CN111317694B

CN111317694B - 一种杜仲发酵提取液及其制备方法和其在化妆品中的应用

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Publication number: CN111317694B
Application number: CN202010143510.XA
Authority: CN
Inventors: 周宁; 冯宁; 乔莉苹; 刘福全; 潘阳; 石艳丽; 郭学平; 刘爱华
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN111317694A

Abstract

本发明涉及一种杜仲发酵提取液的制备方法、由此方法制得的杜仲发酵提取液，以及将杜仲发酵提取液用于制备化妆品的用途。本发明的制备方法，包括以下步骤：制备复合菌种的步骤，在该步骤中，对巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母分别进行预培养，以得到复合菌种；酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤，在该步骤中，杜仲叶经过清洗、干燥、粉碎成粉，加水混匀，然后添加蛋白酶、纤维素酶和果胶酶进行酶解，以得到经酶解的杜仲酶解液，基于此酶解液制得发酵基质；进行发酵的步骤，在该步骤中，将复合菌种接种至含有经酶解的杜仲酶解液的发酵基质中，在低溶氧条件下进行发酵，以得到发酵液；进行纯化的步骤，在该步骤中，对上述得到的发酵液进行离心、过滤，以得到杜仲发酵提取液。

Description

一种杜仲发酵提取液及其制备方法和其在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种杜仲发酵提取液的制备及其在化妆品中的应用。

背景技术

在我国，将植物类中药应用于天然护肤品已有几千年的历史，相对于化学合成物，植物类中药具有功效好，副作用小，安全性更高的特点，因此近年来以纯天然植物成分为主的护肤品越来越受到消费者的喜爱。杜仲(Eucommiaulmoides Oliver)为我国特有的名贵中药材，已有2000多年的药用历史，被称为“活化石植物”，其分布在全国20多个省，目前我国杜仲的种植面积已经发展到35万公顷，占世界杜仲总量的99％以上。杜仲富含绿原酸、多糖和黄酮等多种活性成分，现代药理学研究证明：杜仲叶与皮具有相似的药理作用，其具有强筋健骨、降血压降血脂、抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、增强机体免疫和利尿清热等作用。

杜仲发酵往往涉及食品保健品领域，化妆品领域涉及较少。在化妆品领域，对于杜仲的研究来源主要为通过物理或化学方法获得的杜仲提取物。中国专利CN102885726A公开了“杜仲提取物、其制备方法和应用”，其通过异丙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂提取、回收法获得杜仲提取物，其提取物具有抗氧化、抗光老化作用。中国专利CN105616273A公开了“红杜仲及其提取物在制备抗衰老护肤品中的应用”，其通过乙醇提取法获得杜仲提取物，其提取物具有抗衰老的功效。以上方法缺点主要在于：(1)物理或化学提取法，活性成分的浸提率不高，且提取过程中有丙酮、乙酸乙酯等有机试剂的残留，可能对皮肤及人体有害无益，同时对环境可能造成污染；(2)杜仲中的活性成分有80余种，主要为黄酮类、多糖、木质素类、苯丙素类等，物理或化学提取法，仅对杜仲原料进行一次开发利用，有效成分得不到有效发挥，导致中药资源的浪费。

中国专利CN107927497A公开了“一种杜仲发酵饮料的生产方法”，其特征在于通过将杜仲叶浸提、酶解、乳酸菌一次发酵、酵母菌二次4℃-6℃发酵，获得杜仲发酵饮料，其缺点主要在于：酵母菌的最适生长温度为25℃-30℃，4℃-6℃发酵不利于酵母菌的生长代谢活动和酶的催化作用，从而不利于杜仲叶中有效成分的生物转化。该发酵饮料中糖度为7％-20％，且含有大量的乳酸菌和酵母菌活菌，获得的发酵液未经过后续处理，其产品主要应用于食品保健品领域，难以作为化妆品原料应用到配方中，若直接使用，可能会破坏皮肤表面的微生态平衡***。

中国专利CN106010926A公开了“一种杜仲发酵养生醋及其制备方法”，其特征在于首先通过酶解、乙醇提取法获得杜仲提取液，其次经过酵母菌一次发酵制得果酒、醋酸菌二次发酵获得杜仲发酵养生醋，其主要缺点在于：发酵周期长，生产效率低，产品中含有大量的活菌、醋酸和醇类物质，主要应用在食品保健品领域，无法直接作为化妆品原料应用，若直接使用，容易对皮肤造成刺激性。

中国专利CN109498744A公开了“一种复合菌种发酵复方杜仲叶散的制备方法”，其特征在于通过枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黄芪中间根瘤菌的复合发酵含有黄芪、党参、黄精、金银花、杜仲叶等的中药培养基，获得了一种中药微生态制剂：复方杜仲叶散，其主要缺点在于：固体发酵的周期较长导致生产效率低，培养过程中容易染杂菌，发酵菌种不是益生菌，培养基成分价格昂贵，主要应用于饲料领域，无法直接作为化妆品原料应用。

中国专利CN108721367A公开了“一种复合发酵菌在杜仲饮片制备中应用”，其特征在于通过米曲霉、纳豆芽孢杆菌和产朊假丝酵母的复合发酵杜仲皮切片，经过低温干燥，获得杜仲饮片，其缺点主要在于：发酵菌种不是益生菌，且虽然经过发酵提高了杜仲切片的绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量，但由于对杜仲切片进行发酵，有效成分难以释放到发酵液中，主要应用于食品保健品领域，无法直接作为化妆品原料应用。

综上所述，目前以杜仲为原料开发的提取物在化妆品领域的应用，主要存在以下不足：

1.杜仲发酵多应用于食品保健品领域，其发酵提取液尚无在化妆品领域中的应用专利报道。

2.以杜仲为原料在化妆品领域中的应用，主要是通过普通提取法获得杜仲提取物，存在活性成分的浸提率不高、有机试剂残留及杜仲开发利用简单问题。

3.以杜仲发酵液为产品的专利技术，主要是单一或多种益生菌依次发酵，未充分利用不同菌株的互补协同增效优势，从而对杜仲资源造成浪费。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供了：

1.一种杜仲发酵提取液的制备方法，其中包括以下步骤：

制备复合菌种的步骤，在该步骤中，对巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母分别进行预培养，以得到复合菌种；

酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤，在该步骤中，杜仲叶经过清洗、干燥、粉碎成粉，加水混匀，然后添加蛋白酶、纤维素酶和果胶酶进行酶解，以得到经酶解的杜仲酶解液，基于此酶解液制得发酵基质；

进行发酵的步骤，在该步骤中，将复合菌种以相对于发酵基质体积5％-10％的总接种量接种至含有经酶解的杜仲酶解液的发酵基质中，在低溶氧条件下进行发酵，以得到发酵液；

进行纯化的步骤，在该步骤中，对上述得到的发酵液进行离心、过滤，以得到杜仲发酵提取液。

2.如项1所述的方法，其中，在制备复合菌种的步骤中，对所述巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母分别进行预培养得到三种菌种的预培养液，为利用复合菌种发酵，在后续的发酵过程中所使用的巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的预培养液的体积比为：1:1～6：0.6～4；

其中，预培养液中，所述巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的菌浓度满足：

巴氏醋杆菌预培养液中的菌浓度在1×10⁷cfu/mL以上，

植物乳杆菌预培养液中的菌浓度在8×10⁸cfu/mL以上，

酿酒酵母预培养液中的菌浓度在3×10⁸cfu/mL以上。

3.如项1所述的方法，其中，在酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤中，杜仲叶的质量分数为5％-15％，蛋白酶的添加量为选取的杜仲叶重量的0.1％-0.5％，纤维素酶的添加量为选取的杜仲叶重量的0.2％-1.0％，果胶酶的添加量为选取的杜仲叶重量的0.1％-1.0％，而且各个酶的比活力都不低于3000U/g。

4.如项1所述的方法，其中，在酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤中，酶解反应条件为：pH值3.5-6.5，温度45℃-60℃，酶解时间1h-3.5h，酶解结束时，煮沸3min-5min，使酶失活。

5.如项1所述的方法，其中，发酵基质中除含有杜仲酶解液外，还包括：氮源、碳源、无机盐以及余量的饮用水，其中所述氮源选自酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨或牛肉膏中的任意种；所述碳源选自蔗糖、葡萄糖、乳糖或半乳糖中的任意种；所述无机盐选自NaCl，K₂HPO₄。

6.如项5所述的方法，其中，相对于100重量份的发酵基质，所述氮源为1份～5份，所述碳源为1份～5份，NaCl为0.1份～0.5份，K₂HPO₄为0.1份～0.5份。

7.如项1所述的方法，其中，在进行发酵的步骤中，发酵温度为30℃-35℃，对巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母或者依次地或者同时接种，优选同时接种，发酵基质的pH调整为6.0-7.0，发酵时间为36h-48h，培养过程中溶氧控制为10％-40％，以无残留碳源则判断为发酵终点。

8.如项1所述的方法，其中，在进行纯化的过程中，离心的条件设置为：9000rpm转速下离心至少20分钟，去除菌体。

9.如项1所述的方法，其中，在进行纯化的过程中，过滤的条件设置为：添加1％活性炭，55℃吸附1h，再分别通过1.2μm精细滤板，0.22μm精细滤芯过滤。

10.用如项1至9的任一项所述的方法制得的杜仲发酵提取液。

11.杜仲发酵提取液的用于制备化妆品的用途。

本申请的技术方案获得的有益效果如下：

1.本发明采用多酶解和益生菌复合发酵的制备方法，使得到的杜仲发酵提取液具有更优的功效，如具有良好的抗氧化、抗炎性能。因此，在化妆品领域具有广泛的应用潜能，充分开发了杜仲的应用领域。

2.我国杜仲来源广泛且易得廉价，且微生物发酵法绿色、污染少；相比物理化学法得到的杜仲提取液，本发明所得的杜仲发酵提取液较大程度地保留了其活性成分，所得杜仲发酵提取液功效好，副作用小，安全性更高。

3.本发明选择三种益生菌对杜仲叶酶解底物进行协同发酵，减少了操作工序，降低了生产成本，充分利用三种菌的不同生长特性和协同增效作用，对杜仲叶进行充分开发利用。

具体实施方式

下面对本申请的技术方案进行详细说明。

<杜仲>

杜仲(Eucommiaulmoides Oliver)是我国独有的植物“活化石”，只有一科一属一种，为杜仲科杜仲属的多年生落叶乔木植物，在地球上已经生活了将近5000万年的时间。杜仲树种的经济价值很高，资源稀少，属国家级珍稀濒危植物，我国政府有关部门为了保护杜仲资源，特将杜仲列为国家二级珍贵保护树种。至少在两千年前，杜仲本人就试用这种植物使自己身体强壮并延年益寿。杜仲全身是宝，杜仲籽、皮、叶、花、枝条在多方面都得到了开发与利用。由于杜仲是药用植物，自身次生代谢产物对于人类有很大的利用价值，杜仲次生代谢产物主要有木质素类、环烯醚萜类、黄酮类、酚类、三萜类、甾类、多糖、有机酸、氨基酸、微量元素等。

1杜仲在医疗方面的应用

1.1杜仲具有降低血压作用

杜仲被认为是现在世界上最高质量的无副作用的天然降压药物，其降低血压的有效成分是松脂醇二葡萄糖甙。

1.2杜仲具有提高免疫力的作用

通过文献资料分析，发现杜仲叶浸提物制剂与公认的提高人体和动物免疫力的冬虫夏草浸提物制剂相比较，杜仲叶浸提物制剂对小鼠免疫力功能的促进效果优于冬虫夏草。

1.3杜仲具有止咳平喘和祛痰作用

杜仲含有许多黄酮类化合物，近几十年的临床实验明，杜仲具有止咳平喘和祛痰作用。据报道，黄酮类化合物的平喘作用与其分子结构中不饱和酮结构有关，而且酮基的氧亲核能力越强，其止咳平喘祛痰作用越强。

1.4杜仲具有抗补体的作用

补体***作为重要的免疫组成部分之一，对机体的防御功能和免疫功能的调节起着重要的作用，然而非正常激活会引起人体自身组织严重的病理损伤，如类风湿性关节炎、哮喘等各种与自身免疫失控相关的疾病，此类疾病常以补体含量的变化作为一项重要的检验指标。因此可以通过筛选出抑制补体过度活化的药物来治疗相关疾病。

1.5杜仲具有抗肿瘤作用

杜仲具有抗肿瘤的有效成分是多种木脂素、京尼平苷、京尼平苷酸，据报道杜仲的抗癌作用可能与β-胡萝卜素有关。

2杜仲在保健方面的应用

2.1杜仲具有减肥的功能

人体试验证明，凡是连续服用杜仲茶一个月以上的人，可明显降低人体皮下及内脏周围的中性脂肪含量，起到不运动、不改变饮食生活，也可防止肥胖和减肥的作用。这是由于杜仲茶能够促进人体中蛋白质的合成，同时促进新陈代谢，消耗体内的能源，自然而然地减少积蓄在体内的中性脂肪，因此长期饮用就会产生减肥效果。

2.2杜仲具有美容的效果

人的皮肤老化，主要是真皮细胞失去弹性所致，真皮细胞中胶原蛋白占70％，杜仲可加速胶原蛋白的新陈代谢，恢复弹性，从而达到防止皮肤起皱的美容效果。

2.3杜仲茶的保健作用

利用杜仲叶开发了杜仲茶，80年代初期，贵州、四川等地开始利用杜仲叶开发保健茶。樊英寿等发明了普洱茶风格的杜仲叶茶；毛克翕提取杜仲等几味中药汁液，添加于绿茶中，研制了“三尖衫杜仲茶”。日本对杜仲茶的保健功效做了大量研究，动物试验表明：可降低胆固醇和中性脂；高桥用2.5％杜仲茶汤喂养人工鳝鱼，使其中性脂肪减少20％，且可使其肌肉组织紧密、弹性增加；田中试验杜仲茶可提高蛋鸡产蛋率20％。所以利用杜仲叶资源开发保健茶，无论叶的利用价值和市场开发等方面均具有巨大优势。

本申请的技术方案，就是利用了杜仲及其相关代谢产物的美容作用。

<酶解工艺>

酶是一种生物催化剂。在对天然成分进行提取的实际生产过程中经常会用到酶解反应，这是由于，某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下将植物细胞壁分解，从而能够大幅度地提高天然植物中有效成分的提取率，提高产品纯度和制剂质量。

常用的酶包括对植物细胞的细胞壁破壁的酶以及用于分离精制、改善提取澄清度的酶；前者如纤维素酶和果胶酶，后者如木瓜蛋白酶。

这两类酶在本申请的方案中得到了复合使用。

此处的“复合使用”涵盖了依次使用和同时使用。复合使用方式包括：

先使用蛋白酶，再使用纤维素酶，最后使用果胶酶；

先使用蛋白酶，再使用果胶酶，最后使用纤维素酶；

先使用果胶酶，再使用蛋白酶，最后使用纤维素酶；

先使用果胶酶，再使用纤维素酶，最后使用蛋白酶；

先使用纤维素酶，再使用果胶酶，最后使用蛋白酶；

先使用纤维素酶，再使用蛋白酶，最后使用果胶酶；

先复合使用蛋白酶和纤维素酶，再使用果胶酶；

先复合使用蛋白酶和果胶酶，再使用纤维素酶；

先复合使用果胶酶和纤维素酶，再使用蛋白酶；

先使用纤维素酶，再同时使用蛋白酶和果胶酶；

先使用蛋白酶，再同时使用纤维素酶和果胶酶；

先使用果胶酶，再同时使用蛋白酶和纤维素酶；

同时使用蛋白酶、果胶酶和纤维素酶。

在本申请的上下文中，蛋白酶是水解蛋白质肽链的酶的总称。按其水解多肽的方式，可以分为内肽酶和外肽酶两类，在此例如采用工业上最经常应用的内肽酶；按照最适pH值，又可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，在此例如采用酸性蛋白酶。

在本申请的上下文中，果胶酶是分解果胶质的酶的总称。按其反应机理可以分为两类，一类能催化果胶解聚，另一类能催化果胶分子中的酯水解。其中，前者又可以分为作用于果胶的酶和作用于果胶酸的酶；而后者又可以分为果胶酯酶和果胶酰基水解酶。在此例如采用作用于果胶的酶。

在本申请的上下文中，纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，其不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。其作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。由于纤维素酶较难提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶等。本申请的技术方案采用的纤维素酶来自真菌。

在本申请的上下文中，“酶活力”符合酶学领域的常规定义，即，为体现酶催化一定化学反应的能力的指标，具体地，表示为它所催化的某一化学反应的转化速率来表示，即酶催化的转化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。所以，测定酶的活力就是测定酶解转化速率。酶转化速率可以用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。“比活力”表示单位质量的酶蛋白所具有的酶活力，通常以单位U/mg，也可以表示为U/g。比活力越高，酶就越纯。在本申请的技术方案中，各个酶的比活力都不低于3000U/g。

酶解反应的常见影响因素有温度、pH值、有否提供辅酶等。酶解反应相对于一般化学反应的特殊优势就在于，酶解反应的催化条件一般是温和的，在常温常压下就能够进行，比相应的非催化反应快10³-10⁷倍。在本申请的技术方案中，酶解反应条件为：pH值为3.5-6.5，温度为45℃-60℃。

酶解工艺结束时，可以通过沸煮的方式使酶失活来结束酶解反应。酶解反应的终点可以通过检测葡萄糖和粗蛋白的含量来判定，在本申请的上下文中，酶解反应的终点定义为间隔0.5h葡萄糖和粗蛋白的含量不再变化。

<发酵工艺>

根据发酵过程中微生物对氧气的需求，发酵类型主要为：需养发酵、厌氧发酵、兼性厌氧发酵。本申请的技术方案中，包括巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母。在培养过程中，主要根据三种菌的生长特性，采用低溶氧培养的方式进行发酵，在适当的组合下，这些不同细菌在共同培养中可以起到协同效应，从而简化培养过程，减少操作工序的同时充分利用其协同增效作用。本申请利用了三种菌的协同发酵：巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母。

本申请中，使用的巴氏醋杆菌为好氧菌，植物乳杆菌和酿酒酵母为兼性厌氧菌，因此，三种菌的复合发酵使用低溶氧发酵方式。

此处的“协同发酵”涵盖了依次接种和同时接种的发酵方式，这些接种方式包括：

先接种巴氏醋杆菌，再接种植物乳杆菌，最后接种酿酒酵母；

先接种巴氏醋杆菌，再接种酿酒酵母，最后接种植物乳杆菌；

先接种酿酒酵母，再接种巴氏醋杆菌，最后接种植物乳杆菌；

先接种酿酒酵母，再接种植物乳杆菌，最后接种巴氏醋杆菌；

先接种植物乳杆菌，再接种酿酒酵母，最后接种巴氏醋杆菌；

先接种植物乳杆菌，再接种巴氏醋杆菌，最后接种酿酒酵母；

先同时接种巴氏醋杆菌和植物乳杆菌，再接种酿酒酵母；

先同时接种巴氏醋杆菌和酿酒酵母，再接种植物乳杆菌；

先同时接种酿酒酵母和植物乳杆菌，再接种巴氏醋杆菌；

先接种酿酒酵母，再同时接种植物乳杆菌和巴氏醋杆菌；

先接种植物乳杆菌，再同时接种酿酒酵母和巴氏醋杆菌；

先接种巴氏醋杆菌，再同时接种植物乳杆菌和酿酒酵母；

同时接种巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母。

在依上述依次向发酵基质接种时，菌种总接种量为发酵基质体积的5％-10％。

对于预培养液中，所述巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的菌浓度满足：

巴氏醋杆菌预培养液中的菌浓度在1×10⁷cfu/mL以上，

植物乳杆菌预培养液中的菌浓度在8×10⁸cfu/mL以上，

酿酒酵母预培养液中的菌浓度在3×10⁸cfu/mL以上。

在本申请的上下文中，酵母菌是一种单细胞真菌，能将糖发酵成乙醇和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的异养兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，酿酒酵母是重要的一种酵母菌。

在本申请的上下文中，醋酸菌是重要的工业用菌之一，革兰氏阴性，属好氧菌，能将有机物氧化成有机酸。醋酸菌重要特征是能将乙醇氧化为醋酸，依其发育最适温度和特性分为两大类，一类称为醋酸杆菌，一类称为葡萄糖氧化杆菌，本申请中的巴氏醋杆菌属于醋酸杆菌。醋酸菌的代谢类型属于异养需氧型，故在发酵中一直都需要氧气的参与。

在本申请的上下文中，乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌，革兰氏染色为阳性，菌体经常排列成链；按照来源不同，可以分为动物源乳酸菌和植物源乳酸菌，本申请中的植物乳杆菌属于植物源乳酸菌；从代谢上看，乳酸菌属异养兼性厌氧微生物。

因此在本申请的技术方案中，为使三种菌协同发酵，故将溶氧控制为10％-40％(低溶氧)。

在将复合菌种同时地或者依次地接种于发酵基质之前，需要对各单个菌种进行预培养。

在本申请的上下文中，“预培养”符合本领域的一般定义，具体是指，将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过茄瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种培养物过程。这些纯种培养物也称为种子液或预培养物。

发酵工业生产过程中的种子必须满足以下条件：

(1)菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长；

(2)生理形状稳定；

(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；

(4)无杂菌污染；

(5)保持稳定的生产能力。

在此，仅举酿酒酵母的种子制备过程为例：

过程简述为：试管→三角瓶→种子罐

以一般生产啤酒的酿酒酵母为例：其一般保存在麦芽汁琼脂斜面上，于4℃冰箱内保藏。将保存的酿酒酵母种接入含100mL麦芽汁的500mL-1000mL三角瓶中，于25℃培养2-3天后，再扩大至含有250mL-500mL麦芽汁的500mL-1000mL三角瓶中，于25℃培养2天后，移种至含有5L-10L麦芽汁的种子罐中，于15℃-20℃培养3-5天即可作100L麦芽汁的种子液。

在此，例如对于100L的发酵基质，接种所需要的酵母预培养物为5L(5％)。当然，在此示出的预培养仅起示例作用，而非限制作用。

在本申请的上下文中，“低溶氧”符合发酵工程领域的一般定义。“溶解氧”(DO)是指溶解于水中的分子状态的氧。控制溶氧的原理在于提高氧传递速率，在此，常用的操作变量有温度、压力、通风量以及搅拌桨的转速(搅拌功率)。在本申请的技术方案中，需控制上述因素，使得DO值为10％-40％，以满足低溶氧条件下发酵的要求。

<纯化工艺>

纯化是指多种物质的聚集体通过物理、化学或生物的方法变成一类或一种物质的过程。纯化可以是一个综合的概念，包括能把所有混合物分离提纯的过程，比如蒸馏、萃取、结晶等。在本申请的上下文中，“纯化”特别地指由发酵液通过各种技术手段分离得到发酵提取液的过程。

<实施例部分>

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此对本发明作出限制。

实施例1杜仲发酵提取液的制备

(1)复合菌种的制备：将巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别从斜面接种到不同的三角瓶中，静置培养48h进行扩大培养，巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母按照1:2:0.6的比例组成，得到复合菌种，所述预培养液中各菌种的活菌数量分别为：巴氏醋杆菌不小于1×10⁷cfu/mL，植物乳杆菌不小于8×10⁸cfu/mL，酿酒酵母不小于3×10⁸cfu/mL。

(2)杜仲发酵基质的制备：取10kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到9.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至5.0，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.3％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的0.6％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的0.5％，50℃酶解，酶解时间为2.5h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。

(3)发酵：往上述杜仲酶解底物中添加2.5kg葡萄糖，3.0kg酵母粉，0.3kg氯化钠、0.25kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至32℃，按照体积比接入7.5％的复合菌种种子液，32℃培养42h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。

(4)纯化：发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A1。

实施例2杜仲发酵提取液的制备

(1)复合菌种的制备：将巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别从斜面接种到不同的三角瓶中，静置培养48h进行扩大培养，巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母按照1:3:4的比例组成，得到复合菌种，所述预培养液中各菌种的活菌数量分别为：巴氏醋杆菌不小于1×10⁷cfu/mL，植物乳杆菌不小于8×10⁸cfu/mL，酿酒酵母不小于3×10⁸cfu/mL。

(2)杜仲发酵基质的制备：取5kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到4.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至3.5，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.1％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的0.2％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的0.1％，60℃酶解，酶解时间为1.0h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。

(3)发酵：往上述杜仲酶解底物中添加5kg葡萄糖，5kg胰蛋白胨，0.5kg氯化钠、0.5kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至30℃，按照体积比接入10％的复合菌种种子液，30℃培养36h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。

(4)纯化：发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A2。

实施例3杜仲发酵提取液的制备

(1)复合菌种的制备：将巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别从斜面接种到不同的三角瓶中，静置培养48h进行扩大培养，巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母按照1:2:1.5的比例组成，得到复合菌种，所述预培养液中各菌种的活菌数量分别为：巴氏醋杆菌不小于1×10⁷cfu/mL，植物乳杆菌不小于8×10⁸cfu/mL，酿酒酵母不小于3×10⁸cfu/mL。

(2)杜仲发酵基质的制备：取15kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到14.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至6.5，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.1％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的1.0％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的1.0％，45℃酶解，酶解时间为3.5h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。

(3)发酵：往上述杜仲酶解底物中添加1kg乳糖，1kg酵母粉，0.1kg氯化钠、0.1kgK₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至35℃，按照体积比接入5％的复合菌种种子液，35℃培养48h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。

(4)纯化：发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A3。

实施例4杜仲发酵提取液的制备

(1)复合菌种的制备：将巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别从斜面接种到不同的三角瓶中，静置培养48h进行扩大培养，巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母按照1:1:1.5的比例组成，得到复合菌种，所述预培养液中各菌种的活菌数量分别为：巴氏醋杆菌不小于1×10⁷cfu/mL，植物乳杆菌不小于8×10⁸cfu/mL，酿酒酵母不小于3×10⁸cfu/mL。

(2)杜仲发酵基质的制备：取8kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到7.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至3.5，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.5％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的0.2％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的0.1％，45℃酶解，酶解时间为1.0h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。

(3)发酵：往上述杜仲酶解底物中添加5kg蔗糖，1kg大豆蛋白胨，0.35kg氯化钠、0.3kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至30℃，按照体积比接入9％的复合菌种种子液，35℃培养40h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。

(4)纯化：发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A4。

实施例5杜仲发酵提取液的制备

(1)复合菌种的制备：将巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别从斜面接种到不同的三角瓶中，静置培养48h进行扩大培养，巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母按照1:3:2的比例组成，得到复合菌种，所述预培养液中各菌种的活菌数量分别为：巴氏醋杆菌不小于1×10⁷cfu/mL，植物乳杆菌不小于8×10⁸cfu/mL，酿酒酵母不小于3×10⁸cfu/mL。

(2)杜仲发酵基质的制备：取12kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到11.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至6.5，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.5％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的0.2％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的1.0％，60℃酶解，酶解时间为3.5h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。

(3)发酵：往上述杜仲酶解底物中添加1kg葡萄糖，5kg酵母粉，0.35kg氯化钠、0.3kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至30℃，按照体积比接入5％的复合菌种种子液，32℃培养48h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。

(4)纯化：发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A5。

实施例6杜仲发酵提取液的制备

(1)菌种的制备：将巴氏醋杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母分别从斜面中接种到不同的三角瓶中，静置培养48h进行扩大培养，所述预培养液中各菌种的活菌数量分别为：巴氏醋杆菌不小于1×10⁷cfu/mL，植物乳杆菌不小于8×10⁸cfu/mL，酿酒酵母不小于3×10⁸cfu/mL。

(2)杜仲发酵基质的制备：取10kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到9.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至5.0，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.3％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的0.6％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的0.5％，50℃下酶解，酶解时间为2.5h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。

(3)发酵：往上述杜仲酶解底物中添加2.5kg葡萄糖，3.0kg酵母粉，0.3kg氯化钠、0.25kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至32℃。向上述发酵培养基中接种2.5％植物乳杆菌的培养液，发酵24h，得一次发酵液；在32℃下，向所述的一次发酵液中接种2.5％酿酒酵母的培养液，发酵12h，得二次发酵液；在37℃下，向所述的二次发酵液中接种2.5％巴氏醋杆菌的培养液，发酵12h发酵结束。整个发酵过程中控制pH为6.0-7.0，通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％。

(4)纯化：发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A6。

对比例1

取10kg杜仲叶作为原料，清洗干燥，经粉碎机充分粉碎成粉，得到9.5kg杜仲粉，将其混匀于100L饮用水中，用盐酸调节pH至5.0，蛋白酶的添加量为杜仲叶重量的0.3％，纤维素酶的添加量为杜仲叶重量的0.6％，果胶酶的添加量为杜仲叶重量的0.5％，50℃酶解，酶解时间为2.5h，然后煮沸3min-5min，使酶失活。酶解液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲提取液A7。

对比例2

一种杜仲发酵提取液的制备，如对比例1所述进行酶解之后进行发酵，其中所用的发酵菌种只包括巴氏醋杆菌，活菌数量不小于1×10⁷cfu/mL，发酵条件：往上述杜仲酶解底物中添加1kg葡萄糖，5kg酵母粉，0.35kg氯化钠、0.3kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至30℃，按照体积比接入7.5％的种子液，32℃培养48h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A8。

对比例3

一种杜仲发酵提取液的制备，如对比例1所述进行酶解之后进行发酵，其中所用的发酵菌种只包括植物乳杆菌，活菌数量不小于8×10⁸cfu/mL，发酵条件：往上述杜仲酶解底物中添加1kg葡萄糖，5kg酵母粉，0.35kg氯化钠、0.3kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至30℃，按照体积比接入7.5％的种子液，32℃培养48h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A9。

对比例4

一种杜仲发酵提取液的制备，如对比例1所述进行酶解之后进行发酵，其中所用的发酵菌种只包括酿酒酵母，活菌数量不小于3×10⁸cfu/mL，发酵条件：往上述杜仲酶解底物中添加1kg葡萄糖，5kg酵母粉，0.35kg氯化钠、0.3kg K₂HPO₄，充分混匀后，116℃灭菌20min后冷却至30℃，按照体积比接入7.5％的种子液，32℃培养48h，随着菌体的扩增和生物转化过程的进行，溶氧量下降，在培养过程中通过控制转速和通气量，使DO为10％-40％，控制发酵液pH为6.0-7.0，无残糖后，发酵结束。发酵液离心、除菌获得杜仲提取液。发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A10。

对比例5

一种杜仲发酵提取液的制备及其在化妆品中的应用，所述复合发酵菌种是由米曲霉、纳豆芽孢杆菌和产朊假丝酵母按照4:3:2的比例组成，复合菌种的活菌数量分别为：米曲霉不小于1×10⁷cfu/mL，纳豆芽孢杆菌不小于5×10⁷cfu/mL，产朊假丝酵母不小于1×10⁸cfu/mL。将复合菌种按照发酵基质重量的1.0％接种至发酵培养基中32℃培养13.5h获得发酵液，所述的培养基质包括：葡萄糖10％，硫酸铵4％，磷酸氢二钾3％，其余为水。选择、清洗优质杜仲皮，置于上述发酵液中，于33℃密闭发酵15h，发酵液9000rpm离心20min除去菌体，添加1％活性炭，55℃吸附1h，再经过1.2μm精细过滤滤板，0.22μm精细过滤滤芯，获得杜仲发酵提取液A11。

杜仲提取液的抗氧化活性

实验方法：分别测定各实施例杜仲发酵提取液及对比例杜仲提取液的抗氧化活性，具体方法如下：

1.DPPH自由基清除率(％)测定：在具塞试管中依次加入3mL磷酸盐缓冲液(pH6.8)、4mL的DPPH无水乙醇溶液(0.4mmol/L)、0.2mL待测提取液，混匀，室温静置30min，于517nm处测定吸光度，以无水乙醇为空白对照。

式中：A1:加入待测提取液反应后测定的吸光度；

A2:待测提取液中添加无水乙醇后测定的吸光度；

A3：不加待测液只加DPPH及磷酸盐缓冲液测定的吸光度。

2.羟自由基清除率(％)测定：在具塞试管中依次加入1mL水杨酸溶液(9mmol/L)、1mL待测提取液、1mL硫酸亚铁溶液(0.9mmol/L)、1mL过氧化氢溶液(8.8mmol/L)，混匀，37℃水浴60min，于510nm处测定吸光度，记为A1，以纯化水为对照，同上操作，记为A2。

3.超氧阴离子自由基清除率(％)测定：配制Tris-HCl-EDTA缓冲液(pH8.2)，在具塞试管中依次加入0.6mL待测提取液、5.2mL缓冲液、0.2mL邻苯三酚溶液(0.045mol/L)，混匀，反应5min，于325nm处测定吸光度值，记为A1，反应10min后再测定，记为A2。以纯化为对照，同上操作，记为W1、W2。

实验结论：结果如表1，各实施例杜仲发酵提取液较对比例，DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率均有所提高，杜仲发酵提取液具有良好的的抗氧化能力。通过对比实施例与对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的数据，我们可以发现协同发酵较单一菌种和仅酶解杜仲的抗氧化能力要突出，显示出三种菌种协同发酵的增效作用。通过对比各实施例与对比例5的数据，DPPH自由基清除率约提高1.90-3.75倍，羟自由基清除率约提高1.80-2.97倍，超氧阴离子自由基清除率约提高2.35-3.21倍，这充分显示了巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母协同发酵杜仲叶的优势，推测原因可能为：采用对比例5中的发酵方式，虽然提高了杜仲饮片中的绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量，但有效成分并未较多的释放到发酵液中或发酵前杜仲切片未经酶处理直接发酵，黄酮类、多糖类等活性成分释放较少所致。

表1 各杜仲提取液的抗氧化结果

杜仲提取液的抗炎活性

实验样品：各实施例杜仲发酵提取液及对比例杜仲提取液。

实验方法：将Raw264.7细胞以5×10⁴个/mL接种于24孔板，在37℃、5％CO₂条件下培养24h，加入待测提取液，同时以LPS(sigma，025M4040V，1万单位/mL)作为模型对照，继续培养24h，ELISA试剂盒检测炎性因子。

实验结论：在LPS刺激下，小鼠巨噬细胞的TNF-α和IL-1β这两种促炎性因子的分泌量有所增加，经过杜仲提取液处理后，与模型组相比，TNF-α和IL-1β的分泌量均有所降低，但降低程度不同。实施例较对比例1、对比例2、对比例3和对比例4相对比，TNF-α抑制率和IL-1β抑制率均明显提高，这说明协同发酵较单一菌种和仅酶解杜仲的抗炎能力突出，显示了三种菌种协同发酵的增效作用。通过对比各实施例与对比例5，TNF-α抑制率约提高1.81-4.54倍，IL-1β抑制率约提高1.40-5.82倍，这说明本杜仲发酵提取液对TNF-α和IL-1β有显著的抑制作用，充分显示了酶解杜仲与巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母协同发酵杜仲叶的优势。

表2 杜仲提取液对TNF-α分泌的影响

名称	浓度(pg/mL)	TNF-α抑制率(％)
			正常组	80.42	-
模型组	310.15	-
			实施例1	197.34	49.11
实施例2	212.45	42.53
			实施例3	258.13	22.64
实施例4	228.04	35.74
			实施例5	245.29	28.23
实施例6	265.13	19.60
			对比例1	305.18	2.16
对比例2	292.67	7.61
			对比例3	290.35	8.62
对比例4	300.89	4.03
			对比例5	285.32	10.81

表3 杜仲提取液对IL-1β分泌的影响

尽管以上对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请要求保护之列。

Claims

1.一种杜仲发酵提取液的制备方法，其中包括以下步骤：

制备复合菌种的步骤，在该步骤中，对巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurium）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分别进行预培养，以得到复合菌种；

进行发酵的步骤，在该步骤中，将复合菌种以相对于发酵基质体积5%-10%的总接种量接种至含有经酶解的杜仲酶解液的发酵基质中，在低溶氧条件下进行发酵，以得到发酵液；

进行纯化的步骤，在该步骤中，对上述得到的发酵液进行离心、过滤，以得到杜仲发酵提取液；

其中，在制备复合菌种的步骤中，对所述巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母分别进行预培养得到三种菌种的预培养液，为利用复合菌种发酵，在后续的发酵过程中所接种的巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的预培养液的体积比为：1:1~6：0.6~4;

巴氏醋杆菌预培养液中的菌浓度在1×10⁷cfu/mL以上，

植物乳杆菌预培养液中的菌浓度在8×10⁸cfu/mL以上，

酿酒酵母预培养液中的菌浓度在3×10⁸cfu/mL以上；

其中，在酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤中，杜仲叶的质量分数为5%-15%，蛋白酶的添加量为选取的杜仲叶重量的0.1%-0.5%，纤维素酶的添加量为选取的杜仲叶重量的0.2%-1.0%，果胶酶的添加量为选取的杜仲叶重量的0.1%-1.0%，而且各个酶的比活力都不低于3000 U/g；

其中，在酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤中，酶解反应条件为：pH值3.5-6.5，温度45℃-60℃；

对巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母同时接种，培养过程中溶氧控制为10%-40%。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在酶解杜仲粉以制备发酵基质的步骤中，酶解反应条件为：pH值3.5-6.5，温度45℃-60℃，酶解时间1 h -3.5 h，在确定酶解工艺结束时，煮沸3 min -5 min，使酶失活。

3.如权利要求1所述的方法，其中，发酵基质除含有杜仲酶解液外，还包括：氮源、碳源、无机盐以及余量的饮用水，其中所述氮源选自酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨或牛肉膏中的任意种；所述碳源选自蔗糖、葡萄糖、乳糖或半乳糖中的任意种；所述无机盐选自NaCl，K₂HPO₄。

4.如权利要求3所述的方法，其中，相对于100重量份的发酵基质，所述氮源为1份~5份，所述碳源为1份~5份，NaCl为0.1份~0.5份，K₂HPO₄为0.1份~0.5份。

5.如权利要求1所述的方法，其中，在进行发酵的步骤中，发酵温度为30℃-35℃，发酵基质的pH调整为6.0-7.0，发酵时间为36 h -48 h，以无残留碳源被检测出则判断为发酵终点。

6.如权利要求1所述的方法，其中，在进行纯化的过程中，离心的条件设置为：9000 rpm转速下离心至少20分钟，去除菌体；在进行纯化的过程中，过滤的条件设置为：添加1%活性炭，55℃吸附1 h，再分别通过1.2 μm精细滤板，0.22 μm精细滤芯过滤。

7.使用如权利要求1至6的任一项所述的方法制得的杜仲发酵提取液。

8.根据权利要求7所述的杜仲发酵提取液的用于制备化妆品的用途。