3을 삽입하였다.
코리네박테리움 암모니아게네스의 야생형 균주인 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 균주(이하, ATCC 6872로 지칭함)의 염색체 DNA를 사이토(Saito) 등[Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963)]의 방법에 따라 생성하였다.
주형으로서 염색체 DNA를 사용하여, gltD 플랭킹 단편 및 purT 플랭킹 단편을 증폭시키기 위한 1차 PCR을 수행하고, 이를 통해 gltD 플랭킹 상의 약 0.8kb의 DNA 단편 및 purT 플랭킹 상의 약 0.8kb의 DNA 단편을 수득하였다. 다음으로, 2차 PCR을 수행하여 이들 gltD 플랭킹 단편과 purT 플랭킹 단편을 연결하고, 이를 통해 약 1.6kb의 DNA 단편(gltD-BX-purT)을 수득하였다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 레반수크라제 유전자 sacB를 함유하는 2.6kb의 PstI DNA 단편[Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)]이 카나마이신 내성 유전자를 갖는 에스케리키아 콜라이의 벡터 pHSG299의 PstI 절단 부위[Gene, 61, 63, (1987)]에 함유되어 있는 플라스미드 pESB30을 BamHI로 절단하였다. 그 후, 상기에서 수득된 gltD-BX-purT 단편을 In-Fusion 클로닝 키트(Takara Bio Inc.)를 사용하여 연결하였다. 반응 생성물을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 DH5알파[TOYOBO CO., LTD. 제조]를 통상적인 방법[Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 따라 형질전환시켰다.
수득된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지[ 물 1 L 중에 박토트립톤(Difco 제조) 10 g, 효모 추출물(Difco 제조) 5 g, 염화나트륨 10 g 및 박토 한천(Difco 제조) 16 g을 함유하고 이의 pH가 pH 7.0으로 조정된 배지]에서 배양하고 형질전환된 균주를 선택하였다. 표적 클론을 콜로니 PCR에 의해 선택한 후, 형질전환된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 배지(한천이 함유되지 않은 것 제외하고는 LB 한천 배지와 동일한 조성을 갖는 배지)에 접종하고, 밤새 배양하고, 이를 통해 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 수득된 배양 브로쓰로부터 플라스미드를 제조하였다. 뉴클레오티드 서열 분석은 상기 플라스미드가 약 1.6kb의 gltD-BX-purT 단편이 pESB30에 삽입된 구조를 가짐을 확인시켜 주었다.
후속적으로, 주형으로서 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3)로부터 추출된 염색체 DNA를 사용하고 DE3-for_Xho(서열번호 5)와 DE3-rev_Bgl(서열번호 6)의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. XhoI 인식 서열을 DE3-for_Xho에 첨가하고 BglII 인식 서열을 DE3-rev_Bgl에 첨가하였다. 이 단편과, 약 1.6kb의 gltD-BX-purT 단편이 pESB30에 삽입된 구조를 갖는 플라스미드를 XhoI 및 BglII로 절단한 다음, DNA 라이게이션 키트(Takara Bio Inc.)로 연결시켰다.
에스케리키아 콜라이 DH5 알파를 상술한 바와 같은 동일한 방법으로 형질전환시키고, 이렇게 수득된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 배양하고 형질전환된 균주를 선택하였다. 형질전환된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을을 함유하는 LB 배지에 접종하고 밤새 배양하고, 이를 통해 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 수득된 배양 브로쓰로부터 플라스미드를 제조하였다. 뉴클레오티드 서열 분석은 상기 플라스미드가 4.5kb의 람다 DE3 단편이 pESB30 상의 약 1.6kb의 gltD-purT 사이에 삽입된 구조를 가짐을 확인시켜 주었다. 상기 플라스미드를 pC-DE3으로 지정하였다.
실시예 2
코리네박테리움 암모니아게네스의 람다 DE3-삽입된 균주의 작제
PC-DE3는 레스트(Rest) 등의 방법[Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)]에 따라 전기천공법에 의해 ATCC 6872 균주 내로 도입하고, 카나마이신 내성 균주를 선택하였다. 카나마이신 내성 균주의 것으로부터 수득된 염색체의 구조를 서던 혼성화[Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 의해 조사하였을 때, pC-DE3가 캠벨(Campbell)형 상동 재조합에 의해 염색체에 통합되었다는 것이 확인되었다.
형질전환된 균주(단일 재조합체)를 Suc 한천 배지[물 1 L 중에 수크로스 100 g, 육류 추출물 7 g, 펩톤 10g, 염화나트륨 3 g, 효모 추출물(Difco 제조) 5 g 및 박토 한천(Difco 제조) 15 g을 함유하고 이의 pH가 pH 7.2로 조정된 배지]에 적용하고 30℃에서 1일 동안 배양하고, 성장하는 콜로니를 선택하였다. sacB 유전자가 존재한 균주는 수크로스를 자살 기질로 전환시키기 때문에 이 배지에서 성장할 수 없었다[J. Bacteriol., 174, 5462(1991)]. 반면에, 염색체 근처에 존재하는 람다 DE3-삽입 유형과 야생형 사이의 2차 상동 재조합에 의해 sacB 유전자가 결실된 균주는 자살 기질을 생성하지 않으면서 이 배지에서 성장할 수 있었다. 이러한 상동 재조합 동안, 람다 DE3 단편이 gltD-purT 사이에 삽입된 균주 또는 야생형 구조는 acB와 함께 탈락되었다. 이때, 야생형 구조가 sacB와 함께 탈락한 균주에서, 람다 DE3-삽입 유형으로의 유전자 대체가 발생하였다.
ATCC 6872의 gltD-purT 사이에 람다 DE3이 삽입된 균주를 DE3-for_Xho 및 DE3-rev_Bgl의 프라이머로 수득된 제2 재조합체를 사용하여 콜로니 PCR에 의해 수득하였다. 상기 균주를 ATCC 6872(DE3)로 지정하였다.
실시예 3
MET3-MET14A를 발현하기 위한 DNA 단편을 갖는 플라스미드의 작제
플라스미드 pCS299P[Appl. Microbiol. Biotech., 63, 592 (2004)]를 BamHI로 분해하였다. pCET_Fw2(서열번호 7) 및 pCET_Rv2(서열번호 8)와 주형으로서 pET21b를 사용하여 PCR을 수행하여 lacI-PT7을 함유하는 DNA 단편을 수득하였다. 이들을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)로 정제하고 In-Fusion 클로닝 키트(Takara Bio Inc.)를 사용하여 연결하였다. 반응 생성물을 이용하여, 에스케리키아 콜라이 DH5 알파(TOYOBO CO., LTD. 제조)를 통상적인 방법에 따라 형질전환시키고, 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 배양하고, 형질전환된 균주를 선택하였다. 표적 클론을 콜로니 PCR에 의해 선별한 후, 형질전환된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 접종하고 밤새 배양하고, 이를 통해 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 수득된 배양 브로쓰로부터 플라스미드를 제조하였다. 뉴클레오티드 서열 분석은 상기 플라스미드가 pET21b로부터 유래된 약 1.9kb의 lacI-PT7 DNA 단편이 pCS299P에 삽입된 구조를 갖는 플라스미드였음을 확인시켜 주었다. 상기 플라스미드를 pCET212로 지정하였다.
후속적으로, 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 MET3 및 MET14가 pCET212의 T7 프로모터의 하류에 삽입된 플라스미드를 작제하였다. 사카로마이세스 세레비지애 S288C 균주(이하 S288C로 지칭)의 염색체 DNA로부터 MET3를 증폭시키기 위한 2종의 프라이머(MET3_1(서열번호 9) 및 MET3_2(서열번호 10)) 및 MET14를 증폭시키기 위한 2종의 프라이머(MET14_3(서열번호 11) 및 MET14_4(서열번호 12))를 설계하였다.
이때, 1차 PCR에서 증폭된 MET3 단편과 MET14 단편을 연결하는 2차 PCR(융합 PCR)을 수행하기 위해, MET14를 증폭시키기 위한 5' 프라이머(MET14_3; 서열번호 11)의 5' 측면 상의 약 15개 염기의 서열에 상보적인 서열을 MET3을 증폭시키기 위한 3' 프라이머(MET3_2; 서열번호 10)의 5' 측면에 첨가하고, MET3_3의 5' 측면 상의 약 15개 염기의 서열에 상보적인 서열을 MET14_3의 5' 측면에 첨가하였다. 또한, In-Fusion 클로닝을 위한 서열을 MET3을 증폭시키기 위한 5' 프라이머(MET3_1) 및 MET13을 증폭시키기 위한 3' 프라이머(MET14_4)의 5' 측면에 첨가하였다. 주형으로서 S288C 균주의 염색체 DNA를 사용하여, MET3 및 MET14를 증폭시키기 위한 1차 PCR을 수행하고, 이를 통해 MET3의 DNA 단편 약 1.5kb 및 하류 영역의 DNA 단편 약 0.6kb을 수득하였다. 다음으로, 2차 PCR을 수행하여 이들 MET3 단편과 MET14 단편을 연결하고, 이를 통해 약 2.1kb의 DNA 단편(MET3-MET14)을 수득하였다. 상기 DNA 단편을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제한 다음, In-Fusion 클로닝 키트(Takara Bio Inc.)를 사용하여 NdeI 및 XhoI로 분해된 pCET212에 연결하였다. 반응 생성물을 사용하여, 에스케리키아 콜라이 DH5α(TOYOBO CO., LTD. 제조)를 통상적인 방법에 따라 형질전환시켰다. 이렇게 수득된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 배양하고 형질전환된 균주를 선택하였다. 표적 클론을 PCR에 의해 선택한 후, 형질전환된 균주를 20 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 접종하고 밤새 배양하고, 이를 통해 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 수득된 배양 브로쓰로부터 플라스미드를 제조하였다. 뉴클레오티드 서열 분석은 플라스미드가 약 2.1kb의 MET3-MET14 단편이 pCET212에 삽입된 구조를 가짐을 확인시켜 주었다. 상기 플라스미드를 pSC-3-13으로 지정하였다. pSC-3-13을 ATCC 6872(DE3)로 형질전환시켜, 코리네박테리움 암모니아게네스의 PAPS-생산 ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13 균주를 수득하였다.
실시예 4
샤페론 단백질을 발현하기 위한 DNA 단편을 갖는 플라스미드의 작제
Gro_F(서열번호 13) 및 Gro_R(서열번호 14)을 사용하고 주형으로서 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3) 균주의 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 GroES-GroEL을 함유하는 DNA 단편을 수득하였다. 다음으로, 주형으로서 pKD46[[Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645 (2000)]을 사용하고 AraC_ParaB_F(서열번호 15) 및 AraC_ParaB_R(서열번호 16)을 사용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 AraC_ParaB를 함유하는 DNA 단편을 수득하였다. pCDF-SmOri-F(서열번호 17) 및 pCDF-SmOri-R(서열번호 18)을 사용하고 주형으로서 pCDF-Duet1(Novagen)을 사용하여 PCR을 수행하고, 이를 통해 스트렙토마이신 내성 유전자 및 ColdDF 복제 기점을 함유하는 DNA 단편을 수득하였다. 이들을 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)에 의해 정제하고 In-Fusion 클로닝 키트(Takara Bio Inc.)를 사용하여 연결하였다. 반응 생성물을 사용하여, 통상적인 방법에 따라 에스케리키아 콜라이 DH5 알파(TOYOBO CO., LTD. 제조)를 형질전환시키고, 50 마이크로그램/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 배양하고, 형질전환된 균주를 선택하였다. 표적 클론을 콜로니 PCR에 의해 선택한 후, 형질전환된 균주를 50 마이크로그램/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 배지에 접종하고 밤새 배양하고, 이를 통해 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 수득된 배양 브로쓰로부터 플라스미드를 제조하였다. 뉴클레오티드 서열 분석은 상기 플라스미드가 pKD46으로부터 유래된 AraC-ParaB DNA 단편 약 1.2kb 및 BL21(DE3)로부터 유래된 GroES-GroEL DNA 단편 약 2.0kb가 pCDF-Duet1에 삽입된 구조를 가짐을 확인시켜 주었다. 상기 플라스미드를 pGro(Sm)로 지정하였다.
실시예 5
C5-에피머라제, 2OST, 6OST-3 및 3OST-1을 발현하는 에스케리키아 콜라이의 작제
인간 C5-에피머라제(E53-N609)의 촉매 도메인 영역을 문헌[Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 339, Issue 2, 13 January 2006, pages 597-602]에 설명된 방법에 따라 pMAL-C2X 벡터(New England Biolabs)에 클로닝하여 MBP-C5를 작제하였다. MBP-C5를 pGro7(Takara Bio Inc.)과 함께 Origami-B(DE3)(Novagen)로 형질전환시키고 이를 통해 C5-에피머라제를 발현하는 에스케리키아 콜라이의 Origami-B(DE3)/MBP-C5_pGro7 균주를 작제하였다.
서열번호 19는 차이니즈 햄스터로부터 유래되고 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 2-O-설포트랜스퍼라제 이소형 1의 촉매 도메인(R51-N356)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 주형으로서 상술한 바와 같이 인공적으로 합성된 서열 및 서열번호 20 및 21의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 PCR 단편을 라이게이션 독립적 클로닝(Ligation Independent cloning) 방법[Methods Mol Biol. 2009; 498: 105-115]에 의해 pET-His6-MBP-TEV-LIC(Addgene)에 클로닝하여 H-MBP-2OST를 작제하였다. H-MBP-2OST를 pGro(Sm)와 함께 Origami-B(DE3)(Novagen)로 형질전환시키고, 이를 통해 2OST를 발현하는 에스케리키아 콜라이의 Origami-B(DE3)/H-MBP-2OST_pGro(Sm) 균주를 작제하였다.
마우스로부터 유래된 6-O-설포트랜스퍼라제 이소형 3의 촉매 도메인(P120-L424)을 문헌[Chemistry & Biology Volume 14, Issue 9, 21 September 2007, pages 986-993]에 설명된 방법에 의해 pMAL-C2X 벡터(New England Biolabs)에 클로닝하여 MBP-6OST3을 작제하였다. MBP-6OST3를 pGro7(Takara Bio Inc.)과 함께 Origami-B(DE3)(Novagen)로 형질전환시키고, 이를 통해 6OST-3을 발현하는 에스케리키아 콜라이의 Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7 균주를 작제하였다.
마우스로부터 유래된 3-O 설포트랜스퍼라제의 촉매 도메인(G48-H311)을 문헌[J Biol Chem. 2004 Jun 11; 279 (24): 25789-97]에 설명된 방법에 의해 pET28a 벡터(Novagen)에 클로닝하여 HIS-3OST1을 작제하였다. HIS-3OST1을 pGro(Sm)와 함께 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Agilent Technologies)로 형질전환시키고, 이를 통해 3OST1을 발현하는 에스케리키아 콜라이의 RIL/HIS-3OST1_pGro(Sm) 균주를 작제하였다.
실시예 6
N-설포헤파로산 및 2-O-황산화된 N-설포헤파로산의 제조
특허문헌[WO2018/048973 A1]에 설명된 방법에 따라 에스케리키아 콜라이 K5 균주 또는 니슬 균주를 이용하여 발효시킴으로써 헤파로산을 제조하였다. 상기 문헌에 따라, 수득된 헤파로산을 화학적으로 탈아세틸화 및 해중합한 다음, 화학적으로 N-황산화하였다. 그 후, 에탄올 침전에 의해 분별하여 N-설포헤파로산을 수득하였다. 수득된 N-설포헤파로산을 동일한 문헌에 따라 효소 반응에 의해 우론산 잔기의 C5 위치의 에피머화 및 2-O 위치의 황산화를 거친 다음, 에탄올 침전에 의해 분별하고 이를 통해 2-O-황산화된 N-설포헤파로산을 수득하였다.
실시예 7
ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13의 배양
실시예 3에서 수득된 ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13 균주를 50 마이크로그램/ml의 카나마이신을 함유하는 BY-글루코스 한천 배지[물 1 L 중에 글루코스 10 g, 통상의 부용 배지(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd. 제조) 20 g, 효모 추출물(Difco 제조) 5 g 및 박토 한천(Difco 제조) 20 g을 함유하는 배지]에 접종하고 30℃에서 밤새 배양하였다.
2개 플레이트의 세균 세포를 2 L 에를렌마이어 플라스크 내의 350 ml의 1차 종균 배지[글루코스 50g/L, 하이 폴리펩톤(High Polypeptone)(Nihon Pharmaceutical Co., Ltd. 제조) 10g/L, 효모 추출물(Asahi) 10g/L, KH2PO4 1g/L, K2HPO4 1g/L, (NH4)2SO4 0.5g/L, 요소 0.5g/L, L-시스틴 0.03g/L, MgSO4-7H2O 1g/L, CaCl2-2H2O 0.1g/L, ZnSO4-7H2O 0.01g/L, FeSO4-7H2O 0.01g/L, MnSO4-5H2O 0.02g/L, D-칼슘 판토테네이트 0.01 g/L, 비오틴 40마이크로그램/L, 티아민 하이드로클로라이드 0.005 g/L 및 니코틴산 0.005g/L을 함유하고 이의 pH가 수산화나트륨에 의해 pH 7.2로 조정되고, 오토클레이브를 이용하여 122℃에서 20분 동안 멸균한 후 L-시스테인 0.1 g/L, 티오황산나트륨 1 g/L 및 카나마이신 0.1 g/L이 개별적으로 첨가된 배지]에 접종하고 30℃에서 220 rpm의 교반 속도로 24시간 동안 배양하였다.
6 L 배양조 내의 1700 ml의 2차 종균 배지[글루코스 100g/L, 프럭토스 4g/L, 효모 추출물(Asahi 제조) 10g/L, KH2PO4 1.25g/L, K2HPO4 1g/L, 글루탐산나트륨 일수화물 2.1 g/L, L-시스틴 0.02 g/L, MgSO4-7H2O 1.25g/L, CaCl2-2H2O 0.1g/L, CuSO4-5H2O 0.002g/L, ZnSO4-7H2O 0.01g/L, FeSO4-7H2O 0.02g/L, MnSO4-5H2O 0.02g/L, D-칼슘 판토테네이트 0.015 g/L, 비오틴 40 마이크로그램/L, 니코틴산 0.005 g/L 및 ADEKA NOL LG-109(ADEKA 제조) 1 ml/L를 함유하고 이의 pH가 수산화나트륨에 의해 pH 7.2로 조정되고, 개별적으로 요소를 3.2g/L로 첨가한 후 122℃의 오토클레이브에서 20분간 멸균되고, 티아민 하이드로클로라이드 0.1g/L, L-시스테인 0.3g/L, 티오황산나트륨 2.5g/L 및 카나마이신 0.2g/L가 개별적으로 첨가된 배지]에 300 ml의 상기 배양액을 접종하고, 18% 암모니아수로 이의 pH를 6.8로 조정하면서 30℃, 650 rpm의 교반 속도 및 2 L/분의 통기 속도의 배양 조건 하에 24시간 동안 배양하였다.
6 L 배양조 내의 1700 ml의 주 배양 배지[KH2PO4 10g/L, K2HPO4 10g/L, 글루탐산나트륨 일수화물 1g/L, L-시스틴 0.02g/L, CaCl2-2H2O 0.1g/L, CuSO4-5H2O 0.005g/L, ZnSO4-7H2O 0.01g/L, FeSO4-7H2O 0.02g/L, 비오틴 150 마이크로그램/L, 니코틴산 0.005 g/L, 요소 2 g/L 및 ADEKA NOL LG-109 (ADEKA 제조) 1 ml/L를 함유하고, 오토클레이브에서 122℃에서 20분 동안 멸균한 후, 글루코스 125g/L, 프럭토스 25g/L, MgSO4-7H2O 10g/L, MnSO4-5H2O 0.02g/L, D-칼슘 판토테네이트 0.015 g/L, 티아민 하이드로클로라이드 0.005 g/L, L-시스테인 0.15 g/L, 티오황산나트륨 2.5 g/L 및 카나마이신 0.2 g/L이 개별적으로 첨가된 배지]에 300 ml의 상기 배양액을 접종하고, 용존 산소 양이 1ppm 이하로 저하되지 않도록 교반 속도를 650 rpm 내지 900 rpm로 조절하고 18% 암모니아수로 이의 pH를 6.8로 조정하면서 30℃ 및 2 L/분의 통기 속도의 배양 조건 하에 25시간 동안 배양하였다.
이 기간 동안, 배양을 시작한지 6시간 후에 최종 농도가 1 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 비오틴 100 마이크로그램/L, 니코틴산 0.015 g/L, 칼슘 D-판토테네이트 0.015 g/L 및 티아민 하이드로클로라이드 0.005 g/L를 배양을 시작한지 10시간 후에 추가로 첨가하였다. 배양 종료 후, 배양액을 원심분리기에 의해 세균 세포와 배양 상청액으로 분리하고 이를 통해 펠렛을 습윤한 세균 세포로서 수득하고 -80℃에서 동결시켰다.
실시예 8
Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7, Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm), Origami-B (DE3)/MBP-6OST3_pGro7 및 RIL/HIS-3OST1_pGro (Sm)의 배양
실시예 5에서 수득된 Origami-B(DE3)/MBP-C5_pGro7 균주를 50 마이크로그램/mL 암피실린, 20 마이크로그램/mL 클로람페니콜, 15 마이크로그램/mL 테트라사이클린 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 5 mL의 TB 배지를 함유하는 대형 시험관에 접종하고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 1.2% 배양액을 50 마이크로그램/mL 암피실린, 20 마이크로그램/mL 클로람페니콜, 15 마이크로그램/mL 테트라사이클린 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 500 mL의 TB 배지를 함유하는 배플 에를렌마이어 플라스크에 접종하고 37℃에서 6시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 여기에 최종 농도 1 mM의 IPTG 및 최종 농도 4 mM의 아라비노스를 첨가하고, 28℃에서 20시간 동안 배양을 수행하였다. 그 후, 배양액을 원심분리하고 이를 통해 펠렛을 습윤한 세균 세포로서 수득하고 -80℃에서 동결시켰다.
실시예 5에서 수득된 Origami-B(DE3)/H-MBP-2OST_pGro(Sm) 균주를 50 마이크로그램/mL 암피실린, 50 마이크로그램/mL 스트렙토마이신, 15 마이크로그램/mL 테트라사이클린 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 5 mL의 TB 배지를 함유하는 대형 시험관에 접종하고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 1.2% 배양액을 50 마이크로그램/mL 암피실린, 50 마이크로그램/mL 스트렙토마이신, 15 마이크로그램/mL 테트라사이클린 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 500mL의 TB 배지를 함유하는 배플 에를렌마이어 플라스크에 접종하고 30℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 여기에 최종 농도 1 mM의 IPTG 및 최종 농도 4 mM의 아라비노스를 첨가하고, 28℃에서 20시간 동안 배양을 수행하였다. 그 후, 배양액을 원심분리하고 이를 통해 펠렛을 습윤한 세균 세포로서 수득하고 -80℃에서 동결시켰다.
실시예 5에서 수득된 Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7 균주를 50 마이크로그램/mL 암피실린, 20 마이크로그램/mL 클로람페니콜, 15 마이크로그램/mL 테트라사이클린 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 5 mL의 TB 배지를 함유하는 대형 시험관에 접종하고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 1.2% 배양액을 50 마이크로그램/mL 암피실린, 20 마이크로그램/mL 클로람페니콜, 15 마이크로그램/mL 테트라사이클린 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 500 mL의 TB 배지를 함유하는 배플 에를렌마이어 플라스크에 접종하고 37℃에서 4시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 여기에 최종 농도 1 mM의 IPTG 및 최종 농도 4 mM의 아라비노스를 첨가하고, 28℃에서 20시간 동안 배양을 수행하였다. 그 후, 배양액을 원심분리하고 이를 통해 펠렛을 습윤한 세균 세포로서 수득하고 -80℃에서 동결시켰다.
실시예 5에서 수득된 RIL/HIS-3OST1_pGro(Sm) 균주를 50 마이크로그램/ml의 스트렙토마이신, 15 마이크로그램/mL의 카나마이신을 함유하는 5 mL의 TB 배지를 함유하는 대형 시험관에 접종하고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 1.2% 배양액을 50 마이크로그램/mL 스트렙토마이신 및 15 마이크로그램/mL 카나마이신을 함유하는 500 mL의 TB 배지를 함유하는 배플 삼각 플라스크에 접종하고, 37℃에서 4시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 여기에 최종 농도 1 mM의 IPTG와 최종 농도 4 mM의 아라비노스를 첨가하고, 28℃에서 20시간 동안 배양을 수행하였다. 그 후, 배양액을 원심분리하고 이를 통해 펠렛을 습윤한 세균 세포로서 수득하고 -80℃에서 동결시켰다.
실시예 9
ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13, Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7 및 Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm)을 사용한 N-설포헤파로산의 2-O 위치에서의 황산화 반응에 대한 시험
실시예 7 및 8에서 수득된 ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13, Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7 및 Origami-B (DE3)/H-MBP-2OST_pGro (Sm)의 동결건 세균 세포 각각을 동결된 세균 세포의 중량이 333 g/L가 되도록 증류수에 현탁시켜 세균 세포 현탁액을 제조하였다. 이렇게 수득된 30 ml의 ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13 세균 세포 현탁액, 6 ml의 Origami-B (DE3)/MBP-C5_pGro7 세균 세포 현탁액 및 6 mL의 Origami-B (DE3)/H- MBP-2OST_pGro (Sm) 세균 세포 현탁액을 250ml 생물반응기 내의 18 ml의 반응 용액[글루코스 60g/L, KH2PO4 8.75g/L, K2HPO4 15g/L, MgSO4-7H2O 20g/L, D-칼슘 판토테네이트 0.3 g/L, 니코틴산 0.2 g/L, 아데닌 4.05 g/L, 염화벤잘코늄 1.25 g/L, ADEKA NOL LG-109(ADEKA 제조) 1 ml/L 및 N-설포헤파로산 1 g/L(실시예 6에서 제조)를 함유하는 수용액]에 첨가하고, 2.8% 암모니아 수용액으로 이의 pH를 6.5로 조정하면서 37℃, 500 rpm의 교반 속도 및 0.75 ml/분의 통기 속도의 배양 조건 하에 22시간 동안 반응시켰다. 이 기간 동안, 배양을 시작한지 6시간 후에 글루코스 60 g/L, MgSO4-7H2O 5.0 g/L 및 아데닌 2.7 g/L를 추가로 첨가하였다.
반응 동안 샘플링을 적절히 수행하여 반응 용액을 수득하였다. 수득된 반응 용액을 적절히 희석한 다음, 원심분리하고, Shimadzu Corporation에 의해 제조된 HPLC를 사용하여 UV 검출기로 254 nm에서 흡광도를 측정하여 PAPS를 검출 및 정량화하였다. 그 결과는 도 4에 나타낸다. 또한, 효소 분해에 의한 불포화 이당류의 생성 및 HPLC에 의한 분석을 특허문헌[WO2018/048973 A1]에 따라 수행하였다.
즉, 수득된 반응 용액을 원심분리하고, 생성된 상청액을 가열하고 80℃에서 10분 동안 유지시켜 단백질을 변성시켰다. 단백질 변성 후의 용액을 원심분리하고, 생성된 상청액을 3k 분자량 필터 디바이스(Merck 제조)를 사용하여 한외여과에 의해 탈염하였다. 탈염 후의 용액을 헤파리나제 I, II, III(Sigma 제조, 그러나 다른 헤파리나제도 사용될 수 있다) 각각을 0.5 U/ml 함유하는 헤파리나제 반응 용액[50 mM 암모늄 아세테이트 및 2 mM 염화칼슘으로 구성됨]에 공급하고 35℃에서 2시간 동안 효소 분해시켰다. 효소 분해 후의 용액을 95℃에서 15분 동안 유지시켜 헤파리나아제를 불활성화시켰다.
헤파리나아제 불활성화 후의 용액을 Shimadzu HPLC 및 강한 음이온 교환 컬럼(spherisorb-SAX 크로마토그래피 컬럼, 4.0 x 250 mm, 5 마이크로미터, Waters 제조)을 사용한 이동상 A[1.8 mM 인산이수소나트륨을 함유하고 인산으로 이의 pH를 pH 3.0으로 조정한 수용액] 및 이동상 B[1.8 mM 인산이수소나트륨 및 1 M 과염소산나트륨을 함유하고 인산으로 이의 pH를 pH 3.0으로 조정한 수용액]의 구배 용출 모드 분석을 거치게 함으로써 불포화 이당류 분석을 수행하였다.
232 nm에서 흡광도를 UV 검출기로 측정하여 불포화 이당류를 검출하였다. 델타-UA-GlcNS 및 델타-UA, 2S-GlcNS의 체류 시간을 불포화 이당류 표준 시약(Iduron 제조)과 비교하여 확인하였다. 검출된 델타-UA-GlcNS와 델타-UA, 2S-GlcNS의 총 면적에 대한 델타-UA, 2S-GlcNS의 면적비를 구하여 2-O-황산화를 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타낸다.
실시예 10
ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13 및 Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7을 사용한 2-O-황산화된 N-설포헤파로산의 6-O 위치에서의 황산화 반응에 대한 시험
실시예 7 및 8에서 수득된 ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13 및 Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7의 동결된 세균 세포 각각을 동결된 세균 세포의 중량이 333 g/L가 되도록 증류수에 현탁시켜 세균 세포 현탁액을 제조하였다. 이렇게 수득된 30 ml의ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13 세균 세포 현탁액 및 6 ml의 Origami-B(DE3)/MBP-6OST3_pGro7 세균 세포 현탁액뿐만 아니라, 6ml의 증류수를 250 ml 생물반응기 내의 18 ml의 반응 용액[글루코스 60g/L, KH2PO4 8.75g/L, K2HPO4 15g/L, MgSO4-7H2O 20g/L, D-칼슘 판토네이트 0.3 g/L, 니코틴산 0.2 g/L, 아데닌 4.05 g/L, 염화벤잘코늄 1.25 g/L, ADEKA NOL LG-109(ADEKA 제조) 1 ml/L 및 2-O-황산화된 N-설포헤파로산 0.5 g/L(실시예 6에서 제조)을 함유하는 수용액]에 첨가하고, 2N 수산화칼륨 수용액으로 이의 pH를 7.4로 조정하면서 32℃, 500 rpm의 교반 속도 및 0.75 ml/분의 통기 속도의 배양 조건 하에 22시간 동안 반응시켰다.
이 기간 동안, 배양을 시작한지 6시간 후에 글루코스 60g/L, MgSO4-7H2O 5.0 g/L 및 아데닌 2.7g/L를 추가로 첨가하였다. 반응 동안 샘플링을 적절히 수행하여 반응 용액을 수득하였다. 실시예 9와 동일한 방법을 사용하여, PAPS의 검출 및 정량화를 수행하였다. 그 결과는 도 6에 나타낸다.
또한, 반응 후 당 사슬에 함유된 황산화된 조성을 실시예 9와 동일한 방법에 의해 분석하였다. 델타-UA, 2S-GlcNS 및 델타-UA, 2S-GlcN, 6S의 체류 시간을 불포화 이당류 표준 시약(Iduron 제조)과 비교하여 확인하였다. 검출된 델타-UA, 2S-GlcNS와 델타-UA, 2S-GlcN, 6S의 총 면적에 대한 델타-UA, 2S-GlcN, 6S의 면적비를 구하여 6-O-황산화를 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타낸다.
실시예 11
ATCC 6872 (DE3)/pSC-3-13, Origami-B (DE3)/MBP-6OST3_pGro7 및 RIL/HIS-3OST1_pGro (Sm)을 사용한 2-O-황산화된 N-설포헤파로산의 6-O 위치 및 3-O 위치에서의 황산화 반응에 대한 시험
실시예 10에 설명된 조건 하에 22시간 동안 반응을 수행하였다. 이 기간 동안, 반응을 시작한지 3시간 후에, 실시예 8에서 수득된 IL/HIS-3OST1_pGro(Sm)의 동결된 세균 세포를 동결된 세균 세포의 중량이 333 g/L가 되도록 증류수에 현탁시키고 6 ml의 제조된 세균 세포 현탁액을 첨가하였다. 반응 동안 샘플링을 적절히 수행하여 반응 용액을 수득하였다. 실시예 9와 동일한 방법을 사용하여, PAPS의 검출 및 정량화를 수행하였다. 그 결과는 도 8에 나타낸다.
반응 종료 후, 반응 용액을 원심분리하고, 생성된 상청액을 적절히 희석한 후, BIOPHEN(등록상표) ANTI-IIa 측정 키트(Hyphen Biomed 제조)를 이용하여 항-IIa 활성을 측정하여 3-O-황산화를 확인하였다. 또한, RIL/HIS-3OST1_pGro(Sm)가 첨가되지 않은 음성 대조군으로서 실시예 10의 반응 후의 용액의 항-IIa 활성을 또한 측정하였다. BIOPHEN(등록상표) UFH 교정기(Hyphen Biomed 제조)를 사용하여 검량선을 작성하였다. 그 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1. 항-IIa 활성의 측정 결과
RIL/HIS-30ST1_pGro(Sm)의 첨가 항-IIa 활성(IU/ml - 상청액)
첨가 375
첨가되지 않음 -36
실시예 12
실시예 7에서 수득된 ATCC 6872(DE3)/pSC-3-13의 동결된 세균 세포를 동결된 세균 세포의 중량이 333 g/L가 되도록 증류수에 현탁시켜 세균 세포 현탁액을 제조하였다. 이렇게 수득된 30 ml의 세균 세포 현탁액을 250 ml 생물반응기 내의 30 ml의 반응 용액[글루코스 60g/L, KH2PO4 8.75g/L, K2HPO4 15g/L, MgSO4-7H2O 20g/L, D-칼슘 판토테네이트 0.3 g/L, 니코틴산 0.2 g/L, 아데닌 4.05 g/L, 염화벤잘코늄 0.625 g/L, ADEKA NOL LG-109(ADEKA 제조) 1 ml/L을 함유하는 수용액]에 첨가하고, 2N 수산화칼륨 수용액으로 이의 pH를 7.4로 조정하면서 32℃, 500 rpm의 교반 속도, 0.75 mL/분의 통기 속도의 배양 조건 하에 22시간 동안 반응시켰다.
이 기간 동안, 반응을 시작한지 6시간 후에 글루코스 60 g/L, KH2PO4 2.19 g/L, K2HPO4 3.75 g/L, MgSO4-7H2O 5.0 g/L 및 아데닌 2.7 g/L를 추가로 첨가하였다. 반응 동안 샘플링을 적절히 수행하여 반응 용액을 수득하였다.
수득된 반응 용액을 적절히 희석한 다음, 원심분리하고, Shimadzu Corporation에 의해 제조된 HPLC를 사용하여 UV 검출기로 254 nm에서 흡광도를 측정하여 PAPS를 검출 및 정량화하였다. 그 결과는 도 9에 나타낸다.
상술한 바와 같이, PAPS를 생산 및 재생할 수 있는 코리네박테리움 속의 세균 및 황산화 효소를 발현하는 원핵생물에 속하는 미생물을 글루코스, 아데닌 및 황산마그네슘과 같은 원료에 첨가하여 반응시켰고, 이를 통해 다당류로부터 황산화된 다당류가 효율적으로 제조되었다.
본 발명이 상세히 그리고 이의 구체적인 실시양태를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 통합된다. 본 출원은 2020년 4월 3일에 출원된 국제출원 제PCT/JP2020/015388호에 기초하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> RENSSELAER POLYTECHNIC INSTITUTE OTSUKA PHARMACEUTICAL FACTORY, INC KIRIN BIOMATERIALS CO., LTD. <120> Method for producing sulfated polysaccharide and method for producing PAPS <130> W531376 <150> PCT/JP2020/015388 <151> 2020-04-03 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide for primer <400> 1 cggtacccgg ggatccgact ggccagtaca ggctg 35 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide for primer <400> 2 agcgactcga gtttagatct tcaatgctca acccgacctg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide for primer <400> 3 attgaagatc taaactcgag tcgcttgacg atgttcaact 40 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Oligonucleotide for primer <400> 4 cgactctaga ggatcgtttg tcgcgggcga cgata 35 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized 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ccgtagctac 720 ctgacggtcg ccattggttg taccggcggg aagcaccgtt cggtgtatat tgcagagcaa 780 ctggcagact acttccgctc gcgcggtaaa aacgtccagt cacgccatcg gacgctggaa 840 aaacgtaaac catga 855

Claims (11)

  1. 하기 단계 (1-1) 및 (1-2)를 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    (1-1) 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 세균의 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물을 제조하는 단계; 및
    (1-2) ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 형질전환체(a) 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 하기 단계 (2-1) 및 (2-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    (2-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
    (2-2) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 C5-에피머화를 수행하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발현 가능한 방식으로 도입된 설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 처리물 또는 추출물에 의해 황산화를 수행하는 단계를 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 하기 단계 (3-1) 및 (3-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    (3-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
    (3-2) 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 2-O-황산화를 수행하는 단계.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 하기 단계 (3'-1) 내지 (3'-3)을 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    (3'-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계;
    (3'-2) 발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
    (3'-3) 형질전환체(b) 또는 이의 처리물 또는 추출물, 및 형질전환체(c) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 C5-에피머화 및 2-O-황산화를 수행하는 단계.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계 (4-1) 및 (4-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    (4-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 6-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(d) 또는 형질전환체(d)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
    (4-2) 형질전환체(d) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 6-O-황산화를 수행하는 단계.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계 (5-1) 및 (5-2)를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    (5-1) 발현 가능한 방식으로 도입된 3-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(e) 또는 형질전환체(e)의 처리물 또는 추출물을 제조하는 단계; 및
    (5-2) 형질전환체(e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 3-O-황산화를 수행하는 단계.
  8. 황산화된 다당류의 제조 방법으로서,
    발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체(a) 또는 형질전환체(a)의 처리물과, 하기로부터 선택된 적어도 하나를, ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법:
    발현 가능한 방식으로 도입된 C5-에피머라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(b) 또는 형질전환체(b)의 처리물 또는 추출물,
    발현 가능한 방식으로 도입된 2-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(c) 또는 형질전환체(c)의 처리물 또는 추출물,
    발현 가능한 방식으로 도입된 6-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(d) 또는 형질전환체(d)의 처리물 또는 추출물, 및
    발현 가능한 방식으로 도입된 3-O-설포트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 원핵생물에 속하는 미생물의 형질전환체(e) 또는 형질전환체(e)의 처리물 또는 추출물.
  9. 제8항에 있어서, 형질전환체(a) 또는 이의 처리물, 및 형질전환체(b) 내지 (e) 또는 이의 처리물 또는 추출물을 ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원 및 N-설포헤파로산의 존재 하에 반응 용액에 혼입하여 황산화된 다당류를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 황산화된 다당류의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 헤파린을 제조하기 위한 것인 황산화된 다당류의 제조 방법.
  11. 하기 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는, PAPS의 제조 방법:
    (i) 발현 가능한 방식으로 도입된, ATP 설퍼릴라제를 코딩하는 유전자 및 APS 키나제를 코딩하는 유전자를 적어도 포함하는, 코리네박테리움 속의 세균의 형질전환체 또는 상기 형질전환체의 처리물을 제조하는 단계; 및
    (ii) ATP 또는 ATP 공급원, 황산 이온 공급원, 및 단계 (i)에서 제조된 형질전환체 또는 이의 처리물을 함유하는 반응 용액을 사용하여 PAPS를 제조하기 위한 반응을 수행하는 단계.
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