CN115678789A - 一种提高啤酒酵母活性的新方法及复合菌剂的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高啤酒酵母活性的新方法，包括如下步骤：(1)制备黄芪提取物；(2)制备山楂提取物；(3)制备甘草提取物；(4)制备杜仲叶提取物；(5)将黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按比例混合，得提取物混合溶液；(6)活化啤酒酵母，获得活化种子液；(7)在YPD液体培养基中加入活化种子液，再加入3％～20％提取物混合溶液共培养。本发明还提供了一种复合菌剂的制备方法。本发明通过将黄芪、山楂、甘草和杜仲叶添加于啤酒酵母中共培养来显著提高啤酒酵母的活性，通过将黄芪、山楂、甘草和杜仲叶提取物混合溶液干燥成粉与冻干啤酒酵母菌粉混合来制成复合菌剂，作为一种绿色饲料添加剂用于养殖业。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种提高啤酒酵母活性的新方法及复合菌剂的制备。
背景技术
啤酒酵母为用于酿造啤酒的酵母，其细胞形态为近球形的椭圆体。啤酒酵母中几乎不含糖、脂肪和淀粉，而含有优质完全蛋白质、优质矿物质、优质功能性膳食纤维等。因此，啤酒酵母可以作为益生菌饲料添加剂用于养殖业。
但是，在作为饲料饲喂后，啤酒酵母需要有效耐受动物的消化***，特别是胃酸和胆盐对其活性的影响。因此，如何提高现有啤酒酵母饲料的活性，成为当前领域亟待解决的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高啤酒酵母活性的新方法及复合菌剂的制备，其通过将黄芪、山楂、甘草和杜仲叶添加于啤酒酵母中共培养来显著提高啤酒酵母的活性(即，生长繁殖能力和耐酸、耐胆盐能力)，通过将黄芪、山楂、甘草和杜仲叶提取物混合溶液干燥成粉与冻干的啤酒酵母菌粉混合来制成复合菌剂，作为一种绿色饲料添加剂用于养殖业。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种提高啤酒酵母活性的新方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；过滤后离心处理，获得黄芪提取物；
(2)将山楂放入清水中，煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，并加60％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得山楂提取物；
(3)将甘草放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入70％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得甘草提取物；
(4)向杜仲叶中加入乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；过滤后进行旋转蒸发，获得杜仲叶提取物；
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按照2：3：1：2的比例混合，获得提取物混合溶液；
(6)将啤酒酵母接种至YPD液体培养基中，并在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液；
(7)在新鲜的YPD液体培养基中加入上述活化种子液，再加入3％～20％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；超声提取后，四层纱布过滤，滤液在20℃下10000rpm/min离心5min；离心后，取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水，按质量比1：5再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡、煎煮；用四层纱布过滤后，同样条件下煎煮残渣2次；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，70％乙醇浸泡杜仲叶一夜后，超声处理；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中，用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母，接种至100mL YPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，得到活化种子液。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(7)中，提取物混合溶液的具体添加量为10％。
一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；过滤后离心处理，获得黄芪提取物；
(2)将山楂放入清水中，煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，并加60％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得山楂提取物；
(3)将甘草放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入70％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得甘草提取物；
(4)向杜仲叶中加入乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；过滤后进行旋转蒸发，获得杜仲叶提取物；
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按照2：3：1：2的比例混合，获得提取物混合溶液；接着，对提取物混合溶液进行喷雾干燥，获得提取物混合粉末；
(6)将啤酒酵母接种至YPD液体培养基中，并在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液；
(7)过夜培养结束后，离心收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤若干次，得到啤酒酵母菌泥；在啤酒酵母菌泥中添加保护剂，预冻后置于冷冻干燥机中冻干；冻干结束后，研磨成粉；
(8)将步骤(5)获得的提取物混合粉末与步骤(7)获得的啤酒酵母冻干粉进行混合，即得目标所需的复合菌剂。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，喷雾干燥的条件为进风温度170℃，蠕动泵速度7rpm/min。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(6)中，过夜培养结束后，用高速冷冻离心机在4℃，5000rpm/min条件下离心6min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤3次，得到啤酒酵母菌泥；在啤酒酵母菌泥中添加发酵液体积20％的保护剂，在-70℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥36～48h；冻干结束后，研磨成粉；其中，保护剂的组成为：脱脂乳10％，海藻糖10％，蔗糖5％。
本发明中，采用的YPD液体培养基为本领域常用培养基，其成分不再赘述。与提取物混合溶液作用的啤酒酵母，采用本领域任意可购买获得啤酒酵母即可。
本发明原料的功效原理：
黄芪中包含20多种微量元素、50多种皂苷类和三萜类化合物以及20多种黄酮类物质。其中，黄芪多糖是黄芪根部的多糖提取物，在黄芪中含量最多，具有很强的免疫活性，是增强机体免疫作用的重要部分。
山楂中主要含有无机盐类、氨基酸类、有机酸类、黄酮类化合物。三萜类是山楂中有机酸类化合物中的重要成分，具有强心，改善循环，帮助消化等重要作用。山楂中的黄酮类化合物具有降压，抗氧化等作用，是山楂药理作用的主要生物活性成分。
甘草的主要活性成分是皂苷、黄铜和多糖类化合物等。其中，皂苷类物质主要是甘草酸，黄酮类物质主要是甘草素和异甘草素，多糖类物质主要是甘草多糖。甘草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌等生物活性，能够提高动物机体免疫力，促进其生产功能。
杜仲叶的活性成分包括黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类、木酯素类、多糖类以及杜仲橡胶等。其中，木酯素类和环烯醚萜类化合物是杜仲叶内主要组成部分，而黄酮类化合物是杜仲叶内含量最多的化合物。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明提取物混合溶液可以提高啤酒酵母的生长繁殖能力；经研究发现：黄芪提取物中的黄芪多糖，山楂提取物中的有机酸和黄酮类化合物，甘草提取物中的甘草酸，以及杜仲叶提取物中的黄酮类、木酯素类化合物，对啤酒酵母生长繁殖能力有所影响；当它们共同发挥作用时，对啤酒酵母生长繁殖能力的影响最为有利；
(2)本发明提取物混合溶液可以提高啤酒酵母耐酸能力；经研究发现：黄芪提取物中的黄芪多糖，山楂提取物中的黄酮类化合物，甘草提取物中的甘草多糖，以及杜仲叶提取物中的黄酮类、木酯素类化合物，对啤酒酵母耐酸能力有所助益；当它们共同发挥作用时，对啤酒酵母耐酸能力的提高最为显著；
(3)本发明提取物混合溶液可以提高啤酒酵母的耐胆盐能力；经研究发现：黄芪提取物中的黄芪多糖，山楂提取物中的有机酸和黄酮类化合物，甘草提取物中的甘草酸，以及杜仲叶提取物中的黄酮类、木酯素类化合物，对提高啤酒酵母的耐胆盐能力有所助益；当它们共同发挥作用时，对啤酒酵母耐胆盐能力的提高最为显著；
(4)黄芪、山楂、甘草和杜仲叶属于可饲用药食同源植物，啤酒酵母属于可饲用微生物，本发明将二者复合制备得到的复合菌剂可作为一种新型绿色饲料添加剂开发应用于养殖行业。
附图说明
图1是实施例5中不同浓度提取物混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响图；
图2是实施例5中不同浓度黄芪提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响对比图；
图3是实施例5中不同浓度山楂提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响对比图；
图4是实施例5中不同浓度甘草提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响对比图；
图5是实施例5中不同浓度杜仲叶提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响对比图；
图6是实施例6中10％提取物混合溶液对啤酒酵母耐酸能力的影响图；
图7是实施例6中单一溶液和混合溶液对啤酒酵母耐酸能力的影响对比图；
图8是实施例7中10％混合溶液对啤酒酵母耐胆盐能力的影响图；
图9是实施例7中单一溶液和混合溶液对啤酒酵母耐胆盐能力的影响对比图；
图10是实施例8所得的啤酒酵母冻干粉及提取物混合粉末实物图(图中，A图为啤酒酵母冻干粉，B图为提取物混合粉末)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种提高啤酒酵母活性的新方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按质量比2：3：1：2混合，获得提取物混合溶液。
(6)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母，接种至100mL YPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，得到活化种子液。
(7)在新鲜的YPD液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入3％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养。
其中，需要注意的是，本实施例中，采用的YPD液体培养基为本领域常用培养基，其成分不再赘述。与提取物混合溶液作用的啤酒酵母，采用本领域任意可购买获得啤酒酵母即可。
实施例2
本实施例的一种提高啤酒酵母活性的新方法，其步骤与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(7)中，在新鲜的YPD液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入5％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养。
实施例3
本实施例的一种提高啤酒酵母活性的新方法，其步骤与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(7)中，在新鲜的YPD液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入10％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养。
实施例4
本实施例的一种提高啤酒酵母活性的新方法，其步骤与实施例1基本相同，主要不同之处在于：步骤(7)中，在新鲜的YPD液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再加入20％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养。
实施例5
本实施例用以说明验证本发明提取物混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响。
一、不同浓度提取物混合溶液作用实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按质量比2：3：1：2混合，获得提取物混合溶液。
(6)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母(BY4742，购自BNCC)，接种至100mLYPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(7)在新鲜的YPD液体培养基中加入1％的上述活化种子液，再分别加入0，3％，5％，10％，20％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养，每隔2h测一次OD600值。
2、实验结果：如图1所示。
图1为本实施例中加入不同浓度的提取物混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响。由图1可知，当加入3％、5％、10％和20％时均可以提高啤酒酵母的生长繁殖能力，但加入10％时对啤酒酵母生长繁殖能力的提高最明显。
由此可知，本发明加入3％～20％提取物混合溶液可有效提高啤酒酵母生长繁殖能力，且10％浓度时最佳。
二、“单一溶液”的对照实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母，接种至100mL YPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在新鲜的YPD液体培养基中加入1％步骤(4)的上述活化种子液，再分别加入0，3％，5％，10％，20％的黄芪提取物，在37℃温度下共培养，每隔2h测一次OD600值。
(7)在新鲜的YPD液体培养基中加入1％步骤(4)的上述活化种子液，再分别加入0，3％，5％，10％的山楂提取物，在37℃温度下共培养，每隔2h测一次OD600值。
(8)在新鲜的YPD液体培养基中加入1％步骤(4)的上述活化种子液，再分别加入0，3％，5％，10％的甘草提取物，在37℃温度下共培养，每隔2h测一次OD600值。
(9)在新鲜的YPD液体培养基中加入1％步骤(4)的上述活化种子液，再分别加入0，3％，5％，10％，20％的杜仲叶提取物，在37℃温度下共培养，每隔2h测一次OD600值。
2、实验结果：如图2～5所示。
图2为加入不同浓度的黄芪提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响，其中混合溶液的OD值明显高于黄芪提取物。图3为加入不同浓度的山楂提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响，其中混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的提高明显高于山楂提取物。图4为加入不同浓度的甘草提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响，其中混合溶液的提高明显高于白术提取物。图5为加入不同浓度的杜仲叶提取物和混合溶液对啤酒酵母生长繁殖能力的影响，其中混合溶液的提高明显高于杜仲叶提取物。
由此可知，本发明加入提取物混合溶液比单一溶液更能提高啤酒酵母的生长繁殖能力。
实验例6
本实施例用以说明验证本发明提取物混合溶液对啤酒酵母耐酸性的影响。
一、提取物混合溶液作用实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按质量比2：3：1：2混合，获得提取物混合溶液。
(6)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母(BY4742，购自BNCC)，接种至100mLYPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(7)在pH值分别为2、3、7的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，根据食物在胃中停留时间，在37℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值，作为对照组。同时，在pH值分别为2、3、7的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入10％的提取物混合溶液；根据食物在胃中停留时间，在37℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值，作为实验组。
2、实验结果：如图6所示。
图6为本实施例加入10％提取物混合溶液后对啤酒酵母耐酸能力的影响。由图6可知，在pH＝2、pH＝3和pH＝7时，加入10％的混合溶液后，啤酒酵母的OD值显著增加，说明10％的混合溶液可以提高啤酒酵母的耐酸能力。
由此可知，本发明加入提取物混合溶液可以有效提高啤酒酵母耐酸能力。
二、“单一溶液”的对照实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母，接种至100mL YPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在pH值分别为2、3、7的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入10％的黄芪提取物；根据食物在胃中停留时间，在37℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
(7)在pH值分别为2、3、7的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入5％的山楂提取物；根据食物在胃中停留时间，在37℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
(8)在pH值分别为2、3、7的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入3％的甘草提取物；根据食物在胃中停留时间，在37℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
(9)在pH值分别为2、3、7的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，再加入10％的杜仲叶提取物；根据食物在胃中停留时间，在37℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值。
2、实验结果：如图7所示。
图7为本实施例加入单一溶液和混合溶液后对啤酒酵母耐酸能力的影响。在pH＝2、pH＝3和pH＝7时，混合溶液的加入比单一溶液的加入对啤酒酵母耐酸性的提高影响更大。
由此可知，本发明加入提取物混合溶液比单一溶液更能提高啤酒酵母的耐酸能力。
实验例7
本实施例用以说明验证本发明提取物混合溶液对啤酒酵母耐胆盐能力的影响。
一、提取物混合溶液作用实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按质量比2：3：1：2混合，获得提取物混合溶液。
(6)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母(BY4742，购自BNCC)，接种至100mLYPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(7)在新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入10％的提取物混合溶液，分别收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在37℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后37℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
2、实验结果：如图8所示。
图8为本实施例中加入10％混合溶液后对啤酒酵母耐胆盐能力的影响。由图8可知，在加入0.3％和0.5％的胆盐时，再加入10％的混合溶液。啤酒酵母的存活率显著增加，说明10％的混合溶液可以提高啤酒酵母的耐胆盐能力。
由此可知，本发明提取物混合溶液可以有效提高啤酒酵母耐胆盐能力。
二、“单一溶液”的对照实验：
1、实验步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母，接种至100mL YPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液。
(6)在新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入10％的黄芪提取物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在37℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后37℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
(7)在新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入5％的山楂提取物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在37℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后37℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
(8)在新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入3％的甘草提取物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在37℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后37℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
(9)在新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，收集1mL混合后的培养液作为空白组。同时，在含有0.3％和0.5％胆盐的新鲜YPD液体培养基中加入1％接种量的活化种子液，分别收集1mL作为对照组，再加入10％的杜仲叶提取物，收集1mL混合后的培养液作为实验组；根据食物在胃中停留时间，在37℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后37℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率。
2、实验结果：如图9所示。
图9为本实施例加入单一溶液和混合溶液后对啤酒酵母耐胆盐能力的影响。由图9可知，当加入0.3％和0.5％的胆盐时，加入混合溶液比加入单一溶液对啤酒酵母存活率的增加有略微提高。
由此可知，混合溶液比单一溶液更能提高啤酒酵母的耐胆盐能力。
实施例8
本实施例的一种复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；四层纱布过滤后，在20℃下10000rpm/min离心5min；取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
(2)将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将四层纱布过滤后的残渣与清水(残渣与清水质量比1：5)再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
(3)将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；四层纱布过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
(4)向杜仲叶中加入70％乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按质量比2：3：1：2混合，获得提取物混合溶液；接着，对提取物混合溶液进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为进风温度170℃，蠕动泵速度7rpm/min，获得提取物混合粉末。
(6)用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母(BY4742，购自BNCC)，接种至100mLYPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养。
(7)过夜培养结束后，用高速冷冻离心机在4℃，5000rpm/min条件下离心6min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤3次，得到啤酒酵母菌泥；在啤酒酵母菌泥中添加发酵液体积20％的保护剂，在-70℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥36～48h；冻干结束后，研磨成粉；其中，保护剂的组成为：脱脂乳10％，海藻糖10％，蔗糖5％。
(8)将步骤(5)获得的提取物混合粉末与步骤(7)获得的啤酒酵母冻干粉按照2：1的比例混合，即得目标所需的复合菌剂。
图10为本实施例所得啤酒酵母冻干粉(A)及提取物混合粉末(B)。
本实施例可以得到黄芪、山楂、甘草、杜仲叶的混合粉末和啤酒酵母冻干粉的复合菌剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将黄芪片放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；过滤后离心处理，获得黄芪提取物；
(2)将山楂放入清水中，煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，并加60％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得山楂提取物；
(3)将甘草放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入70％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得甘草提取物；
(4)向杜仲叶中加入乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；过滤后进行旋转蒸发，获得杜仲叶提取物；
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按照2：3：1：2的比例混合，获得提取物混合溶液；
(6)将啤酒酵母接种至YPD液体培养基中，并在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液；
(7)在新鲜的YPD液体培养基中加入上述活化种子液，再加入3％～20％的提取物混合溶液，在37℃温度下共培养。
2.根据权利要求1所述的提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将黄芪片按质量比1：5放入清水中，浸泡过夜；超声提取后，四层纱布过滤，滤液在20℃下10000rpm/min离心5min；离心后，取上清定容至200mL，即得黄芪提取物。
3.根据权利要求1所述的提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将山楂按质量比1：10放入清水中，100℃煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水，按质量比1：5再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，加无水乙醇，配置60％醇沉液，4℃过夜；次日，4℃下11000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得山楂提取物。
4.根据权利要求1所述的提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将甘草按质量比1：10放入清水中，浸泡、煎煮；用四层纱布过滤后，同样条件下煎煮残渣2次；合并三次煎煮液加入无水乙醇，配置70％醇沉液，4℃过夜；次日，20℃下10000rpm/min离心5min；取上清后回收乙醇，获得提取液并定容至200mL，即得甘草提取物。
5.根据权利要求1所述的提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，所述步骤(4)中，70％乙醇浸泡杜仲叶一夜后，超声处理；用四层纱布过滤后，旋转蒸发掉乙醇，获得水溶液，定容至200mL，即得杜仲叶提取物。
6.根据权利要求1所述的提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，所述步骤(6)中，用接种环划取一环斜面保藏的啤酒酵母，接种至100mL YPD液体培养基中，在37℃的培养箱中过夜培养，得到活化种子液。
7.根据权利要求1所述的提高啤酒酵母活性的新方法，其特征在于，所述步骤(7)中，提取物混合溶液的具体添加量为10％。
8.一种复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将黄芪片放入清水中，浸泡过夜；次日，进行超声提取，超声功率800W，时间30min，温度50℃；过滤后离心处理，获得黄芪提取物；
(2)将山楂放入清水中，煮沸1h，过滤获得第一次浸提液；将过滤后的残渣与清水再次混合煮沸30min，过滤获得第二次浸提液；合并两次浸提液，并加60％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得山楂提取物；
(3)将甘草放入清水中，浸泡1h，煎煮2h；过滤后，同样条件煎煮残渣2次，时间分别为1.5h和1h；合并三次煎煮液加入70％无水乙醇，醇沉过夜；次日离心后，取上清后回收乙醇，获得甘草提取物；
(4)向杜仲叶中加入乙醇，浸泡过夜；在800W，60℃下超声40min；过滤后进行旋转蒸发，获得杜仲叶提取物；
(5)将获得的黄芪提取物、山楂提取物、甘草提取物和杜仲叶提取物按照2：3：1：2的比例混合，获得提取物混合溶液；接着，对提取物混合溶液进行喷雾干燥，获得提取物混合粉末；
(6)将啤酒酵母接种至YPD液体培养基中，并在37℃的培养箱中过夜培养，获得活化种子液；
(7)过夜培养结束后，离心收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤若干次，得到啤酒酵母菌泥；在啤酒酵母菌泥中添加保护剂，预冻后置于冷冻干燥机中冻干；冻干结束后，研磨成粉；
(8)将步骤(5)获得的提取物混合粉末与步骤(7)获得的啤酒酵母冻干粉进行混合，即得目标所需的复合菌剂。
9.根据权利要求8所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，喷雾干燥的条件为进风温度170℃，蠕动泵速度7rpm/min。
10.根据权利要求8所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，过夜培养结束后，用高速冷冻离心机在4℃，5000rpm/min条件下离心6min，收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤3次，得到啤酒酵母菌泥；在啤酒酵母菌泥中添加发酵液体积20％的保护剂，在-70℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥36～48h；冻干结束后，研磨成粉；其中，保护剂的组成为：脱脂乳10％，海藻糖10％，蔗糖5％。
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