KR100576576B1 - 화학적 합성 배지를 이용하는 가치있는 화합물들의 산업적 규모의 발효적 생산 - Google Patents

화학적 합성 배지를 이용하는 가치있는 화합물들의 산업적 규모의 발효적 생산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가치있는 화합물들의 산업적 규모의 발효적 생산을 위한 화학적 합성 배지의 이용을 기술한다. 화학적 합성 배지를 이용하는 산업적 규모의 발효에 적합한 미생물 균주는 균류, 효모 및 박테리아 균주들을 포함한다. 적합한 균주들을 야생형 균주로서 또는 돌연변이유발 처리 및 DNA 형질전환 후 스크리닝 및 셀렉션에 의해 얻을 수 있다.
화학적 합성 배지, 사상 미생물 균주

Description

화학적 합성 배지를 이용하는 가치있는 화합물들의 산업적 규모의 발효적 생산{FERMENTATIVE PRODUCTION OF VALUABLE COMPOUNDS ON AN INDUSTRIAL SCALE USING CHEMICALLY DEFINED MEDIA}
본 발명은 발효 즉 일차 또는 이차 대사산물, 약제학적 단백질 또는 펩티드, 또는 산업적 효소 등의 가치있는 화합물들의 발효적 생산에 관한 것이다.
많은 가치있는 화합물들이 일반적으로 산업적 규모의 발효기, 즉 10 내지 300㎥의 발효기에서 콘트롤된 조건하에 원하는 가치있는 화합물을 생산하는 미생물이 생장하는 발효기에서 발효적 생산에 의해 제조된다. 최근의 산업적 규모의 발효 공정에서 그 생산 유기체는 전형적으로 복합 발효 배지상에서 발효된다. 복합 배지는 콩가루, 면 씨앗 가루, 콘 스팁 리큐르, 효모 추출물, 카세인 가수분해물, 당밀 등의 복합 질소 및/또는 탄소원을 포함하는 배지로 이해된다.
복합 배지의 장점은 구성하는 복합 천연 재료들이 비싸지 않고 쉽게 구입할 수 있고 탄소 및 질소원 뿐만 아니라 비타민 및 미네랄을 함유하는 미생물을 위한 완벽한 또는 거의 완벽한 영양 공급원을 형성한다. 또한 복합 천연 재료들에 존재하는 단백질, 탄수화물, 지질 등의 생물학적 고분자의 혼합물은 그 소비 전에 미생물에 의해 분비된 효소에 의해 분해될 필요가 있다. 그 결과 발효기 전체를 통해 그리고 발효공정 동안 고르게 소비가능한 작은 분자가 유용하고 이로써 농도구배와 혼합하는 문제점을 피하고 이러한 소비가능한 작은 분자들의 레벨을 억제하는 농도 미만으로 유지한다. 또한 이러한 고분자 뿐만 아니라 유기산 또한 복합 배지에 존재하여 그 배지에 pH 조절을 촉진하는 이러한 방식으로 완충기능을 제공한다.
이러한 장점들 뿐만 아니라 복합 발효 배지는 몇몇 중요한 단점을 갖는다. 가장 중요하게는 복합 천연 재료들이 계절적 변이 및 다른 지리적 기원에 기인하여 화학적으로 정의되지 않는 조성 및 변하기 쉬운 품질을 갖는다. 발효 배지의 조성이 점도, 열 전달 및 산소 전달 등의 발효 파라미터에 중요한 영향을 미치기 때문에 복합 천연 재료들은 공정 변화성의 주요한 원인이다. 게다가 그것들은 하류 가공을 방해하여 최종산물의 품질에 나쁜 영향을 미친다. 예컨대 발효 육즙, 구체적으로 사상 미생물들이 복합 천연 재료들을 사용시 감소된 여과력을 보인다.
복합 천연 재료들은 또한 의도하지 않게 최종산물에 축적되거나 최종산물과 함께 분리되는 화합물들을 함유한다. 중금속, 살충제 또는 제초제들이 복합 천연 재료들에 존재하는 원하지 않는 화합물들의 예이다. 또한 복합 천연 재료들은 독을 함유하거나 독의 형성을 유발할 수 있다.
또다른 단점은 복합 배지가 멸균하는 동안 바람직하지 않은 냄새를 만들므로 원치않는 공해를 생산한다.
복합 배지 이용에 관련된 상기 기술한 단점에도 불구하고 이러한 배지가 여전히 대규모 산업적 발효 공정에 바람직하다. 복합 천연 재료들을 함유하지 않는 배지, 즉 화학적 합성 배지가 산업적 규모의 발효 공정에의 이용을 위해 고려되지 않아 온 다양한 이유들이 있다. 한 명백한 이유는 복합 배지의 이용에 관련된 장점들에서 발견된다. 더욱 중요하게는 산업적 규모로 화학적 합성 배지를 이용하여 얻은 생성물의 수율이 전형적으로 복합 천연 재료들을 함유한 배지를 사용하여 얻은 것보다 본질적으로 더 낮은 것으로 생각되었다. 또한 복합 배지에서 산업적 공정을 위해 발달된 고-생산 미생물 균주들이 화학적 합성 배지에서 그들의 좋은 성능을 보유하지 못한다. 화학적 합성 배지에서 만족스럽지 않은 성능의 한 이유는 최근의 산업적 균주들로 화학적 합성 배지 상에서 그들의 성능을 고려하지 않고 돌연변이유발 및 셀렉션(selection)의 다양한 순서들을 행하기 때문이다.
그러므로 화학적 합성 배지는 연구목적으로만, 즉 페트리 디쉬 및/또는 진탕 플라스크에서의 실험실 배양 또는 전형적으로 약 20 내지 40L 부피를 초과하지 않는 상대적으로 작은 발효 규모로만 적용되어왔다. 페니실린(Jarvis and Johnson, J. Am. Chem. Soc. 69, 3010-3017 (1947); Stone, and Farrell, Science 104, 445-446(1946); White et al., Arch. Biochem. 8, 303-309 (1945)), 클라불란산(Romero et al., Appl. Env. Microbiol. 52, 892-897 (1986)) 및 에리쓰로마이신(Bushell et al., Microbiol. 143, 475-480 (1997)) 등의 이차 대사산물의 발효적 생산의 예를 참조하라.
그러나 그러한 작은 연구 규모로 화학적 합성 배지의 이용에 관한 조사가 전형적으로 약 10㎥이상의 부피 규모를 갖는 생산 목적의 대규모 산업적 발효 공정에서의 이러한 배지의 유용성에 관하여 당업자에게 어떤 정보도 제공하지 않았다.
최근의 산업적 관행상 복합 배지에 대한 종래 방법의 이용에 관련된 문제 점들을 피하기 위해서 화학적 합성 방법들을 산업적 규모의 발효에 적용시키는 것이 바람직하다.
여기에서 우리는 적합한 균주의 조합으로 일차 또는 이차 대사산물, 약제학적 단백질 또는 펩티드, 또는 산업적 효소 등의 가치 있는 화합물들의 생산을 경제성 있는 수율로 가능케 하는 산업적 규모의 발효 공정을 위해 화학적 합성 배지를 이용하는 것을 기술한다.
본 발명은 본질적으로 화학적으로 정의된 성분들로 구성된 화학적 합성 배지인 발효 배지에서의 미생물 균주의 발효 및 발효 육즙으로부터의 가치있는 화합물의 회수 단계들을 포함하는 가치있는 화합물 생산을 위한 산업적 공정을 개시한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 화학적 합성 배지에서 산업적 규모로 발효될 수 있는 관심의 가치있는 화합물을 생산하는 미생물 균주의 제조 및/또는 개량 방법을 개시한다:
* 적당한 부모 균주를 물리적 수단들 및 화학적 돌연변이원들로부터 선택된 돌연변이유발 처리 및/또는 DNA 형질전환시키는 단계,
* 화학적 합성 배지 상에서의 그들의 생장 성능 및 원하는 그들의 상기 가치있는 화합물의 생산성 레벨에 대해 결과된 돌연변이체들 및/또는 형질전환체들을 스크리닝하는 단계,
* 화학적 합성 배지 상에서 상기 부모 균주와 비교할 때 유사하거나 향상된 생장 성능을 갖고/갖거나 관심의 상기 가치있는 화합물의 향상된 생산성 레벨을 갖는 돌연변이체들을 셀렉팅하는 단계.
본 발명은 가치있는 화합물을 생산할 수 있는 적당한 미생물 균주의 산업적 규모의 발효를 위한 화학적 합성 발효 배지의 이용을 기술한다.
본 발명의 설명 전체를 통해 산업적 규모의 발효 공정 또는 산업적 공정이란 10㎥이상, 바람직하게는 25㎥이상, 더욱 바람직하게는 50㎥이상, 가장 바람직하게는 100㎥이상의 부피 규모로 발효 공정을 완수하는 것으로 이해된다.
용어 "화학적으로 정의된"은 본질적으로 화학적으로 정의된 성분들로 구성된 발효 배지를 위해 사용되는 것으로 이해된다. 본질적으로 화학적으로 정의된 성분들로 구성된 발효 배지는 복합 탄소 및/또는 질소원을 함유하지 않는, 즉 화학적으로 정의되지 않는 조성을 갖는 복합 천연 재료들을 함유하지 않는 배지를 포함한다. 본질적으로 화학적으로 정의된 성분들로 구성된 발효 배지는 전형적으로 미생물의 생장을 유지하고/하거나 충분한 양의 바이오매스 형성을 보장하는데 충분치 않은 이하 정의되는 바와같은 양의 소량의 복합 질소 및/또는 탄소원을 본질적으로 포함하는 배지를 또한 포함한다.
그러한 관점에서 복합 천연 재료들은 화학적으로 정의되지 않는 조성을 갖는데 이는 예컨대 이러한 천연 재료들이 복합 헤테로중합 화합물들 중에 많은 다른 화합물들을 함유하고 계절적 변이 및 지리적 기원의 차이에 기인한 다양한 조성을 갖는다는 사실 때문이다. 발효에서 복합 탄소 및/또는 질소원으로서 기능하는 복합 천연 재료들의 전형적인 예들은 대두 가루, 면 씨앗 가루, 콘 스팁 리큐르, 효모 추출물, 카세인 가수분해물, 당밀 등이 있다.
본질적으로 소량의 복합 탄소 및/또는 질소원이 본발명에 따른 화학적 합성 배지에 존재하는데 예컨대 주요 발효를 위한 접종물로부터 넘어온 것이다. 그 주요 발효를 위한 접종물은 화학적 합성 배지 상에서의 발효에 의해 반드시 얻어지는 것은 아니다. 대부분 종종 그 접종물로부터 넘어온 것은 주요 발효를 위한 화학적 합성 배지에서 소량의 복합 질소원 존재를 통해 검출가능할 것이다.
주요 발효를 위한 접종물의 발효 공정에서 복합 탄소 및/또는 질소원을 이용하는 것이 유익한데, 예컨대 바이오매스의 형성을 가속시키는, 즉 그 미생물의 생장 속도를 증가시키고/거나 내부 pH 조절을 촉진하는 데에 유익하다. 그와 같은 이유로 소량의 복합 탄소 및/또는 질소원, 예컨대 효모 추출물을 주요 발효의 초기 단계에 본질적으로 첨가하는 것이 유익하고, 특히 발효 공정의 초기 단계에서 바이오매스 형성을 가속화시킨다.
본 발명에 따른 화학적 합성 배지에 본질적으로 존재하는 소량의 복합 탄소 및/또는 질소원은 화학적 합성 배지에 존재하는 탄소 및/또는 질소(Kjeldahl N) 총량의 10%이하, 바람직하게는 탄소 및/또는 질소 총량의 5%이하, 더욱 바람직하게는 탄소 및/또는 질소 총량의 1%이하의 양으로 제한된다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 화학적 합성 배지에 복합 탄소 및/또는 질소원이 존재하지 않는 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "화학적 합성 배지"는 발효 공정 시작 전에 모든 필수 구성성분들이 그 배지에 첨가된 배지를 포함하고 또한 필수 구성성분들의 일부가 발효 공정 시작 전에 첨가되고 일부가 발효 공정 동안 그 배지에 첨가된 배지를 포함한다.
본 발명은 미생물 균주들이 화학적 합성 배지의 간단한 천연 재료들을 산업적 규모로 경제성있는 양의 가치있는 생성물로 변환시킬 수 있다는 것을 더욱 개시한다. 놀랍게도 화학적 합성 배지에서의 미생물 균주들의 생산성이 산업적 규모로 측정시 복합 배지에서의 그 생산성에 비할 정도 또는 어떤 경우에는 그것보다 훨씬 높다는 것을 발견하였다.
화학적 합성 배지 이용의 또다른 장점은 기체 상으로부터 액체 상으로의 산소 전달 및 액체 상으로부터 기체 상으로의 이산화 탄소 전달이 복합 배지를 이용한 것에 비교하여 본질적으로 향상된다는 것이다. 당업자에게 알려져 있듯이 용해된 산소 및 용해된 이산화 탄소의 농도가 발효 공정의 스케일업에 있어서 중요한 요소들이고 산업 공정의 경제적 타당성을 결정할 수 있다. 화학적 합성 배지를 사용하여 얻은 향상된 질량 전달이 이러한 배지에서 기체 방울들의 융합을 촉진하는 본질적인 양의 화합물들 부재에 공헌할 수 있다. 융합-촉진 화합물은 예컨대 복합 천연 재료들에 존재하는 어떤 소수성 및/또는 중합적 화합물들 사이에서 발견될 수 있다. 기체 방울들의 융합은 전형적으로 더 낮은 질량 전달 계수를 초래한다(van't Riet and Tramper, in: Basic Bioreactor Design, pp 236-273(1991)).
산소 전달은 종종 발효 공정에서 제한 인자인데, 특히 사상 미생물들의 발효에서 그렇다. 발효가 본 발명에 따른 화학적 합성 배지를 사용하여 수행될 때 얻어진 향상된 산소 전달능이 파워 인풋, 입구 공기의 산소 풍부화 또는 발효기 압력 등의 하드웨어 상의 투자보다 생산성 최적화에 더 저렴한 방법을 제공한다.
산업적 발효 공정에서 Actinomycetes 등의 사상 박테리아 또는 Penicillium 또는 Aspergillus 등의 사상 균류 등의 사상 미생물들은 전형적으로 펠릿 형태학을 가지면서 생장한다. 그러한 관점에서 복합 발효 배지에 존재하는 단백질들 및 펩티드들이 전형적으로 복합 배지를 사용하여 획득한 고 생장률의 결과로서 매우 길고 분지된 균사를 갖는 분산된 균사체로 쉽게 동요되는 솜털모양 펠릿을 만드는 경향을 갖는다. 그러므로 솜털모양 펠릿 형태는 일반적으로 바람직하지 않게 높은 육즙 점도를 초래한다. 화학적 합성 배지의 이용은 형태학에 바람직한 영향을 미치는데 예컨대 발효동안 쉽게 부서지지 않는 더욱 견고한 펠릿을 생산하는 것이다. 이러한 방식으로 사상 발효 육즙 점도의 현저한 감소가 화학적 합성 배지를 사용하여 얻어질 수 있다. 그 발효 육즙의 낮은 점도가 생성물 형성에 유익하기 때문에 점도의 조절이 산업적 규모의 발효 공정에 있어서 가장 중요하다.
화학적 합성 배지 사용의 또다른 장점은 생성물의 하류 가공에서 발견된다. 특정 균주-생성물 조합들에 있어서, 특히 사상 균주들이 발효될 때 하류 가공이 화학적 합성 배지를 사용함으로써 현저히 향상된다.
본 발명의 공정에서 사용되는 화학적 합성 배지는 전형적으로 소위 구조적 및 소위 촉매적 요소들을 함유해야만 한다.
구조적 요소들은 미생물의 고분자들의 구성성분들, 즉 수소, 산소, 탄소, 질소, 인 및 황이다. 구조적 요소인 수소, 산소, 탄소 및 질소는 전형적으로 탄소 및 질소원 안에 함유된다. 인 및 황은 전형적으로 인산염 및 황산염 및/또는 티오황산염 이온들로서 첨가된다.
화학적 합성 배지에 사용되는 탄소 및 질소원의 유형이 본질적으로 화학적으 로 정의된 특성을 갖는 탄소 및 질소원이라면 본 발명에 있어 특히 정해져 있는 것은 아니다.
바람직하게는 탄소원은 글루코스, 락토스, 프룩토스, 수크로스, 말토덱스트린류, 녹말 및 이눌린 등의 탄수화물류, 글리세롤, 식물성 오일류, 탄화수소류, 메탄올 및 에탄올 등의 알코올류, 아세테이트 및 고급 알카노산 등의 유기산류로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 탄소원은 글루코스, 수크로스 및 콩기름으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 탄소원은 글루코스이다. 용어 "글루코스"는 글루코스 시럽, 즉 제한된 양으로 글루코스 올리고머를 함유하는 글루코스 조성물을 포함하는 것으로 이해된다.
질소원은 바람직하게는 유레아, 암모니아, 질산염, 황산 암모늄, 인산 암모늄 및 질산 암모늄 등의 암모늄 염류, 및 글루타메이트 및 리신 등의 아미노산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는 질소원은 암모니아, 황산 암모늄 및 인산 암모늄으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 질소원은 암모니아이다. 질소원으로서 암모니아의 이용은 암모니아는 부가적으로 pH-조절제로서 기능할 수 있다는 장점을 갖는다. 황산 암모늄 및/또는 인산 암모늄이 질소원으로서 사용되는 경우에 미생물의 황 및/또는 인 요구의 일부 또는 전부가 충족된다.
촉매적 원소들은 효소 또는 효소의 보조인자들인 구성성분들이다. 이러한 원소들은 예컨대 마그네슘, 철, 구리, 칼슘, 망간, 아연, 코발트, 몰리브덴, 셀렌, 붕소이다.
이러한 구조적 및 촉매적 원소들 이외에 칼륨 및 나트륨 이온 등의 양이온들이 카운터 이온으로서 기능하기 위해 그리고 세포내의 pH 및 삼투압을 조절하기 위해 존재해야 한다.
화학적 합성 배지에 선택적으로 포함될 수 있는 화합물들은 시트르산 등의 킬레이팅제, 인산 일- 및 이칼륨, 탄산 칼슘 등의 완충제들이다. 완충제들은 바람직하게 외부 pH 조절 없이 공정을 다룰 때 첨가된다. 게다가 소포제가 발효 공정에 앞서 그리고/또는 발효공정 동안 투여될 수 있다.
복합 배지에 존재하는 고분자들 및 유기산들이 이러한 배지에서 완충능을 제공한다. 화학적 합성 배지에서 이러한 화합물들의 부재에 기인하여 복합 배지보다 화학적 합성 배지에서 pH조절이 더 어렵다. 본 발명은 육즙의 pH에 따라 산 또는 염기가 투여되는 pH조절은 화학적으로 정의된 산업적 규모의 공정에서 적절한 pH 프로파일을 허용함을 보여준다.
비타민류는 미생물들의 정상 대사에 필요한 구조적으로 관련없는 유기 화합물 군을 말한다. 미생물들이 그들이 필요로하는 비타민들을 합성하는 능력에 있어서 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 비타민은 그 상기 비타민을 합성할 수 없는 미생물의 발효 배지에 첨가되어야 한다. 전형적으로 효모 또는 박테리아 또는 Mucorales 등의 특정 하등 균류를 위한 화학적 합성 발효 배지는 하나이상의 비타민이 공급된다. 고등 균류는 대부분 종종 비타민을 요구하지 않는다.
비타민들은 티아민, 리보플라빈, 피리독살, 니코틴산 또는 니코틴아미드, 판토텐산, 시아노코발아민, 엽산, 비오틴, 리포산, 푸린, 피리미딘, 이노시톨, 콜린 및 헤민의 군으로부터 선택된다.
구조적 및 촉매적 요소들 및 선택적으로 비타민들이 미생물의 생장, 즉 바이오매스의 형성에 필요하다.
화학적 합성 배지로 첨가되는 필수적인 화합물들, 즉 구조적 및 촉매적 요소들 및 선택적으로 비타민들을 포함하는 화합물들의 양은 주로 발효 공정에서 형성되는 바이오매스의 양에 달려있다. 형성된 바이오매스의 양은 매우 다양한데 전형적으로 약 10 내지 약 150g/l의 발효 육즙이다. 일반적으로 약 10g/l미만의 바이오매스의 양을 생산하는 발효는 산업적으로 적합하지 않다.
또한 필수적인 화합물 뿐만 아니라 비필수적인 화합물까지 합성 배지의 각 구성성분들의 최적 양은 합성 배지에서 발효시킬 미생물의 유형, 바이오매스의 양 및 형성된 생성물에 따라 다를 것이다. 이런 이유로 화학적 합성 배지를 사용함으로써 다른 구성성분들과 독립적으로 각각의 배지 구성성분 농도 변화가 가능하므로 이러한 방식으로 배지 조성의 최적화를 촉진할 수 있다.
생성물 형성을 위해 화학적 합성 배지에 부가적인 화합물을 공급하고/하거나 화학적 합성 배지에 이미 존재하는 특정 화합물들의 농도를 미생물 생장을 위해 필요한 레벨 이상으로 증가시키는 것이 필요하다. 상기 화합물들의 기능은 미생물에 의한 원하는 화합물의 생산을 유도 및/또는 촉진하거나 원하는 화합물의 전구체로서 기능하는 것이다.
화학적 합성 배지에 공급되고/되거나 증가된 양으로 첨가되는 화합물들의 예는 β-락탐 화합물 생산을 위한 증가된 양의 황산염, 아미노산 특히 염기성 아미노 산의 생산을 위한 증가된 양의 질소-함유 화합물, 페니실린 G 생산을 위한 페닐아세트산, 페니실린 V 생산을 위한 페녹시아세트산, 아디필-7-ADCA 및 아디필-7-ACA 생산을 위한 아디프산, 에리쓰로마이신 생산을 위한 프로피온산이다.
본 발명에 따른 산업적 발효 공정에서 화학적 합성 배지로 첨가되는 탄소원의 총량은 배지 1리터당 탄소양으로 표현되는데 10 내지 200gC/l, 바람직하게는 20 내지 200gC/l로 다양하다.
화학적 합성 배지로 첨가되는 질소원의 총량은 0.5 내지 50gN/l, 바람직하게는 1 내지 25gN/l로 다양하고 그안의 N은 Kjeldahl 질소로서 표현된다.
발효에서 탄소 및 질소원 간의 비율은 상당히 다양한데, 적정 비율에 대한 하나의 결정인자는 형성될 생성물의 구성요소의 조성이다.
인산염, 황산염 또는 미량원소들 등의 미생물 생장에 필요한 부가적인 화합물들이 가이드라인으로써 제시한 표1에 기술한 농도 범위를 사용하여 첨가된다. 이러한 부가적인 화합물들의 농도 범위는 미생물의 다른 클래스들 간, 즉 균류, 효모 및 박테리아 간에 다르다.
비타민 농도는 일반적으로 0.1(비오틴) 내지 500(미오-이노시톨)mg/l의 범위내이다.
전형적으로 미생물 생장에 필요한 배지 구성성분들의 양은 발효에 사용되는 탄소원의 양에 관련하여 결정되는데 이는 형성된 바이오매스 양이 사용된 탄소원의 양에 의해 일차적으로 결정되기 때문이다.
탄소 및 질소원 이외에 다양한 클래스의 미생물들의 생장에 필요한 배지 구성성분들의 전형적인 농도 범위(g/l)
균류 효모 박테리아 (Actinomycetes)
PO4 1,5 SO4 2,5 1 - 20
MgSO4·7aq3 0.5-10 0.5-2 0.5-2
CaCl2·2aq3 0.01-0.1 0.1-1 0.05-0.5
FeSO4·7aq3 0.1-1.0 0.1-0.5 0.1-0.5
ZnSO4·7aq3 0.0005-0.1 0.002-1 0.002-0.1
MnSO4·1aq3 0.0005-0.1 0.002-1 0.002-0.1
CuSO4·5aq3,4 ≤0.005 0.001-0.01 0.001-0.01
CoSO4·7aq3,4 ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01
Na2MoO4·2aq4 ≤0.0005 0.001-0.005 0.001-0.005
H3BO3 4 ≤0.0005 0.001-0.005 0.001-0.005
KI4 ≤0.002 ≤0.002
1 인산염의 기본 필요량은 바이오매스 건조 중량의 0.5 내지 1%일 것이다. 상대적으로 작은 규모의 회분 공정들에 있어서 외부 인산염이 pH조절을 위해 요구될 것이다. 2 황산염 또한 K+ 및 Na+ 등의 적정제를 통해 투여된다. 3 황산염이 미량원소에서 카운터 이온으로서 염화물로 (부분적으로)대체되거나 그 역도 가능하다. 4 일부 미량원소들에 있어서 하한을 한정하기가 어렵다. 그 요구는 예컨대 황산 제1철, 물, 소량의 효모 추출물 등의 다른 배지 구성성분들에 있는 그것들의 존재에 의해 충족된다. 5 인산염 및 황산염이 K > NH4 > Na의 선호로 포타슘, 암모늄 및/또는 소듐 염으로서 첨가된다.
화학적 합성 배지를 사용하는 본 발명에 따른 산업적 발효 공정이 회분(回分), 반복 회분, 유가(流加), 반복 유가 또는 연속 발효 공정으로서 수행될 수 있다.
회분 공정에서는 발효 공정의 시작 전에 모든 배지 구성성분들을 전체로서 배지로 직접 첨가한다.
반복 회분 공정에서는 완전한 배지의 부분적인 공급에 의해 수반된 육즙의 부분적인 수확물이 선택적으로 반복된 수회 발생한다.
유가 공정에 있어서는 발효 시작 전에 그 배지로 하나이상의 구조적 및/또는 촉매적 요소들을 포함하는 화합물들이 전혀 첨가되지 않거나 일부가 첨가되고 발효 공정 동안에 하나이상의 구조적 및/또는 촉매적 요소들을 포함하는 화합물이 각각 모두 또는 잔류부가 피딩된다. 피딩을 위해 선택된 화합물들은 발효 공정과 함께 또는 분리되어 피딩될 수 있다.
특히 최초의 발효 배지가 하나이상의 구조적 요소들을 포함하는 화합물들의 피딩에 의해 약 두배이상 희석되는 발효 공정에 있어서 특히 그 피딩은 구조적 요소들 이외에 촉매적 요소들 및 부가적 배지 구성성분들을 더욱 포함한다.
반복 유가 또는 연속 발효 공정에서는 완전한 출발 배지가 발효동안 부가적으로 피딩된다. 그 출발 배지는 구조적인 요소 피딩과 함께 또는 분리하여 피딩될 수 있다. 반복 유가 공정에서 그 바이오매스를 포함하는 발효 육즙의 일부가 규칙적인 시간 간격마다 제거되는 반면 연속 공정에서 그 발효 육즙의 일부가 연속적으로 제거된다. 이로써 그 발효 공정은 빼낸 발효 육즙의 양에 상응하는 신선한 배지로 새로 보충된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 유가 또는 반복 유가 공정이 적용되는데 그안의 탄소 및/또는 질소원 및/또는 인산염이 발효 공정에 피딩된다. 더욱 바람직한 구체예에서 탄소 및 질소원이 더욱 발효 공정에 피딩된다. 가장 바람직하게는 탄소 및 질소원 뿐만 아니라 인산염이 피딩된다. 그러한 관점에서 바람직한 탄소원은 글 루코스이고 바람직한 질소원은 암모니아 및/또는 암모늄 염이다.
유가 공정의 이용은 전형적으로 회분 공정에서 사용되는 것보다 상당히 더 높은 양의 탄소 및 질소원의 사용을 가능케 한다. 상세하게는 유가 공정에 적용되는 탄소 및 질소원의 양은 회분 공정에 적용되는 최고량보다 적어도 약2배가 될 수 있다. 이것은 유가 공정에서 형성되는 상당히 더 높은 양의 바이오매스를 초래한다.
본 발명의 다른 관점은 발효 육즙의 하류 가공의 선택에 관한 것이다. 발효 공정이 끝난 후 가치있는 생성물이 관심의 가치있는 화합물을 위해 발전된 표준 기술을 사용하여 발효 육즙으로부터 선택적으로 회수될 수 있다. 이렇게 적용되는 적합한 하류 가공 기술은 가치있는 화합물의 성질 및 세포의 위치지정에 달려있다. 무엇보다도 먼저 바이오매스가 예컨대 원심분리 또는 여과를 이용하여 발효액으로부터 분리된다. 가치있는 생성물이 미생물 세포 내부에 축적되거나 세포와 결합되어 있는 경우에 그 가치있는 화합물을 바이오매스로부터 회수한다. 그렇지 않으면 그 가치있는 생성물이 미생물 세포로부터 분비될 때 그것을 발효액으로부터 회수한다.
관심의 가치있는 화합물의 산업적 발효적 생산에 있어서 화학적 합성 배지의 이용이 하류 가공에 있어서 큰 장점을 부여하는 데, 이는 부산물의 양이 복합 배지를 사용할 때 보다 본질적으로 더 적기 때문이다. 또한 원치않는 부산물이 관심의 화합물과 공동분리되지 않기 때문에 생성물의 질이 향상된다.
본 발명의 또다른 관점에서 화학적 합성 배지를 사용하는 산업적 발효 공정 을 위한 적당한 균주가 동정된다.
화학적 합성 배지를 사용하는 산업적 발효 공정을 위한 적당한 미생물 균주는 화학적 합성 배지 상에서 좋은 생장 성능을 갖기만 한다면 관심의 가치 있는 화합물을 생산하는 어떤 야생형 균주가 될 수 있다. 또한 화학적 합성 배지를 사용하는 산업적 발효 공정을 위한 적당한 미생물 균주는 또한 그 결과된 돌연변이체 또는 형질전환된 미생물 균주가 화학적 합성 배지 상에서 좋은 생장 성능을 갖는다면 관심의 부모 균주를 고전적인 돌연변이유발 처리 또는 재조합 DNA 형질전환 시켜 획득된 그리고/또는 향상된 균주가 될 수 있다. 결과된 돌연변이체 또는 형질전환된 균주들이 부모 균주의 그것에 비교하여 향상된 또는 유사한 화학적 합성 배지상에서의 생장 성능을 갖는지 여부는 화학적 합성 배지 상에서의 부모 균주의 생장 성능에 달려있을 것이다.
상기 균주가 화학적 합성 배지 상에서 0.05h-1이상, 바람직하게는 0.1h-1이상, 더 바람직하게는 0.2h-1이상, 가장 바람직하게는 0.4h-1이상인 특정 생장률(μ)을 갖을 때 화학적 합성 배지상에서 좋은 생장 성능을 갖는다고 이해된다. 화학적 합성 배지 상에서의 미생물 균주의 생장 성능은 예컨대 진탕 플라스크 배양 및/또는 10L 벤치 발효 등의 상대적으로 작은 규모로 상기 균주를 화학적 합성 배지에서 발효시킴으로써 간편하게 분석할 수 있다. 상기 생장 성능 분석에 있어서 pH, 온도 및 산소 농도 조절과 함께 10L 벤치 발효를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 구체예에서 관심의 부모 균주를 UV조사 등의 물리적 수단, N- 메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 술폰산 에틸메탄 등의 적당한 화학적 돌연변이원을 사용하는 고전적인 돌연변이유발 처리하여 화학적 합성 배지에서 발효될 수 있는 미생물 균주들을 얻고 그리고/또는 개량한다. 본 발명의 또다른 구체예에서 관심의 부모 균주를 재조함 DNA 기술을 적용시킴으로써 부모 균주가 관심의 하나이상의 기능성 유전자로 형질전환되어 화학적 합성 배지에서 발효될 수 있는 미생물 균주들을 얻고 그리고/또한 개량한다.
일반적으로 본 발명은 고전적인 돌연변이유발 및/또는 DNA 형질전환 시키는 관심의 부모 균주들의 두 그룹을 구상한다. 본 발명의 한 구체예에서는 관심의 한 부모 균주가 화학적 합성 배지 상에서 좋은 생장 성능을 갖지만 원하는 화합물의 생산성 레벨에 관하여는 향상될 필요가 있는 균주들의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또다른 구체예에서는 관심의 부모 균주가 원하는 화합물의 생산성 레벨은 높으나 화학적 합성 배지상에서의 생장 성능이 상대적으로 나쁜 균주들의 군으로부터 선택된다. 약 0.05h-1 미만의 특정 생장율을 갖는 미생물 균주들이 화학적 합성 배지상에서의 생장 성능이 상대적으로 나쁜 것으로 이해된다.
고전적인 돌연변이유발 처리 뿐만 아니라 DNA 형질전환 공정 모두 그 후에 화학적 합성 배지 상에서의 그들의 생장 성능 뿐만 아니라 그들의 원하는 화합물의 생산성 레벨 둘다에 대해 결과된 돌연변이체 또는 형질전환체들을 스크리닝한다. 부모 균주와 비교하여 화학적 합성 배지 상에서 좋은 생장 성능 및/또는 관심의 화합물의 향상된 생산성 레벨을 갖는 돌연변이체 균주 또는 형질전환체가 선택된다.
일부 미생물 균주들, 구체적으로 생산성 레벨을 향상시키기 위해 극도의 돌연변이유발 처리를 이미 받은 산업적 균주들이 화학적 합성 배지에서 생장 성능이 나쁘거나 전혀 생장하지 않는다는 것을 주목해야 한다. 그러한 돌연변이유발된 균주의 나쁜 생장 성능 또는 그 결여는 화학적 합성 배지 상에서의 생장이 적절한 돌연변이체들의 선택을 위한 기준으로서 적용될 수 없다는 사실로 초래된 것이다. 예컨대 돌연변이된 균주는 알려지지 않은 생장 요구를 유발하는 돌연변이를 가질 가능성이 있다(알려지지 않은 영양요구성 돌연변이).
화학적 합성 배지를 사용하는 산업적 발효에 적당한 미생물 균주들은 사상 및 비-사상 균주들을 포함한다. 예컨대 화학적 합성 배지에서의 발효에 적당한 미생물 균주들은 Aspergillus, Penicillium 또는 Mucorales 등의 균류 균주들, Saccharomyces, Pichia, Phaffia 또는 Kluyveromyces 등의 효모 균주들, 및 Actinomycetes 등의 박테리아 균주들을 포함한다. 본 발명에 따른 화학적 합성 배지의 사용은 사상 미생물들의 산업적 발효에 특히 유익하다.
화학적 합성 배지를 사용하는 본 발명에 따른 공정은 일차 또는 이차 대사산물, 약제학적 단백질들 또는 펩티드들 또는 산업적 효소들을 포함하는 관심의 어떤 가치있는 화합물을 산업적 규모로 발효적 생산하는 데에 적당하다. 바람직한 가치있는 화합물들은 항생제들 또는 β-락탐 화합물들, 특히 β-락탐 항생제 등의 이차 대사산물이다.
균주-생성물 조합의 예는 아밀로글루코시다제를 위한 A. niger 예컨대 A. niger CBS 513.88 , α-아밀라제를 위한 A. oryzae, 로바스테틴(lovastatin)을 위 한 A. terreus 예컨대 A. terreus CBS 456.95, 아라키돈산 또는 하라키돈산을 함유하는 지질을 위한 Mortierella alpina, 프로테아제를 위한 Mucor miehei, β-락탐 화합물들(페니실린 G 또는 V)을 위한 P. chrysogenum 예컨대 P. chrysogenum CBS 455.95 또는 다른 적당한 균주들, 클라불란산을 위한 Streptomyces clavuligerus 예컨대 S. clavuligerus ATCC 27064, 테트라아세틸파이토스핑고신을 위한 Pichia ciferrii 예컨대 P. ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10, 아스탁산틴을 위한 Phaffia rhodozyma 예컨대 P. rhodozyma CBS 6938, 에리쓰로마이신을 위한 Saccharopolyspora erythraea, 락타제를 위한 K. lactis, 나타마이신을 위한 Streptomyces natalensis를 포함한다.
또한 본 발명은 상기 균주들에 의해 이미 생산된 생성물을 과잉발현시키는 형질전환된 균주로 귀결되거나 상기 균주에 의해 자연적으로 생산되지 않는 생성물을 발현하는 형질전환된 균주로 귀결되는 원하는 하나이상의 기능성 유전자를 갖도록 형질전환된 미생물 균주들의 이용을 구상한다.
결과로써 상기 선택된 균주가 화학적 합성 배지 상에서 좋은 생장 성능을 갖는다면 형질 전환을 위해 선택된 균주를 당업자가 선택하는 것만이 남는다. 예컨대 이미 하나이상의 돌연변이유발 처리를 받은 한 균주가 형질전환을 위해 선택될 수도 있다. 그렇지 않으면 비-돌연변이된 또는 야생형 균주가 선택될 수도 있다. 원하는 화합물의 발현 레벨 분석 후 원하는 하나 이상의 기능성 유전자를 갖는 선택된 균주의 형질전환 후 얻어진 형질전환체가 화학적 합성 배지상에서의 그들의 생장 성능을 위해 분석되어야 한다.
상기 균주에 의해 자연적으로 생산되지 않는 생성물을 생산하는 재조합 균주들의 실시예들이 다음과 같다.
* 예컨대 Actinoplanes missouriensis로부터 기원한 글루코스 이소머라제를 코딩하는 유전자를 가져서 글루코스 이소머라제의 발현을 가능케하는 발현 카세트를 함유하는 Streptomyces lividans 예컨대 S. lividans TK21.
* 아디프산(EP 532341 참조) 또는 3-카르복시메틸티오-프로피온산(WO95/04148 참조)을 사이드 체인 전구체로서 사용하여 7-ADCA 또는 7-ACA 등의 세팔로스포린 화합물들의 생산을 가능케하는 예컨대 Acremonium chrysogenum 또는 Streptomyces clavuligerus 등으로부터 기원한 엑스팬다제, 히드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 가져서 엑스팬다제 및 선택적으로 히드록실라제 및/또는 아세틸트랜스퍼라제의 발현을 가능케하는 하나이상의 발현 카세트를 함유하는 Penicillium chrysogenum 예컨대 P. chrysogenum CBS 455.95.
* 인간 락토페린(WO93/22348 참조) 또는 소 키모신의 발현을 가능케하는 발현 카세트를 함유하는 Aspergillus niger 예컨대 Aspergillus niger CBS 513.88.
* 소 키모신 또는 포스포리파제A2, 인슐린 또는 재조합 인간 알부민의 발현을 가능케하는 발현 카세트를 함유하는 Kluyveromyces lactis.
상기 균주에 의해 이미 생산된 효소를 과잉생산하는 재조합 균주들의 예는 다음과 같다:
* 피타제(phytase)(EP 420358 참조) 또는 엔독실라나제I(EP 463706참조)의 과 잉발현을 가능케하는 발현 카세트를 함유하는 A. niger 예컨대 A. niger CBS 513.88.
본 발명은 재조합 Streptomyces 균주에 의한 글루코스 이소머라제 생산을 위해 화학적 합성 배지를 사용하는 산업적 규모의 발효 공정과 복합 배지와 비교하여 자르지(jarge) 규모의 Penicillium 발효를 위해 화학적 합성 배지의 유익한 사용으로 예를 든다.
부가적인 예는 화학적 합성 배지에서 산업적 규모로 가치있는 화합물을 발효적 생산하는 데에 적합한 미생물 균주들을 동정하기 위해 그러한 배지에서 작은 규모로 생장될 때 원하는 균주의 생장 성능 및 생산성을 측정하는 데에 이용될 수 있는 화학적 합성 배지에 관한 것이다.
도1. pWGx.GIT의 개요
도2. 발효 동안 생산된 총 글루코스 이소머라제의 변화
실시예1
Streptomyces lividans 를 사용하는 글루코스 이소머라제의 산업적 생산
글루코스 이소머라제를 생산하는 Streptomyces 균주의 구성
Actinoplanes missouriensis의 글루코스 이소머라제 유전자를 5.0kb의 DNA 단편으로서 E. coli K12 균주 JM101에서 최초로 클론하였다.
5.0kb단편 내부의 1.7kb단편이 A. missouriensis의 글루코스 이소머라제의 완전한 코딩 서열 및 그것의 상류 조절 영역을 나타낸다는 것이 밝혀졌다(Amore and Hollenberg (1989), Nucl. Acids Res. 17, 7515 참조).
글루코스 이소머라제 유전자 내에서 글루코스 이소머라제 단백질의 위치 253인 리신을 코딩하는 트리플렛 AAG를 아르기닌을 코딩하는 CGG로 교체함으로써 증가된 열안정성을 보이는 글루코스 이소머라제 돌연변이체를 얻었다(Quax et al. (1991), Bio/Technology 9, 738-742).
Streptomyces에서의 클로닝을 위해 플라스미드 pIJ486(Ward et al.(1986), Mol. Gen. Genet. 203, 468-478)을 벡터로서 사용하였다. 글루코스 이소머라제를 코딩하는 1737bp의 A. missouriensis의 DNA 단편을 pIJ486의 큰 PstI DNA 단편과 조합하였다. 그 결과된 플라스미드 pWGx.GIT는 본질적으로 플라스미드 pIJ101의 복제 영역, 티오스트렙톤 저항성 유전자 및 GIT를 코딩하는 A. missouriensis DNA 단편을 함유하였다. pWGx.GIT의 도식적 지도를 도1에 나타냈다.
글루코스 이소머라제 생산 균주는 플라스미드 pWGx.GIT를 갖는 Streptomyces lividans 균주 TK21(Hopwood et al.(1985), Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, England)의 형질전환에 의해 구성되었다.
글루코스 이소머라제의 산업적 생산
티오스트렙톤 저항성 콜로니를 집어서 30℃에서 40-48시간동안 100ml의 진탕 플라스크 내의 티오스트렙톤(50mg/L)을 함유하는 20ml의 Tryptone Soytone Broth에서 생장시키고 280rpm으로 진탕배양 함으로써 실시예1에서 언급한 것과 같이 구성 된 생산 균주의 작동 셀 뱅크를 제조하였다.
작동 셀 뱅크(신선한 것 또는 -80℃에서 냉동된 균사체로서 저장된 것) 1ml에 상당하는 균사체를 16g/L Bactopeptone (Difco 0123/01), 4g/L Bacto soytone (Difco 0436/01), 20g/L의 Casein hydrolysate (Merck 2239), 10g/L의 인산 이칼륨.3aq(Merck, Anal. Reagent), 16.5g/L의 글루코스.1aq, 0.6g/L의 콩기름 및 50mg/L의 티오스트렙톤을 함유하는 500ml의 진탕 플라스크 내의 100ml의 접종물 생장 배지에 접종하였다. 그 배지의 pH는 멸균에 앞서 수산화나트륨 및/또는 황산으로 7.0에 맞추었다. 글루코스 및 티오스트렙톤은 멸균 후 분리하여 첨가하였다. 티오스트렙톤은 50g/l의 농도로 DMSO에 용해시키고 0.2μm Nalgene 필터로 여과하여 멸균하였다. 그 배양액을 30℃에서 24시간 동안 인큐베이터 진탕배양기에서 280rpm으로 생장시켰다.
다 자란 배양액 50ml를 두배의 글루코스 농도(33g/L 글루코스.laq), 여분의 소포제(SAG5693, 0.6g/L; Basildon 회사로부터 구입한 규소 소포제) 및 티오스트렙톤의 부재를 제외하고 상기 언급한 배지와 유사한 조성을 갖는 6L의 두번째 상의 접종물 생장 배지로 옮겼다. 글루코스를 다시 개별적으로 50% 용액으로 멸균하고 그 배지의 멸균 후(60분, 121℃) 첨가하였다. 그 배양액을 2mm의 직경을 갖는 4개의 구멍들을 포함하는 노즐을 갖추고 시간당 840L의 무균 공기로 쐬인 멸균된 기포 컬럼 안에서 36시간 동안 배양하고 그 온도를 22℃로 유지하였다. 그렇지 않으면 이 상을 유사한 접종 비율들로 진탕 플라스크(예컨대 2L의 방지판을 갖춘 에를렌마이에르 플라스크 안에 12x 500ml 배지) 안에서 수행하고 오비탈 진탕배양기 인큐베 이터 안에서 280rpm으로 진탕배양 할 수 있다.
16.3kg의 시트르산.1aq, 70.8g의 황산-철.7aq, 109g의 황산-아연.7aq, 109g의 황산-망간.1aq, 32.7g의 이염화-코발트.6aq, 5.45g의 몰리브덴산 이나트륨.2aq, 5.45g의 붕산, 5.45g의 황산-구리.5aq, 10.9kg의 황산-이암모늄, 10.9kg의 황산-마그네슘.7aq, 463g의 염화-칼슘.2aq, 1090g의 콩기름, 21.8kg의 인산-일칼륨 및 139kg의 글루코스.1aq 및 5.9kg의 효모 추출물(건조 중량을 기초로 10%의 Kjeldahl 질소를 갖는 맥주 효모)을 함유하는 4.5㎥의 접종물 배지를 함유하는 접종물 발효기로 다 자란 배양액을 무균적으로 옮겼다. 그 배지는 하기와 같이 제조하였다: 글루코스를 제외한 모든 구성성분들을 약 2700L의 수돗물 안으로 지시된 순서로 투입하였다. 그 pH를 수산화 나트륨 및/또는 인산으로 4.5에 맞추고 그 배지를 122℃에서 60분간 멸균하였다. 글루코스를 pH4.5의 물 1000L에서 60분간 122℃로 개별적인 용기에서 멸균하였다. 두 부분 모두를 냉각 후 그 글루코스를 무균적으로 접종물-용기로 옮겼다. 두 부분을 혼합한 후 그 pH를 암모니아로 7.0에 맞추고 그 부피를 무균의 물로 4.5㎥에 맞췄다. 발효 온도는 30℃로 조절하고 pH를 기체 암모니아로 7.0 +/-0.1로 유지하고 과잉압력을 1.3 내지 1.4bar로 유지하면서 그 발효기는 0.5 내지 1.0vvm으로 공기를 쐬었다. 거품은 필요시 콩기름 및 SAG5693 등의 규소 소포제를 3:1의 비율로 혼합한 멸균된 혼합물로 조절하였다. 산소 농도는 교반기 속도를 적정화함으로써(0.5 내지 3Kw/㎥) 25% 이상의 공기-포화도를 유지하였다. 그 배양액을 모든 글루코스가 소비되기 전에(모든 상기한 생장 상들에서와 같이) 그리고 산소 흡수율이 시간당 1 육즙 부피당 30mmol의 레벨을 초과하기 전에 주요 발효로 옮겼다.
주요 발효 배지는 245.1kg의 시트르산.1aq, 1062g의 황산-철.7aq, 1634g의 황산-아연.7aq, 1634g의 황산-망간.1aq, 490g의 이염화-코발트.6aq, 82g의 몰리브덴산-이나트륨.2aq, 82g의 붕산, 82g의 황산-구리.5aq, 163.4kg의 황산-이암모늄, 163.4kg의 황산 마그네슘.7aq, 6.94kg의 이염화-칼슘.2aq, 16.3kg의 콩기름, 327kg의 인산-일칼륨, 880kg의 맥주 효모 추출물(건조 중량에 기초하여 10%의 Kj-N) 및 556kg의 글루코스.1aq를 함유한다. 그 배지를 접종물 발효를 위해 기재한 대로 제조하였다(글루코스는 개별적으로 멸균하였다). 글루코스를 위해 DE-95 설탕 시럽을 대안으로 사용할 수 있다. 접종 전에 그 배지의 부피는 pH를 암모니아로 7.0에 맞춘 후에 65㎥이다.
글루코스.1aq 또는 90-DE-시럽으로부터 얻은 글루코스 등가물로서 글루코스 피드를 275 내지 550g의 글루코스/L 피드 용액으로 제조하였다. 그 pH를 인산 용액으로 4.5 내지 5.0에 맞추었다. 멸균을 열쇼크 또는 여과세트를 통해 회분식(122℃, 45분) 또는 연속적으로 행하였다.
주요 발효는 30℃ +/-0.5 및 pH 7.0+/-0.1(암모니아 및 인산을 사용하여 pH 조절)로 조절하였다. 기류는 0.5 내지 1.5vvm, 바람직하게는 0.7vvm로 장치하고, 과잉압력은 0.5 내지 1.5bar로 하고 그 발효기를 Rushton turbines를 사용하여 산소 농도가 교반기 높이의 바닥에서 측정시 0.2mmol/L미만으로 떨어지지 않도록 하기 위해 0.5 내지 3Kw/㎥의 강도로 교반하였다. 산소 흡수율이 갑자기 떨어질 때 그리고 용해된 산소 농도가 증가할 때, 뿐만 아니라 pH가 6.9 내지 7.1일 때 글루 코스 피드를 시작하였다. 육즙에 있는 글루코스 농도는 이 시점에서 << 0.2g/L이어야 한다.
글루코스 피드속도는 처음에는 93kg글루코스/h에 상당하였다가 리니어하게 증가시켜 피드를 시작하고 64시간 후에는 186kg/h로 하였다. 100 피딩 시간 후 186kg/h인 피드 속도가 약200피드시간이 될 때 까지 298kg 글루코스/h로 증가시켰다.
거품 생성은 무균 콩기름을 5.5kg/h로 투여하거나 그렇지 않으면 발효의 처음 100시간 동안 매8시간마다 45kg의 투입으로 조절하였다. 필요시 또다른 거품 조절을 콩기름 및 SAG471 등의 규소 소포제(Basildon 제 규소 소포제)를 3:1의 비율로 혼합한 혼합물로 행하였다.
암모니아 농도를 매 12시간 마다 측정하여 그 레벨이 1000mg/L미만으로 떨어지면 바로 500mg 암모니아/L에 상당하는 무균의 황산 암모늄을 첨가함으로써 750 내지 1500mg/L 사이로 유지하였다.
배양액 여과물의 인산염 농도는 500mg/L에 상당하는 무균의 인산 일칼륨을 첨가함으로써 500mg PO4/L보다 높게 유지하여야 한다.
글루코스 이소머라제의 생산성을 육즙으로부터 수득하고 정제한 단백질로서 당업계에 공지된 단백질 측정 방법에 의해 측정할 수 있고 또는 안정화된 육즙 샘플 상에 적용되는 효소적 분석으로 분석될 수 있다. 그 육즙 샘플들은 2g의 육즙에 12g/L의 트리스-히드록시메틸아미노메탄 및 2.4g/L의 CoCl2·6aq를 함유하는 안정제 용액 5ml를 첨가하고 이어서 73℃에서 30분간 가열하여 안정화시켰다. 냉각 후 안정화된 샘플의 0.42ml를 0.8ml 글루코스 용액(27.25g/L의 트리스/염산 버퍼 pH 8.2, 글루코스 67.56g/L, MaCl2.6aq, 22.33g/L의 Na2-EDTA.2aq 및 5mg/L의 트리톤 X-100을 함유)과 혼합하고 60℃에서 인큐베이션시켰다. 그 활성을 글루코스에서 프룩토스로의 전환률을 측정하여 결정하였고 GU/g(1GU는 분당 1μmole의 프룩토스의 형성을 위해 필요한 효소의 양이다)로 표현하였다. 단백질 1mg 당 12 유니트의 특정 활성을 사용하여 육즙 1kg 당 단백질의 양을 결정할 수 있었다.
도2에서 생산된 효소의 총 양이 제시되어 있다.
이 실시예에서 증명한 대로 한번의 유가 생산 작동에 있어서 효소 850kg이 생산될 수 있다.
실시예2
페니실린V의 생산
P. chrysogenum CBS 455.95(또는 더 높은 생산성을 위한 돌연변이 및 셀렉션에 의해 , 바람직하게는 하기 기술할 방법으로 Wisconsin 54.1255로부터 유도된 또다른 적합한 균주)의 분생자포자를 하기 내용물을 함유하는(g/l) 생산 배지에 10E5 내지 10E6 분생자/ml로 접종하였다: 글루코스.H2O, 5; 락토스.H2O, 80; (NH2) 2CO, 4.5; (NH4)2SO4, 1.1; Na2SO4, 2.9; KH2PO 4, 5.2; K2HPO4.3H2O, 4.8; 미량원소 용액(시트르산.H2O, 150; FeSO4.7H2O, 15; MgSO4.7H2O, 150; H3BO3, 0.0075; CuSO4.5H2O, 0.24; CoSO4.7H2O, 0.375; ZnSO4.7H2O, 1.5; MnSO4.H 2O, 2.28; CaCl2.2H2O, 0.99), 10 (ml/l); 10% 페녹시아세트산 칼륨 용액, pH 7, 75(ml/l). (멸균 전의 pH가 6.5).
그 배양액을 오비탈 진탕배양기안에서 280rpm으로 144 내지 168시간동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 발효가 끝나고 균사체를 원심분리 또는 여과에 의해 제거하여 그 양을 정량하고 그 배지를 당업계에서 잘 알려진 HPLC 방법에 의해 생성된 페니실린에 대해 분석하였다.
실시예3
복합 및 합성 배지를 사용하는 큰 규모의 Penicillium 발효
Penicillium chrysogenum Wisconsin 54.1255를 실시예2에 기술된 바와 같이 합성 배지 상에서 돌연변이 및 셀렉션에 의해 화학적 합성 배지 상에서의 생장 및 페니실린 생산을 위해 최적화하였다. 유가 발효를 50kg/㎥의 콘 스팁 솔리드를 함유하는 Hersbach et al.(산업적 항생제들의 바이오테크놀로지 pp 45-140, Marcel Dekker Inc. 1984, 표4, 배지A 하에서 언급된 바와 같은 염들을 포함하는 배지B)에 의해 기술된 복합 배지로 60㎥-규모 상에서 수행하였다. 이것과 병행하여 실시예2에 주어진 합성 배지에서 발효를 수행하였는데, 락토스와 유레아가 빠지는 반면 이러한 유가 발효의 고 세포 밀도 특성 때문에 투여량을 두배로 하였다. 글루코스 억제현상을 피하기 위해 2g/L미만으로 글루코스 농도를 유지하면서 그 발효기에 글루코스를 피딩하였다. 암모늄, 황산-이암모늄 및 아세트산-페닐을 pH 및 암모늄, 황산염 및 페닐아세트산의 농도를 원하는 범위로 조절하기 위해 그 발효기에 피딩하 였다(Hersbach 1984).
산업 발효 공정의 경제성을 결정하는 중요한 파라미터가 산소 전달이기 때문에 상기 발효 공정의 성능을 각 공정에서 산소 전달 정도를 측정함으로써 분석하였다.
발효 공정에서 얻은 산소 전달을 위한 좋은 측정은 하나의 시스템 내에서 측정된 상대적인 kLa값이다. kLa는 산소 전달 계수로서 정의되는 데 van't Riet and Tramper(Basic Biorector Design, Marcel Dekker Inc.(1991),pp.236-273)에 따라 계산하였다.
그 kLa값으로 계산된 산소 전달능이 발효의 주요부 동안 복합 배지에서 보다 화학적 합성 배지에서 10 내지 20% 더 높은 것으로 밝혀졌다.
실시예4
7-ADCA의 생산
실시예 2에 기술한 공정을 EP 532341에 기술된 대로 IPNS 프로모터를 갖는 엑스팬다제 코딩 영역이 있는 엑스팬다제 발현 카세트로 형질전환된 P. chrysogenum CBS 455.95(또는 더 높은 생산성을 위해 돌연변이 및 셀렉션에 의해 , 바람직하게는 하기 기술할 방법으로 Wisconsin 54.1255로부터 유도된 또다른 적합한 균주)를 사용하고 페녹시아세트산염 대신 10% 아디프산 칼륨 용액을 사용하고 페녹시아세트산염 대신 pH 5.5의 10% 아디프산 칼륨 400ml를 함유하는 상기 배지의 변형 (멸균 전 배지의 pH가 6.5 대신 5.5)을 사용함으로써 변형하였다.
그 결과된 아디포일-7-ADCA는 이어서 본질적으로 WO95/04148의 실시예4 또는 5에서 기술한 것과 같은 효소적 탈아실화 공정을 사용하여 7-ADCA로 변환하였다.
실시예5
로바스테틴의 생산
분생자포자 또는 Aspergillus terreus 균주 CBS 456.95(또는 더 높은 생산성을 위해 돌연변이 및 셀렉션에 의해, 바람직하게는 하기 기술될 방법들 중 하나로 유도된 균주들)를 하기를 함유하는(g/l) 생산 배지에 10E5-10E6 분생자/ml로 접종하였다: 덱스트로스, 40; CH3COONH4, 2.2; Na2SO4, 4; KH2 PO4, 3.6; K2HPO4.3H2O, 35.1; 미량원소 용액(상기 실시예2 참조), 10(ml/l).
그 배양액을 28℃에서 144 내지 168시간동안 오비탈 진탕배양기 안에서 220rpm으로 인큐베이션시켰다. 발효가 끝나고 그 균사체를 원심분리 또는 여과로 제거하여 그 양을 정량하고 그 배지를 당업계에 잘 알려진 HPLC 방법에 의해 생성된 로바스테틴에 대해 분석하였다.
실시예6
클라불란산의 생산
Streptomyces clavuligerus 균주 ATCC 27064 또는 그 돌연변이체를 하기(g/l)로 이루어지는 전배양액 배지에 접종하였다:(NH4)2SO4, 2.75; KH2PO4, 0.5; MgSO4.7H2O, 0.5; CaCl2.2H2O, 0.01; 3-(N-모르폴리노), 프로판술폰산, 21; 글리세롤, 19.9; 숙신산 나트륨, 5.5; 미량원소 용액(ZnSO4.7H2O, 2.8; 시트르산 암모늄 철, 2.7; CuSO4.5H2O, 0.125; MnSO4.H2O, 1; CoCl2.6H 2O, 0.1; Na2B4O7.10H2O, 0.16; Na2MoO4.2H2O, 0.054), 0.06(ml/l).
그 배양액을 28℃에서 48 내지 72시간 동안 220rpm로 오비탈 진탕 배양기 안에서 인큐베이션시키고 하기를 함유하는(g/l) 생산 배지의 20부피에 접종하였다: (NH4)2SO4, 2; 아스파라긴, 4; KH2PO4, 1.5; MgSO 4.7H2O, 0.5; CaCl2.2H2O, 0.01; 3-(N-모르폴리노), 프로판술폰산, 21; 글리세롤, 19.9; 숙신산 나트륨, 5.5; 미량원소 용액(상기 참조), 0.06(ml/l); FeSO4.7H2O, 0.5; MnCl2.4H2O, 0.1; ZnSO4.7H2O, 0.1.
그 인큐베이션을 바람직하게는 배양액 50ml를 함유하는 방지판을 갖춘 500ml의 에를렌마이에르 플라스크에서 144시간 동안 지속하였다. 발효가 끝나고 그 균사체들을 원심분리 또는 여과로 제거하고 그 양을 정량하고 그 여과물을 당업계에서 잘 알려진 HPLC 방법에 의해 분석하였다.
실시예7
아밀로글루코시다제의 생산
Aspergillus niger 균주 CBS 513.88 또는 그 돌연변이체를 하기를 함유하는(g/l) 발육 배지에 105 내지 106 분생자포자/ml로 접종하였다: K2HPO 4.3H2O, 0.75; KH2PO4, 6.6; Na3시트르산염.3H2O, 5.3; 시트르산.H2O, 0.45; 글루코스.H2O, 25; .(NH4)2SO4, 8; NaCl, 0.5; MgSO4.7H2O, 0.5; FeSO4.7H2O, 0.1; ZnSO4.7H2O, 0.05; CaCl2, 0.005; CuSO4.5H2O, 0.0025; MnSO4.4H2O, 0.0005; H3BO3, 0.0005; Na2MoO4.2H2O, 0.0005; EDTA, 0.13; Tween80, 3. 필요시 발육을 향상시키기 위해 50μg/ml의 아르기닌 및/또는 프롤린을 첨가할 수 있다.
그 배양액을 33℃에서 48 내지 72시간 동안 295rpm으로 오비탈 진탕 배양기 안에서 인큐베이션시키고 하기를 함유하는(g/l) 생산 배지의 10 내지 20부피에 접종하였다: KH2PO4, 1-5; NaH2PO4.H2O, 0.5; Na3시트르산염.3H 2O, 53; 시트르산.H2O, 4.05; 덱스트로스 폴리머 70; (NH4)2SO4, 8; (NaCl, MgSO4.7H 2O, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CaCl2, CuSO4.5H2O, MnSO4.4H 2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, EDTA):발육 배지와 같다.
그 인큐베이션을 바람직하게는 배지 100ml를 함유하는 500ml의 에를렌마이에르 플라스크에서 96시간 동안 지속하였다. 발효가 끝나고 그 균사체들을 원심분리 또는 여과로 제거하여 그 양을 정량하고 그 여과물을 전분분해의 활성에 대하여 분석하였다.
실시예8
아스탁산틴의 생산
Phaffia rhodozyma 균주 CBS 6938 또는 그 돌연변이체를 효모 추출물, 10; 펩톤, 20; 글루코스, 20을 함유하는(g/l) 25ml의 전배양액 배지에 접종하였다: 그 배양액을 20℃에서 72시간 동안 275rpm으로 오비탈 진탕 배양기 안의 방지판을 갖춘 100ml의 에를렌마이에르 플라스크에서 인큐베이션시켰다.
전배양액 1ml를 하기를 함유하는(g/l) 생산 배지 100ml에 접종하였다: 글루코스, 30; NH4Cl, 4.83; MgSO4.7H2O, 0.88; NaCl, 0.06; CaCl2.6H 2O, 0.15; 미량원소 용액(0.4N H2SO4에; 시트르산.H2O, 50; (NH4)2Fe(SO 4)2.6H2O, 90; ZnSO4.7H2O, 16.7; CuSO4.5H2O, 2.5; MnSO4.4H2O, 2; H3BO3, 2; Na2MoO4.2H2O,2; KI, 0.5), 0.3(ml/l); 비타민 용액(0.07N의 H2SO4에; 미오-이노시톨, 40; 니코틴산, 2; Ca-D-판토텐산염, 2; 비타민B1, 2; p.아미노벤조산, 1.2; 비타민 B6, 0.2; 비오틴 0.008) 1-5(ml/l); 플루로닉, 0.04; KH2PO4, 1; 프탈산 수소 칼륨, 20(멸균 전 pH가 5.4).
그 인큐베이션을 바람직하게는 방지판을 갖춘 500ml의 에를렌마이에르 플라스크에서 96시간 동안 지속하였다. 발효가 끝나고 바이오매스의 아스탁산틴 함유량(정량된 양)을 용매 추출을 하고 470 내지 490nm에서 그 추출물의 광학적 밀도를 측정함으로써 결정하였다.
실시예9
아라키돈산의 생산
-80℃에서 저장된 Mortierella alpina 균주 ATCC 16266의 현탁액인 1ml 바이알 하나를 무균적으로 열고 그 내용물을 하기를 함유하는(g/l) 생산 배지 500ml에 접종하였다: 글루코스, 70; 효모 추출물 0.5; NH4NO3, 3.0; KH2PO4, 7.2; MgSO4.7H2O, 1.5; 미량원소 용액(0.4N H2SO4에; 시트르산.H2O, 50; (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O, 90; ZnSO4.7H2O, 16.7; CuSO4.5H2O, 2.5; MnSO4.4H2O, 2; H3BO3, 2; Na2MoO4.2H2O, 2; KI, 0.5), 0.3(ml/l); (멸균전 pH가 7.0).
그 배양액을 25℃에서 72시간 동안 250rpm으로 오비탈 진탕배양기안의 방지판을 갖춘 2리터의 진탕 플라스크에서 인큐베이션하였다. 발효가 끝나고 원심분리, 냉동 건조 및 용매 추출 후 당업계에 잘 알려진 GC방법에 의해 바이오매스의 양 및 바이오매스의 아라키돈산 함유량을 결정하였다.
실시예10
에리쓰로마이신의 생산
Saccharopolyspora erythraea 균주 NRRL2338 또는 그 돌연변이체(증가된 생산성을 위해 선택된, 바람직하게는 하기 기술한 방법으로)를 하기를 함유하는 (g/l) 25ml의 전배양액 배지에 접종하였다: 용해성 녹말, 15; NaCl, 5; 대두 가루, 15; CaCO3, 10; 효모 추출물, 5; 콘 스팁 솔리드, 5; CoCl2.6H2O, 1g/l용액 670μl.
그 배양액을 32 내지 34℃에서 3일간 250rpm으로 진탕배양기-인큐베이터안의 방지판 없는 100ml의 진탕 플라스크안에서 인큐베이션하였다.
그 배양액의 0.4ml를 하기를 함유하는 (g/l) 25ml의 무균 생산 배지에 접종하였다: 시트르산.H2O, 2; (NH4)2SO4, 2; MgSO4.7H 2O, 2; CaCl2.2H2O, 0.085; KH2PO4, 0.25; HEPES(=N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 5; 글루코스, 1.5; 용해성 녹말, 20; 콩기름, 0.4; 미량원소 용액(증류수 250ml에 존재하는 그램: 시트르산.H2O, 62.5; FeSO4.7H2O, 0.8215; CuSO4.5H2O, 0.0625; CoCl2.H2O, 0.375; H3BO3, 0.0625; ZnSO4.7H2O, 1.25; MnSO4.H2 O, 1.25; Na2MoO4.2H2O, 0.0625), 3.6ml/l. pH=7.0. 각 플라스크에 0.25ml의 n-프로판올을 첨가하였다.
그 배양액을 32 내지 34℃에서 5일간 300RPM으로 진탕배양기-인큐베이터에서 방지판 갖춘 100ml의 진탕 플라스크에서 인큐베이션하였다. 발효가 끝나고 그 육즙을 원심분리하고 바이오매스의 양을 측량하였다. 그 청징액의 에리쓰로마이신 함유량을 당업계에 알려진 HPLC 방법에 의해 측정하였다.
실시예11
β-카로틴의 생산
Blakeslea trispora CBS 130.59의 포자 현탁액을 방지판 없는 500ml의 진탕 플라스크안의 114ml의 전배양액 배지(효모 추출물 10g/l; 펩톤 20g/l; 글루코스 20g/l)에 접종하였다. 그 전배양액을 26℃에서 250rpm으로 회전 진탕배양기 상에서 42시간동안 인큐베이션하였다. 그 바이오매스를 여과로 수득하고 100ml의 무균의 탈염수로 3회 세척하여 전배양액 배지의 구성성분들을 제거하였다. 이어서 단지 작은 단편들만이 남을 때 까지 그 바이오매스를 블렌더링으로 균질화하고 40ml의 탈염수에 재현탁시켰다.
그 생산 배지를 방지판 갖춘 500ml의 진탕 플라스크의 100ml 부분에서 제조하였다. 생산 배지의 조성은 하기와 같다(g/l): 글루코스, 40; 아스파라긴 일수화 물, 2; KH2PO4, 0.5; MgSO4.7H2O, 0.25. 뿐만 아니라 하기 조성을 갖는(g/l) 미량원소 용액을 첨가하였다(0.3ml/l): 0.4N H2SO4에; 시트르산.H2O, 50; (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O, 90; ZnSO4.7H 2O, 16.7; CuSO4.5H2O, 2.5; MnSO4.4H2O, 2; H3 BO3, 2; Na2MoO4.2H2O, 2; KI, 0.5. 멸균 전 그 배지의 pH를 6.2에 맞추었다. 그 플라스크를 120℃에서 20분간 멸균하고 멸균 후 탈염수 상의 티아민 히드로클로라이드 1mg/ml 용액 0.05ml(여과로 멸균됨)을 첨가하였다.
그 생산 배양액에 상기 제조한 단편화된 균사체의 현탁액 0.5 내지 10ml를 접종하였다. 그 배양액을 회전 진탕배양기(250rpm; 26℃) 상에서 139시간동안 인큐베이션하였다. 그 균류의 바이오매스를 여과에 의해 수득 후 탈염수로 세척하여 배지 구성성분들을 제거하고 측량하였다.
생산된 β-카로틴의 양을 아세톤 추출 및 분광광도계로 아세톤 분획의 450nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.




Claims (35)

  1. 글루코스, 락토스, 프룩토스, 수크로스, 말토덱스트린, 녹말 및 이눌린 등의 탄수화물류, 글리세롤, 식물성 오일류, 탄화수소류, 메탄올 및 에탄올 등의 알코올류, 아세테이트 및 고급 알카노산 등의 유기산류로 이루어지는 군으로부터 선택된 탄소원과, 유레아, 암모니아, 질산염, 황산 암모늄, 인산 암모늄 및 질산 암모늄 등의 암모늄염류 및 글루타메이트 및 리신 등의 아미노산류로 이루어지는 군으로부터 선택된 질소원을 포함하는 화학적 합성 발효 배지에서 ≥10 m3 부피 규모로 사상 미생물 균주를 발효시키는 단계와, 발효 육즙으로부터 가치있는 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 가치있는 화합물의 제조방법에 있어서, 가치있는 화합물은 약제학적 단백질 또는 펩티드, 일차 또는 이차 대사산물, 또는 산업적 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 화학적 합성 배지에서 화학적 합성 배지에 존재하는 탄소 및/또는 질소 총량의 10% 이하의 양은 복합 탄소 및/또는 질소원인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 탄소원이 글루코스이고 질소원이 암모니아 및/또는 암모늄염인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 발효가 회분식, 반복 회분식, 유가식, 반복 유가식 또는 연속 발효 공정을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 발효가 유가식 공정을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 탄소 및/또는 질소원을 그 공정에 피딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 탄소원이 글루코스이고 질소원이 암모니아 및/또는 암모늄염인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 가치있는 화합물이 이차 대사산물인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 이차 대사산물이 β-락탐 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 가치있는 화합물이 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 사상 균주가 균류인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 균류가 Aspergillus 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 균류가 Aspergillus terreus이고 가치있는 화합물이 로바스테틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 균류가 Penicillium 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 균류가 Penicillium chrysogenum이고 이차 대사산물이 β-락탐 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 균류가 Mucorales 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, Mucorales 균주가 Mortierella 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, Mucorales 균주가 Mortierella alpina이고 이차 대사산물이 아라키돈산을 포함하는 지질인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 아라키돈산을 포함하는 지질이 트리글리세리드인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, Mucorales 균주가 Blakeslea 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, Mucorales 균주가 Blakeslea trispora이고 이차 대사산물이 β-카로틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 사상 균주가 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 박테리아가 Actinomycete인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, Actinomycete가 Streptomyces 균주이고 가치있는 화합물이 글루코스 이소머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, Actinomycete가 Streptomyces clavuligerus이고 가치있는 생성물이 클라불란산인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, Actinomycete가 Saccharopolyspora erythrea이고 가치있는 화합물이 에리쓰로마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 글루코스, 락토스, 프룩토스, 수크로스, 말토덱스트린, 녹말 및 이눌린 등의 탄수화물류, 글리세롤, 식물성 오일류, 탄화수소류, 메탄올 및 에탄올 등의 알코올류, 아세테이트 및 고급 알카노산 등의 유기산류로 이루어지는 군으로부터 선택된 탄소원과, 유레아, 암모니아, 질산염, 황산 암모늄, 인산 암모늄 및 질산 암모늄 등의 암모늄염류 및 글루타메이트 및 리신 등의 아미노산류로 이루어지는 군으로부터 선택된 질소원을 포함하는 화학적 합성 발효 배지에서 ≥10 m3 부피 규모로 발효될 수 있는 가치있는 화합물을 생산하는 사상 미생물 균주의 제조방법으로서 하기의 단계들을 포함하며, 가치있는 화합물은 약제학적 단백질 또는 펩티드, 일차 또는 이차 대사산물, 또는 산업적 효소인 것을 특징으로 하는 사상 미생물 균주의 제조 방법.
    * 적합한 부모 균주를 물리적 수단 및 화학적 돌연변이원들로 이루어지는 군으로부터 선택된 돌연변이유발 처리 또는 DNA 형질전환시키는 단계,
    * 결과된 돌연변이체 또는 형질전환체들을 화학적 합성 배지 상에서의 그들의 생장 성능 및 원하는 상기 가치있는 화합물의 생산성 레벨에 대해 스크리닝하는 단계,
    * 상기 부모 균주와 비교하여 화학적 합성 배지 상에서의 양호한 생장 성능을 갖거나, 원하는 상기 가치있는 화합물의 향상된 생산성 레벨을 갖거나, 이들 둘다를 갖는 돌연변이체들 또는 형질전환체들을 셀렉션하는 단계.
  28. 제 27 항에 있어서, 부모 균주가 Aspergillus, Penicillium, Mucorales 및 Actinomycetes로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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