CN115261276A - 一种提高植物乳杆菌活性的方法及复合菌剂的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高植物乳杆菌活性的方法，包括如下步骤：(1)黄芪水提物的制备；(2)山楂水提物的制备；(3)白术水提物的制备；(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物混合，获得水提物混合溶液；(5)取植物乳杆菌接种至MRS液体培养基中培养，获得活化种子液；(6)在MRS液体培养基中加入活化种子液，再加入3％～5％水提物混合溶液，共培养。本发明还提供了一种复合菌剂的制备方法。本发明通过将黄芪、山楂、白术添加于植物乳杆菌中共同培养来显著提高植物乳杆菌的活性，即生长繁殖能力和耐酸耐胆盐的能力；同时，通过将混合溶液干燥成粉与冻干的植物乳杆菌菌粉混合来制成复合菌剂，作为一种绿色饲料添加剂。

Description

一种提高植物乳杆菌活性的方法及复合菌剂的制备
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种提高植物乳杆菌活性的方法及复合菌剂的制备。
背景技术
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，是厌氧或兼性厌氧的菌种，为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，属于同型发酵乳酸菌。植物乳杆菌作为我国***公布的可用于食品的益生菌菌种之一，在肠道中大量存活，维持肠道内菌群平衡，促进营养物质的吸收，具有一定的免疫调节作用，对致病菌也有一定的抑制作用，可以作为益生菌饲料添加剂用于养殖业。然而，在饲喂后，植物乳杆菌需要有效耐受动物的消化***，特别是胃酸和胆盐对其活性的影响，所以急需提高现有植物乳杆菌饲料的生长繁殖能力和耐酸耐胆盐能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高植物乳杆菌活性的方法及复合菌剂的制备，其通过将黄芪、山楂、白术添加于植物乳杆菌中共同培养来显著提高植物乳杆菌的活性(即，生长繁殖能力和耐酸、耐胆盐能力)，通过将黄芪、山楂、白术混合溶液干燥成粉与冻干的植物乳杆菌菌粉混合来制成复合菌剂，作为一种绿色饲料添加剂用于养殖业。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种提高植物乳杆菌活性的方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片与清水煮沸，过滤获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸，过滤获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合，获得黄芪水提物；
(2)将山楂片与清水煎煮，过滤后再煎煮残渣两次，过滤后合并三次煎煮液，即为山楂水提物；
(3)向白术中加入清水，浸泡过夜；煎煮两次，过滤后得原药液；过夜，隔日加无水乙醇，醇沉过夜；次日，离心取上清液；回收乙醇，获得白术水提物；
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液；
(5)用接种环划取植物乳杆菌，将其接种至MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液；
(6)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入3％～5％的水提物混合溶液，在39℃温度下共培养。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，将黄芪片与清水煮沸1h，过滤获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸30min，过滤获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合，获得黄芪水提物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，将山楂片与清水煎煮2h，过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h，过滤后合并三次煎煮液，即为山楂水提物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，向白术中加入清水，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇，4℃醇沉过夜；次日，离心5min，取上清液；回收乙醇，获得白术水提物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，黄芪片与清水的质量比为1：10，用四层纱布过滤；残渣与清水的质量比为1：5；第一次和第二次浸提液混合后定容至500mL；
所述步骤(2)中，山楂片与清水的质量比为1：10，用四层纱布过滤；残渣与清水的质量比为1：10；合并三次煎煮液后定容至500mL；
所述步骤(3)中，白术片与清水的比例为1：10，用四层纱布过滤；加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，离心条件为4℃，11000rpm/min；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌，接种至100mL MRS液体培养基中，在39℃的培养箱中过夜培养。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中，水提物混合溶液的具体添加量为3％。
一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片与清水煮沸，过滤获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸，过滤获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合，获得黄芪水提物；
(2)将山楂片与清水煎煮，过滤后再煎煮残渣两次，过滤后合并三次煎煮液，即为山楂水提物；
(3)向白术中加入清水，浸泡过夜；煎煮两次，过滤后得原药液；过夜，隔日加无水乙醇，醇沉过夜；次日，离心取上清液；回收乙醇，获得白术水提物；
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液；接着，对水提物混合溶液进行喷雾干燥，获得水提物混合粉末；
(5)用接种环划取植物乳杆菌，将其接种至MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养；
(6)过夜培养结束后，离心收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤若干次，得到植物乳杆菌菌泥；在植物乳杆菌菌泥中添加保护剂，预冻后置于冷冻干燥机中冻干；冻干结束后，研磨成粉；
(7)将步骤(4)获得的水提物混合粉末与步骤(6)获得的植物乳杆菌冻干粉进行混合，即得目标所需的复合菌剂。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，喷雾干燥的条件为进风温度180℃，蠕动泵速度7rpm/min。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中，过夜培养结束后，用高速冷冻离心机在20℃，5000rpm/min条件下离心5min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次，得到植物乳杆菌菌泥；在植物乳杆菌菌泥中添加发酵液体积20％的保护剂，在-80℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24～36h；冻干结束后，研磨成粉；其中，保护剂的组成为：乳糖9.05g/100mL，胰蛋白胨8.79g/100mL，海藻糖11.21g/100mL。
本发明中，采用的MRS液体培养基为本领域常用培养基，其成分不再赘述。与水提物混合溶液作用的植物乳杆菌，采用本领域任意可购买获得植物乳杆菌即可。
黄芪、山楂及白术的功效原理：
黄芪中包含20多种微量元素，50多种皂苷类和三萜类化合物以及20多种黄酮类物质。黄芪多糖是黄芪根部的多糖提取物，在黄芪中含量最多，具有很强的免疫活性，是增强机体免疫作用的重要部分。
山楂中主要含有无机盐类、氨基酸类、有机酸类、黄酮类化合物。三萜类是山楂中有机酸类化合物中的重要成分，具有强心，改善循环，帮助消化等重要作用。山楂中的黄酮类化合物具有降压，抗氧化等作用，是山楂药理作用的主要生物活性成分。
白术的化学成分主要为挥发油和多糖。其中，白术多糖是白术的主要活性成分，可以影响内分泌***，能够有效调节免疫功能，有明显的抗氧化，降血压作用。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明水提物混合溶液可以提高植物乳杆菌的生长繁殖能力；经研究发现，黄芪提取物中的黄芪多糖以及山楂提取物中的有机酸和黄酮类化合物对植物乳杆菌生长繁殖能力影响最为明显；
(2)本发明水提物混合溶液可以提高植物乳杆菌耐酸能力；经研究发现，黄芪提取物中的黄芪多糖以及山楂提取物中的黄酮类化合物对植物乳杆菌耐酸能力有显著提高；
(3)本发明水提物混合溶液可以提高植物乳杆菌的耐胆盐能力；经研究发现，黄芪提取物中的黄芪多糖、山楂提取物中的有机酸和黄酮类化合物以及白术提取物中的白术多糖均能够提高植物乳杆菌的耐胆盐能力；
(4)黄芪、山楂和白术属于可饲用药食同源植物，植物乳杆菌属于可饲用微生物，本发明将二者复合制备得到的复合菌剂可作为一种新型绿色饲料添加剂开发应用于养殖行业。
附图说明
图1是实施例4中不同浓度水提物混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响图；
图2是实施例4中不同浓度黄芪水提物和混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响对比图；
图3是实施例4中不同浓度山楂水提物和混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响对比图；
图4是实施例4中不同浓度白术提取物和混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响对比图；
图5是实施例5中3％水提物混合溶液对植物乳杆菌耐酸能力的影响图；
图6是实施例5中单一溶液和混合溶液对植物乳杆菌耐酸能力的影响对比图；
图7是实施例6中3％混合溶液对植物乳杆菌耐胆盐能力的影响图；
图8是实施例6中单一溶液和混合溶液对植物乳杆菌耐胆盐能力的影响对比图；
图9是实施例7所得的植物乳杆菌冻干粉及水提物混合粉末实物图(图中，A图为植物乳杆菌冻干粉，B图为水提物混合粉末)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种提高植物乳杆菌活性的方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入3％的水提物混合溶液，在39℃温度下共培养。
其中，需要注意的是，本实施例中，采用的MRS液体培养基为本领域常用培养基，其成分不再赘述。与水提物混合溶液作用的植物乳杆菌，采用本领域任意可购买获得植物乳杆菌即可。
实施例2
本实施例的一种提高植物乳杆菌活性的方法，其步骤与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(6)中，在新鲜的MRS液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入4％的水提物混合溶液，在39℃温度下共培养。
实施例3
本实施例的一种提高植物乳杆菌活性的方法，其步骤与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(6)中，在新鲜的MRS液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入5％的水提物混合溶液，在39℃温度下共培养。
实验例4
本实施例用以说明验证本发明水提物混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响。
一、不同浓度水提物混合溶液作用实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌(购自中科嘉亿的植物乳杆菌JYLP-326)，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入0，3％，5％，10％的水提物混合溶液，在39℃下培养，每隔2h测一次OD600值。
2、实验结果：如图1所示。
图1为本实施例中加入不同浓度的水提物混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响。由图1可知，当加入3％和5％时可以提高植物乳杆菌的生长繁殖能力，其中加入3％时对植物乳杆菌生长繁殖能力的提高最明显，而加入10％时其生长繁殖能力减弱。
由此可知，本发明加入3％～5％水提物混合溶液可以有效提高植物乳杆菌生长繁殖能力，且3％浓度时最佳。
二、“单一溶液”的对照实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌(购自中科嘉亿的植物乳杆菌JYLP-326)，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(5)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％步骤(4)的活化种子液，再加入0，3％，5％，10％，20％的黄芪水提物，在39℃下培养，每隔2h测一次OD600值。
(6)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％步骤(4)的活化种子液，再加入0，3％，5％，10％的山楂水提物，在39℃下培养，每隔2h测一次OD600值。
(7)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％步骤(4)的活化种子液，再加入0，3％，5％，10％的白术水提物，在39℃下培养，每隔2h测一次OD600值。
2、实验结果：如图2～4所示。
图2为加入不同浓度的黄芪水提物和混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响，其中混合溶液的OD值明显高于黄芪水提物。图3为加入不同浓度的山楂水提物和混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响，其中混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的提高明显高于山楂水提物。图4为加入不同浓度的白术提取物和混合溶液对植物乳杆菌生长繁殖能力的影响，其中混合溶液的提高明显高于白术提取物。
由此可知，本发明加入水提物混合溶液比单一溶液更能提高植物乳杆菌的生长繁殖能力。
实验例5
本实施例用以说明验证本发明水提物混合溶液对植物乳杆菌耐酸性的影响。
一、水提物混合溶液作用实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌(购自中科嘉亿的植物乳杆菌JYLP-326)，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在pH值分别为2、3、7的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，根据食物在胃中停留时间，在39℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值，作为对照组。同时，在pH值分别为2、3、7的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入3％的水提物混合溶液；根据食物在胃中停留时间，在39℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值，作为实验组。
2、实验结果：如图5所示。
图5为本实施例加入3％水提物混合溶液后对植物乳杆菌耐酸能力的影响。由图5可知，在pH＝2、pH＝3和pH＝7时，加入3％的混合溶液后，植物乳杆菌的OD值显著增加，说明3％的混合溶液可以提高植物乳杆菌的耐酸能力。
由此可知，本发明加入水提物混合溶液可以有效提高植物乳杆菌耐酸能力。
二、“单一溶液”的对照实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌(购自中科嘉亿的植物乳杆菌JYLP-326)，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(5)在pH值分别为2、3、7的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入10％的黄芪水提物；根据食物在胃中停留时间，在39℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
(6)在pH值分别为2、3、7的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入5％的山楂水提物；根据食物在胃中停留时间，在39℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
(7)在pH值分别为2、3、7的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入3％的白术水提物；根据食物在胃中停留时间，在39℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
2、实验结果：如图6所示。
图6为本实施例加入单一溶液和混合溶液后对植物乳杆菌耐酸能力的影响。在pH＝2、pH＝3和pH＝7时，混合溶液的加入比单一溶液的加入对植物乳杆菌耐酸性的提高影响更大。
由此可知，本发明加入水提物混合溶液比单一溶液更能提高植物乳杆菌的耐酸能力。
实验例6
本实施例用以说明验证本发明水提物混合溶液对植物乳杆菌耐胆盐能力的影响。
一、水提物混合溶液作用实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌(购自中科嘉亿的植物乳杆菌JYLP-326)，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入3％的水提物混合溶液，分别收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在39℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后39℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
2、实验结果：如图7所示。
图7为本实施例中加入3％混合溶液后对植物乳杆菌耐胆盐能力的影响。由图7可知，在加入0.3％和0.5％的胆盐时，再加入3％的混合溶液。植物乳杆菌的存活率显著增加，说明3％的混合溶液可以提高植物乳杆菌的耐胆盐能力。
由此可知，本发明水提物混合溶液可以有效提高植物乳杆菌耐胆盐能力。
二、“单一溶液”的对照实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌(购自中科嘉亿的植物乳杆菌JYLP-326)，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(5)在新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入10％的黄芪水提物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在39℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后39℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
(6)在新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入5％的山楂水提物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在39℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后39℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
(7)在新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜MRS液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入3％的白术水提物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在39℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后39℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
2、实验结果：如图8所示。
图8为本实施例加入单一溶液和混合溶液后对植物乳杆菌耐胆盐能力的影响。由图8可知，当加入0.3％和0.5％的胆盐时，加入混合溶液比加入单一溶液对植物乳杆菌存活率的增加有略微提高。
由此可知，混合溶液比单一溶液更能提高植物乳杆菌的耐胆盐能力。
实施例7
本实施例的一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片与清水(质量比1：10)煮沸1h，用四层纱布过滤后，获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水(质量比1：5)再次混合煮沸30min，用四层纱布过滤后，获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合后定容至500mL，获得黄芪水提物。
(2)将山楂片与清水(质量比1：10)煎煮2h，用四层纱布过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h；过滤后合并三次煎煮液后定容至500mL，获得山楂水提物。
(3)向白术中加入清水(白术片与清水比例1：10)，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，用四层纱布过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，4℃醇沉过夜；次日，4℃，11000rpm/min条件下离心5min，取上清液；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液。接着，对水提物混合溶液进行喷雾干燥，喷雾干燥的条件为进风温度180℃，蠕动泵速度7rpm/min，获得水提物混合粉末。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌，接种至100mL MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养24h。
(6)过夜培养结束后，用高速冷冻离心机在20℃，5000rpm/min条件下离心5min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次，得到植物乳杆菌菌泥；在植物乳杆菌菌泥中添加发酵液体积20％的保护剂，在-80℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24～36h，优选为30h；冻干结束后，研磨成粉。其中，保护剂的组成为：乳糖9.05g/100mL，胰蛋白胨8.79g/100mL，海藻糖11.21g/100mL。
(7)将步骤(4)获得的水提物混合粉末与步骤(6)获得的植物乳杆菌冻干粉按照2：1的比例混合，即得目标所需的复合菌剂。
图9为本实施例所得植物乳杆菌冻干粉(A)及水提物混合粉末(B)。
本实施例可以得到黄芪、山楂、白术的混合粉末和植物乳杆菌冻干粉的复合菌剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将黄芪片与清水煮沸，过滤获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸，过滤获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合，获得黄芪水提物；
(2)将山楂片与清水煎煮，过滤后再煎煮残渣两次，过滤后合并三次煎煮液，即为山楂水提物；
(3)向白术中加入清水，浸泡过夜；煎煮两次，过滤后得原药液；过夜，隔日加无水乙醇，醇沉过夜；次日，离心取上清液；回收乙醇，获得白术水提物；
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液；
(5)用接种环划取植物乳杆菌，将其接种至MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液；
(6)在新鲜的MRS液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入3％～5％的水提物混合溶液，在39℃温度下共培养。
2.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将黄芪片与清水煮沸1h，过滤获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸30min，过滤获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合，获得黄芪水提物。
3.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将山楂片与清水煎煮2h，过滤后再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h，过滤后合并三次煎煮液，即为山楂水提物。
4.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，向白术中加入清水，浸泡过夜；煎煮两次，每次30min，过滤后得原药液；4℃过夜，隔日加无水乙醇，4℃醇沉过夜；次日，离心5min，取上清液；回收乙醇，获得白术水提物。
5.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，黄芪片与清水的质量比为1：10，用四层纱布过滤；残渣与清水的质量比为1：5；第一次和第二次浸提液混合后定容至500mL；
所述步骤(2)中，山楂片与清水的质量比为1：10，用四层纱布过滤；残渣与清水的质量比为1：10；合并三次煎煮液后定容至500mL；
所述步骤(3)中，白术片与清水的比例为1：10，用四层纱布过滤；加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，离心条件为4℃，11000rpm/min；利用旋转蒸发仪回收乙醇，获得白术提取物并定容至500mL。
6.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，用接种环划取一环斜面保藏的植物乳杆菌，接种至100mL MRS液体培养基中，在39℃的培养箱中过夜培养。
7.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌活性的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，水提物混合溶液的具体添加量为3％。
8.一种复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将黄芪片与清水煮沸，过滤获取第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸，过滤获取第二次浸提液；将第一次和第二次获取的浸提液混合，获得黄芪水提物；
(2)将山楂片与清水煎煮，过滤后再煎煮残渣两次，过滤后合并三次煎煮液，即为山楂水提物；
(3)向白术中加入清水，浸泡过夜；煎煮两次，过滤后得原药液；过夜，隔日加无水乙醇，醇沉过夜；次日，离心取上清液；回收乙醇，获得白术水提物；
(4)将获得的黄芪水提物、山楂水提物和白术提取物按照1：1：1的比例混合，获得水提物混合溶液；接着，对水提物混合溶液进行喷雾干燥，获得水提物混合粉末；
(5)用接种环划取植物乳杆菌，将其接种至MRS液体培养基中，并在39℃的培养箱中过夜培养；
(6)过夜培养结束后，离心收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤若干次，得到植物乳杆菌菌泥；在植物乳杆菌菌泥中添加保护剂，预冻后置于冷冻干燥机中冻干；冻干结束后，研磨成粉；
(7)将步骤(4)获得的水提物混合粉末与步骤(6)获得的植物乳杆菌冻干粉进行混合，即得目标所需的复合菌剂。
9.根据权利要求8所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，喷雾干燥的条件为进风温度180℃，蠕动泵速度7rpm/min。
10.根据权利要求8所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，过夜培养结束后，用高速冷冻离心机在20℃，5000rpm/min条件下离心5min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤2次，得到植物乳杆菌菌泥；在植物乳杆菌菌泥中添加发酵液体积20％的保护剂，在-80℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24～36h；冻干结束后，研磨成粉；其中，保护剂的组成为：乳糖9.05g/100mL，胰蛋白胨8.79g/100mL，海藻糖11.21g/100mL。
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