CN114752622B

CN114752622B - 多肽受体pskr1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用

Info

Publication number: CN114752622B
Application number: CN202210482403.9A
Authority: CN
Inventors: 师恺; 王萍; 罗倩; 方瀚墨
Original assignee: Anqing Mayor's Triangle Future Industry Research Institute; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Anqing Mayor's Triangle Future Industry Research Institute; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114752622A

Abstract

本发明公开了PSKR1基因或其编码的蛋白在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，所述PSKR1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。PSKR1基因能够与HsfA1a互作调控番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性，本发明通过转基因技术，构建得到PSKR1基因过表达载体，并利用组培技术，筛选获得的PSKR1基因过表达纯合株系OE:PSKR1‑1、OE:PSKR1‑2转基因番茄与野生型对照组相比具有明显的高温逆境抗性，证明过表达PSKR1基因能够提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性，为培育抗高温的番茄品种提供了重要的基因资源。

Description

多肽受体PSKR1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及多肽受体PSKR1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)，茄科茄属，是世界上栽培面积最广的蔬菜和经济作物之一。因其口感鲜美，富含维生素、矿物质元素和类胡萝卜素，具有很高的营养保健价值，广受消费者喜爱。番茄为喜温不耐热作物，最适宜的生长温度为20～25℃，但随着全球气候变暖，温室效应增加以及栽培环境可控性差等因素，夏季生产中的番茄作物通常会遭受高温侵害。番茄对高温非常敏感，营养生长时期高温会造成光合作用的显著抑制，失水率增加等现象；生殖生长时期的高温会造成花粉败育，落花落果等，严重影响番茄的产量和品质。在作物生长发育的各个阶段，花粉发育过程对高温胁迫最为敏感，因此花粉高温应答机制成为当前植物学研究的热点。高温通过改变花粉和柱头细胞中生长素和糖类的平衡影响花粉管在柱头内的生长，表现出花粉萌发失败以及花粉管末端膨大、扭曲和破裂等现象，最终导致受精过程无法完成(Shi等，“Pollen germination and in vivo fertilizationin response to high-temperature during flowering in hybrid and inbred rice”，Plant Cell Environment，2018，41：1287–1297)。此外，高温还可以促进绒毡层细胞提前发生程序性死亡，进而影响花粉发育、活性以及散粉过程(De Storme等，“The impact ofenvironmental stress on male reproductive development in plants:biologicalprocesses and molecular mechanisms”Plant Cell Environment，2018，37：1-18)。探究番茄植株及其花粉对高温的响应与调控机制进而改良番茄营养与生殖生长时期的高温抗性，有利于提高番茄产量品质，保障周年均衡供应。

PSKR1(Solyc01g008140)是植物多肽PSK的主效受体基因，植物多肽PSK是近年来发现在植物生长发育以及抗性中发挥多方面作用的新型肽类激素。细胞表面成熟的植物多肽PSK可以被位于细胞膜表面的跨膜受体PSKR识别，并将PSK信号传递到细胞内。PSKR1拥有保守的胞外LRR域、跨膜域和胞内的激酶域(Amano Y等，“Tyrosine-sulfatedglycopeptide involved in cellular proliferation and expansion inArabidopsis.”Proc Natl Acad Sci USA，2007，104，18333-18338)。前人研究表明，PSKR1基因参与调控植物的生长发育以及生物胁迫抗性等，关于其在非生物抗性的调控鲜有研究。

热激转录因子(Heat shock transcription factors,Hsfs)家族通过转录调控保护机体免受热胁迫伤害。HsfA1亚家族基因是响应高温胁迫的主效调控因子，SlHsfA1基因首次在番茄中被发现，SlHsfA1基因过表达番茄植株耐高温性较强，而其共抑制转基因植株对高温胁迫则非常敏感(Mishra等,“In the complex family of heat stresstranscription factors,HsfA1 has a unique role as master regulator ofthermotolerance in tomato”,Genes and development,2002,16:1555-1567)。番茄HsfA1a，HsfA2与HsfB1所形成的三聚体可以通过与分子伴侣的互作提高对热胁迫不同阶段的响应(Scharf等,“The plant heat stress transcription fator(Hsf)family:structure,function and evolution”，Biophysica Acta，2012，1819：104-119.)。番茄花药中SlHsfA2在花粉形成过程中表达上调，从而缓解花粉对热胁迫的敏感性(Fragkostefanakis等,“HsfA2 controls the activity of developmentally andstress-regulated heat stress protection mechanisms in tomato malereproductive tissues”，Plant Physiology，2016，170：2461-1477.)。由此可知，植物HSF基因是调控多种逆境响应基因表达的重要转录因子，在多种非生物逆境抗性和植物的生长发育中发挥重要的作用。

近年来，生物技术发展日新月异，DNA重组技术的建立尤其是基因过表达技术的应用，能够最大程度发挥基因的作用，为解决人类面临的环境恶化、资源匮乏等问题储备更多抗性种质资源。

公开号为CN108841841A的中国专利文献公开了一种番茄转录因子SlbZIP6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用，结果证实SlbZIP6参与了番茄的耐热性调控机制，且超表达SlbZIP6番茄耐热性比野生型更差。检测该基因表达水平，用于番茄耐热育种筛选。

发明内容

本发明通过实验发现，多肽受体PSKR1基因能够通过与热激转录因子HsfA1a互作调控番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性，缓解由于高温引起的植株叶片卷曲、光合损伤、花粉败育等。

基于以上发现，本发明提供了PSKR1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，以期为培育抗高温番茄品种提供依据。

具体采用的技术方案如下：

PSKR1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，所述PSKR1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

发明人通过实验发现，PSKR1基因能够与热激转录因子HsfA1a互作，热激转录因子能够增强植株和花粉的对高温逆境的抗性，因此PSKR1基因能够与HsfA1a互作调控番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性，热激转录因子HsfA1a的编码区序列如SEQ ID NO.5所示。

PSKR1基因位于番茄的1号染色体上，其蛋白编码区长度为2904bp，PSKR1基因编码一种跨膜蛋白，该蛋白由967个氨基酸组成。

本发明还提供了PSKR1基因编码的蛋白在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性的方法，在番茄植株中过表达PSKR1基因，所述PSKR1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

具体包括以下步骤：

(1)构建过表达PSKR1基因的载体；

(2)构建含步骤(1)用于过表达PSKR1基因的载体的农杆菌基因工程菌；

(3)将步骤(2)所述农杆菌基因工程菌转化到番茄组织中，筛选培养获得转基因植株。

本发明通过转基因技术，构建得到PSKR1基因过表达载体，并利用组培技术，筛选获得PSKR1基因过表达纯合株系；通过实验发现过表达PSKR1基因能够提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性。

所述载体为具有35S启动子的表达载体pFGC1008-3HA。

优选的，步骤(1)中，选用上游引物和下游引物，以番茄cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经酶切转化后连接到表达载体pFGC1008-3HA上构建得到过表达PSKR1基因的载体。

其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述农杆菌基因工程菌为根癌农杆菌GV3101菌株。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明利用转基因技术提供了一种抗高温的番茄种质的培育方法，得到了抗高温的转基因纯合植株。

(2)本发明培育的OE:PSKR1-1、OE:PSKR1-2转基因番茄与对照组相比具有明显的对高温逆境的抗性，说明过表达PSKR1基因能够提高番茄植株对高温逆境的抗性，同时，观测高温处理后的花粉活力及花粉萌发情况，证明过表达PSKR1基因能够提高番茄花粉对高温逆境的抗性，本发明提供了PSKR1基因在提高番茄植株在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的新用途，为培育抗高温的番茄品种提供了重要的基因资源。

附图说明

图1为实施例1中PSKR1过表达植株构建成功后Western blot验证HA标签蛋白图。RBC为二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)，Ponc为丽春红染色，用于表征蛋白上样量。

图2为实施例2中野生型WT与PSKR1基因过表达植株OE:PSKR1-1在常温和高温条件下表型图、PSII最大光化学效率和相对电导率，其中，A为表型图，B为PSII最大光化学效率对比图，C为相对电导率对比图；a，b代表5％水平上的差异显著。

图3为实施例3中对野生型植株进行植物多肽PSK外源处理实验组及纯水处理对照组后植株在常温和高温条件下表型图、PSII最大光化学效率和相对电导率，其中，A为表型图，B为PSII最大光化学效率对比图，C为相对电导率对比图；a，b代表5％水平上的差异显著。

图4为实施例4中野生型WT与过表达OE:PSKR1-1植株在高温条件下花粉活力及花粉萌发图，其中，A为花粉活力FDA染色图，B为花粉活力统计图，C为花粉体外萌发苯胺蓝染色图，D为花粉体外萌发率统计；a，b代表5％水平上的差异显著。

图5为实施例5中酵母双杂交的结果图。其中，pBD-PSKR1胞内+pAD表示含有PSKR1基因胞内区域的pGBKT7质粒和pGADT7质粒共转化入酵母感受态细胞；pBD-PSKR1胞内+pAD-HsfA1a表示含有PSKR1基因胞内区域的pGBKT7质粒和含有HsfA1a的pGADT7质粒共转化入酵母感受态细胞；SD-Trp-Leu表示缺少Trp和Leu两种氨基酸的酵母固体培养基；SD-Trp-Leu-His-Ade表示缺少Trp、Leu、His和Ade四种氨基酸的酵母固体培养基；若酵母在缺少氨基酸的酵母培养基上生长，则说明两个蛋白之间存在互作。

具体实施方式

下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

PSKR1基因过表达载体与番茄植株的构建与鉴定

根据番茄基因组数据库(https://solgenomics.net/)获得PSKR1基因(Solyc01g008140)的编码序列，蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PSKR1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。参考Gateway手册，利用Primer5软件设计上游引物(SEQ ID NO.3)：5’>TTggcgcgccATGGTGATTTGGGAGTTTCT>3’和下游引物(SEQ IDNO.4)5’>CGGggtaccCCTCTCCTTTACACTTGCGATTG>3’。

提取番茄叶片的RNA，通过反转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用上游引物和下游引物PCR扩增番茄PSKR1基因编码区全长，扩增产物酶切转化后连接到具有35S启动子的表达载体pFGC1008-3HA上，该表达载体pFGC1008-3HA具体为：在过表达载体pFGC1008中加入了3个HA标签蛋白，HA标签蛋白为植物可选择性标记，以便于对转基因番茄植株进行鉴定及筛选。重组质粒构建成功后，再通过电击转化至根癌农杆菌GV3101菌株中，接着用转化的农杆菌侵染番茄子叶，进行组织培养，筛选获得OE:PSKR1 T0代植株，取嫩叶叶片提取蛋白后进行Western blot验证，具有目的条带的T0代株系用于连续繁种筛选，并获得两个纯合的T2代株系OE:PSKR1-1和OE:PSKR1-2(如图1所示)。

实施例2

PSKR1基因过表达植株的高温逆境抗性研究

将3-4周大小的番茄幼苗放入人工气候培养箱，12小时光照12小时黑暗，光强200μmol m^-2s^-1，温度设置为45℃的高温处理或25℃的常温处理，期间及时补充水分，防止幼苗干旱。两天后发现高温条件下野生型对照植株WT比PSKR1基因过表达植株OE:PSKR1-1和OE:PSKR1-2萎蔫更加严重，选取其中代表性植株进行拍照，同时测定番茄植株PSII最大光化学效率(Fv/Fm)和相对电导率。

其中，植物PSII最大光化学效率(Fv/Fm)测定方法为：将不同温度处理后的番茄植株置于暗环境适应30min后，利用德国Heinz-Walz公司生产的Imaging-PAM调制荧光成像***照射检测光(<0.5μmol m^-2s^-1)获得最小荧光Fo，再照射饱和脉冲光(4000μmol m^-2s^-1)获得最大荧光Fm。荧光参数计算方法为：Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm。

相对电导率测定：称取0.3g番茄叶片并用dH₂O将叶片洗净，去主叶脉后剪成1cm²的碎块置50mL离心管中，加入20mL dH₂O。室温200rpm震荡2h后测得电导率EL1。样品95℃水浴15min，冷却至室温测定电导率为EL2。相对电导率EL(％)＝EL1/EL2×100。

结果显示，PSKR1基因过表达能显著提高番茄对高温逆境的抗性(图2中的A)。在番茄植株遭遇高温胁迫后，PSKR1基因过表达植株OE:PSKR1-1的PSII最大光化学效率显著高于相同条件对照处理的WT番茄植株(图2中的B)，同时能够有效降低高温介导相对电导率的提高(图2中的C)。

实施例3

植物多肽PSK外源处理对植株高温逆境抗性的影响

将0.85g PSK缓慢加入100mL的水，搅拌直至充分溶解得到混合溶液；往100mL混合溶液中先后加入9.9L水和2.5mL有机硅混合均匀成稀释液(制剂工作液)后使用。

将制剂工作液均匀喷施苗龄为五叶一心的番茄叶片表面，直至两面叶片完全湿润，且制剂工作液不呈水滴状流下，每天晚6点喷施1次持续喷施3天，以喷施清水的番茄植株作为对照。

对PSK外源喷施及对照处理后的番茄植株进行不同温度处理。番茄植株置于人工气候培养箱中，光强为200μmol m^-2s^-1，温度设置为45℃的高温处理或25℃的常温处理。期间及时补充水分，防止植株干旱缺水。不同温度处理10小时后，将高温处理组与常温处理组番茄植株进行比较，拍摄植物温度响应表型图，同时测定番茄植株PSII最大光化学效率(Fv/Fm)和相对电导率。

结果显示，植物多肽PSK外源处理能显著提高番茄对高温逆境的抗性(图3中的A)。PSK外源处理的番茄植株遭遇高温胁迫后，其PSII最大光化学效率(Fv/Fm)显著高于对照处理的番茄植株(图3中的B)；同时外源处理PSK能有效降低高温介导相对电导率的提高(图3中的C)。

实施例4

PSKR1基因过表达植株花粉的高温逆境抗性研究

番茄开花大约10d为小孢子母细胞减数***期，这个阶段被认为是对高温胁迫最敏感的发育时期。将出现花序的野生型和PSKR1基因过表达植株在39℃高温下胁迫处理3h后重新置于正常培养条件下生长，到开花时进行花粉活力和花粉萌发的测定。

花粉活力检测方法：采用荧光素二醋酸酯溶液(Fluorescein diacetate，FDA)染色法检测番茄花粉活力。以2mg mL^-1的FDA丙酮溶液为母液并于4℃避光保存，以0.5M蔗糖溶液稀释100倍后的溶液作为工作液。取番茄早上刚开的花，将花药中的花粉均匀散落在滴有FDA工作液的载玻片上，28℃避光保湿染色1h后，盖上盖玻片，在荧光显微镜(Leica)下观察并拍照统计。

花粉体外萌发率检测方法：花粉体外萌发采用苯胺蓝(Sigma-aldrich溶液对生长的花粉管进行染色，以0.1％的苯胺蓝溶液为工作液。取番茄早上刚开的花，将花药中的花粉均匀散落在滴有花粉体外萌发半固体培养基的载玻片上，28℃避光保湿培养1h后，滴加20μL 0.1％的苯胺蓝溶液染色5min，盖上盖玻片，在荧光显微镜(Leica)下观察并拍照统计。

结果如图4中的A-D所示，高温条件PSKR1基因过表达植株OE:PSKR1-1的花粉活力和花粉萌发率均高于野生型WT。

实施例5

以对照番茄cDNA为模板，分别扩增PSKR1基因的蛋白编码区胞内片段(SEQ IDNO.6)并重组至pGBKT7载体，HsfA1a片段并重组至pGADT7载体。将上述pGBKT7和pGADT7共同转化到酵母AH109菌株。

具体操作步骤如下：挑取在YPAD培养基上的AH109单菌落至3mL YPDA中，250rpm，30min振荡培养8h，取约200μL菌液转移到含20mL YPDA的50mL离心管中，同样条件下培养过夜。当OD600数值到达0.6-0.8之间时，4000rpm，5min离心，弃上清。用TE/LiAc重悬，4000rpm，5min离心，弃上清。再用TE/LiAc重悬，制得酵母感受态。将上述重组的pGBKT7和pGADT7，鲑鱼***DNA，PEG/LiAc与酵母感受态混合，30℃静置30min，加入60μL二甲亚砜。42℃水浴15min，冰上放置5min后离心去上清，加入100μL无菌ddH₂O，涂抹于营养缺陷型固体培养基SD-Trp-Leu，30℃培养3-4天。挑取成功转入两个重组质粒的单克隆酵母用SD-Trp-Leu液体培养基培养，至OD600数值到达0.6-0.8之间，用4000rpm，5min离心,弃上清。用无菌ddH₂O重悬至OD600数值到达0.3，并分别稀释10倍，100倍。吸取10μL菌液，分别滴至SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade固体培养基30℃培养3-4天观察结果。

如图5所示，酵母菌落在SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade固体培养基均生长良好，说明PSKR1基因能够与热激转录因子HsfA1a互作。

以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安庆市长三角未来产业研究院

浙江大学

<120> 多肽受体PSKR1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2904

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtgtgt tgcaagtttg tgtgatcttt ttgtttcttg ggatttgctt acaagcacaa 60

tctcaaaatc tccagaactt gatatgtaat ccaaaagatt tgaaagcact tgagggtttt 120

gtgaagagtt tagagacagt tattgatttc tgggatttgg ggaattctac aaattgttgt 180

aatttggtag gtgttacttg tgattctggg agggtggtga agttggagct tgggaaaaga 240

aggttaaatg ggaaactttc tgaatcttta ggtaatttgg atgagctaag aacccttaat 300

ctatctcaca atttctttaa aggacctgtt ccttttacac tgttgcattt gtctaaattg 360

gaagtattag acttgagcaa taatgatttc tttggattgt ttcctagtag catgaacttg 420

cctttgcttc aagttttcaa tatatctgat aattcctttg gaggaccagt tcctttgggt 480

atctgtgaaa attcaactag agtttctgtt attaagatgg gggttaatta ttttaatggt 540

agtcttccag taggaattgg gaattgtggt tcattaaagc ttttttgtgt tggctctaac 600

cttctgtctg gtagtttgcc tgatgaactg tttaagctat caagattgac tgtattgtct 660

ctacaagaga atcgattctc ggggcagctt agcagtcaga ttggtaatct gtctagtttg 720

gttcatttgg atatttgttc aaatggattt tcaggaaaca ttccggatgt gttcgataga 780

ttagggaagt taacatattt gtcagctcat tcaaataggt tctttggtaa tataccaact 840

tcattggcaa attctgggac tgttagttct cttagtttga gaaataattc tttagggggt 900

atcatagagc ttaattgttc agcaatggtt agtcttgttt cgcttgatct agctacgaat 960

gggttccgtg ggttagttcc tgattatctt cctacttgtc aaaggttgca aactatcaat 1020

ctggctagaa actctttcac tggacaactg ccggaaagtt tcaagaattt tcatagcctt 1080

tcgtcccttt cagtctcgaa caacagtatg cataatattg atgctgctct cagaatttta 1140

cagcattgca agaacttgtc tacgttggtc cttactctga attttcggga tgaggagttg 1200

cctactgatt ctagcctgca gtttagtgag ctgaaagctc tcattattgc caattgcagg 1260

ctaactggag ttgttcctca gtggttgaga aatagctcaa aactgcaact gttagacttg 1320

tcatggaacc gtttgtcggg aacacttcca ccttggattg gagatttcca gtttctattc 1380

tatctggatt tttccaacaa ctcgtttacc ggggagattc cgaaagaaat taccagattg 1440

aagagcctaa tctctgcaat tttgccggaa tttgggaatc tgaaaaggtt acatgttttg 1500

gatctgaaaa gcaacaactt atctgggaca ataccaagta gcctgtctgg tatggcgagc 1560

gtagagaatt tggatctatc ccacaacaat ctgattggca gcataccctc ctctttagtc 1620

caatgcagct ttatgtcaaa gttcagtgtt gcttataaca aactctcagg ggaaattcct 1680

actggaggtc agttcccaac atttccaaca tcaagcttcg agggcaacca aggactctgc 1740

ggtgaacatg gtagtacctg tcgaaatgcc agccaagttc ctcgtgactc ggttgccaaa 1800

ggaaagaggc gcaaaggaac tgtcattggc atgggtattg gcattggtct tggaacgatt 1860

tttcttcttg ccctcatgta cttgattgtt gtacgggcaa gcagtcgaaa agtagttgat 1920

caggaaaagg agctggatgc ttctaacagg gaactggagg acttgggctc aagtctggtc 1980

atatttttcc ataacaagga gaacactaaa gagatgtgtc ttgatgacct tttgaaatgt 2040

actgacaact ttgatcaatc aaatattgtt ggatgtggag gcttcggctt ggtctacaag 2100

gccatccttc gtgatggtag gaaagttgcc atcaagcggc tttcaggtga ctacgggcaa 2160

atggagcgag aattccaagc cgaagttgaa tcactttcaa gagctcagca tccgaatctg 2220

gttcatcttc aaggatattg caagtacaga actgaccggc ttctaattta ttcctacatg 2280

gagaatggaa gtttggatta ttggctgcac gagaaagttg acggacctgc tttattggac 2340

tgggatctga ggcttcaaat tgctcaaggg gctgcaagag gactagcgta cttgcaccta 2400

gcgtgcgagc ctcatatctt gcaccgagat ataaagtcta gtaacattct tcttgacgaa 2460

aatttcgaag ctcacttagc tgatttcggt cttgcaagga ttattcggcc ctacgacact 2520

catgtgacca ctgatgttgt cggaacatta ggctatatac ctcctgaata tggccaagcc 2580

tccgtagcta cctataaagg ggacgtttat agctttggtg tggttctttt ggagcttcta 2640

acatgcaaaa gaccgatgga tccgtgcaag cctagagcaa gccgagattt aatctcttgg 2700

gtgatccaaa tgaagaaaca gaagagggaa actgaagtct ttgatcctct gatatatgac 2760

aagcagcacg caaaggaaat gttattggtt cttgaaatcg cttgcctttg tttgcatgaa 2820

tctcctaaaa taaggccttc ttcgcagcag ttagttactt ggctcgacaa cataaacaca 2880

ccacctgatg ttcatgtgtt ttag 2904

<210> 2

<211> 967

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Val Leu Gln Val Cys Val Ile Phe Leu Phe Leu Gly Ile Cys

1 5 10 15

Leu Gln Ala Gln Ser Gln Asn Leu Gln Asn Leu Ile Cys Asn Pro Lys

20 25 30

Asp Leu Lys Ala Leu Glu Gly Phe Val Lys Ser Leu Glu Thr Val Ile

35 40 45

Asp Phe Trp Asp Leu Gly Asn Ser Thr Asn Cys Cys Asn Leu Val Gly

50 55 60

Val Thr Cys Asp Ser Gly Arg Val Val Lys Leu Glu Leu Gly Lys Arg

65 70 75 80

Arg Leu Asn Gly Lys Leu Ser Glu Ser Leu Gly Asn Leu Asp Glu Leu

85 90 95

Arg Thr Leu Asn Leu Ser His Asn Phe Phe Lys Gly Pro Val Pro Phe

100 105 110

Thr Leu Leu His Leu Ser Lys Leu Glu Val Leu Asp Leu Ser Asn Asn

115 120 125

Asp Phe Phe Gly Leu Phe Pro Ser Ser Met Asn Leu Pro Leu Leu Gln

130 135 140

Val Phe Asn Ile Ser Asp Asn Ser Phe Gly Gly Pro Val Pro Leu Gly

145 150 155 160

Ile Cys Glu Asn Ser Thr Arg Val Ser Val Ile Lys Met Gly Val Asn

165 170 175

Tyr Phe Asn Gly Ser Leu Pro Val Gly Ile Gly Asn Cys Gly Ser Leu

180 185 190

Lys Leu Phe Cys Val Gly Ser Asn Leu Leu Ser Gly Ser Leu Pro Asp

195 200 205

Glu Leu Phe Lys Leu Ser Arg Leu Thr Val Leu Ser Leu Gln Glu Asn

210 215 220

Arg Phe Ser Gly Gln Leu Ser Ser Gln Ile Gly Asn Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Val His Leu Asp Ile Cys Ser Asn Gly Phe Ser Gly Asn Ile Pro Asp

245 250 255

Val Phe Asp Arg Leu Gly Lys Leu Thr Tyr Leu Ser Ala His Ser Asn

260 265 270

Arg Phe Phe Gly Asn Ile Pro Thr Ser Leu Ala Asn Ser Gly Thr Val

275 280 285

Ser Ser Leu Ser Leu Arg Asn Asn Ser Leu Gly Gly Ile Ile Glu Leu

290 295 300

Asn Cys Ser Ala Met Val Ser Leu Val Ser Leu Asp Leu Ala Thr Asn

305 310 315 320

Gly Phe Arg Gly Leu Val Pro Asp Tyr Leu Pro Thr Cys Gln Arg Leu

325 330 335

Gln Thr Ile Asn Leu Ala Arg Asn Ser Phe Thr Gly Gln Leu Pro Glu

340 345 350

Ser Phe Lys Asn Phe His Ser Leu Ser Ser Leu Ser Val Ser Asn Asn

355 360 365

Ser Met His Asn Ile Asp Ala Ala Leu Arg Ile Leu Gln His Cys Lys

370 375 380

Asn Leu Ser Thr Leu Val Leu Thr Leu Asn Phe Arg Asp Glu Glu Leu

385 390 395 400

Pro Thr Asp Ser Ser Leu Gln Phe Ser Glu Leu Lys Ala Leu Ile Ile

405 410 415

Ala Asn Cys Arg Leu Thr Gly Val Val Pro Gln Trp Leu Arg Asn Ser

420 425 430

Ser Lys Leu Gln Leu Leu Asp Leu Ser Trp Asn Arg Leu Ser Gly Thr

435 440 445

Leu Pro Pro Trp Ile Gly Asp Phe Gln Phe Leu Phe Tyr Leu Asp Phe

450 455 460

Ser Asn Asn Ser Phe Thr Gly Glu Ile Pro Lys Glu Ile Thr Arg Leu

465 470 475 480

Lys Ser Leu Ile Ser Ala Ile Leu Pro Glu Phe Gly Asn Leu Lys Arg

485 490 495

Leu His Val Leu Asp Leu Lys Ser Asn Asn Leu Ser Gly Thr Ile Pro

500 505 510

Ser Ser Leu Ser Gly Met Ala Ser Val Glu Asn Leu Asp Leu Ser His

515 520 525

Asn Asn Leu Ile Gly Ser Ile Pro Ser Ser Leu Val Gln Cys Ser Phe

530 535 540

Met Ser Lys Phe Ser Val Ala Tyr Asn Lys Leu Ser Gly Glu Ile Pro

545 550 555 560

Thr Gly Gly Gln Phe Pro Thr Phe Pro Thr Ser Ser Phe Glu Gly Asn

565 570 575

Gln Gly Leu Cys Gly Glu His Gly Ser Thr Cys Arg Asn Ala Ser Gln

580 585 590

Val Pro Arg Asp Ser Val Ala Lys Gly Lys Arg Arg Lys Gly Thr Val

595 600 605

Ile Gly Met Gly Ile Gly Ile Gly Leu Gly Thr Ile Phe Leu Leu Ala

610 615 620

Leu Met Tyr Leu Ile Val Val Arg Ala Ser Ser Arg Lys Val Val Asp

625 630 635 640

Gln Glu Lys Glu Leu Asp Ala Ser Asn Arg Glu Leu Glu Asp Leu Gly

645 650 655

Ser Ser Leu Val Ile Phe Phe His Asn Lys Glu Asn Thr Lys Glu Met

660 665 670

Cys Leu Asp Asp Leu Leu Lys Cys Thr Asp Asn Phe Asp Gln Ser Asn

675 680 685

Ile Val Gly Cys Gly Gly Phe Gly Leu Val Tyr Lys Ala Ile Leu Arg

690 695 700

Asp Gly Arg Lys Val Ala Ile Lys Arg Leu Ser Gly Asp Tyr Gly Gln

705 710 715 720

Met Glu Arg Glu Phe Gln Ala Glu Val Glu Ser Leu Ser Arg Ala Gln

725 730 735

His Pro Asn Leu Val His Leu Gln Gly Tyr Cys Lys Tyr Arg Thr Asp

740 745 750

Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Tyr Met Glu Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp

755 760 765

Leu His Glu Lys Val Asp Gly Pro Ala Leu Leu Asp Trp Asp Leu Arg

770 775 780

Leu Gln Ile Ala Gln Gly Ala Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Leu

785 790 795 800

Ala Cys Glu Pro His Ile Leu His Arg Asp Ile Lys Ser Ser Asn Ile

805 810 815

Leu Leu Asp Glu Asn Phe Glu Ala His Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala

820 825 830

Arg Ile Ile Arg Pro Tyr Asp Thr His Val Thr Thr Asp Val Val Gly

835 840 845

Thr Leu Gly Tyr Ile Pro Pro Glu Tyr Gly Gln Ala Ser Val Ala Thr

850 855 860

Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu

865 870 875 880

Thr Cys Lys Arg Pro Met Asp Pro Cys Lys Pro Arg Ala Ser Arg Asp

885 890 895

Leu Ile Ser Trp Val Ile Gln Met Lys Lys Gln Lys Arg Glu Thr Glu

900 905 910

Val Phe Asp Pro Leu Ile Tyr Asp Lys Gln His Ala Lys Glu Met Leu

915 920 925

Leu Val Leu Glu Ile Ala Cys Leu Cys Leu His Glu Ser Pro Lys Ile

930 935 940

Arg Pro Ser Ser Gln Gln Leu Val Thr Trp Leu Asp Asn Ile Asn Thr

945 950 955 960

Pro Pro Asp Val His Val Phe

965

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggcgcgcc atggtgattt gggagtttct 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggggtaccc ctctccttta cacttgcgat tg 32

<210> 5

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagccga attcttatgg cagcgggaag gctgctgtcg gtgacggagt aggagcgcca 60

atgttgcaga cggcgccggc gccggcgccg atacccagtg cgaatgcgcc gccgccgttt 120

ctggtgaaga cgtatgatat ggtggatgat ccgagtacgg ataagatcgt gtcgtggagt 180

cctacgaata atagttttgt ggtttgggat cctccggagt ttgctaaaga cctacttccg 240

aagtacttta agcataataa cttctccagc tttgttcggc agctgaatac ttatggtttt 300

agaaaggttg atccagaccg ctgggaattt gctaatgagg gattcttaag aggtcagaag 360

cacctgctta aaagtataag tcgacgtaaa cctgctcatg gacatgctca acaacagcag 420

cagccacatg gaaatgctca acaacagatg cagccacctg gacacagtgc atccgttggg 480

gcttgtgtcg aggttgggaa atttgggctt gaagaagagg ttgagaggct gaaaagggac 540

aagaacgtgc ttatgcaaga gctggttagg ctcagacaac agcagcaagc cactgacaat 600

cagttgcaag ggatggtgca gcgccttcaa ggtatggagc tgcgacaaca acaaatgatg 660

tcgttcctgg caaaagctgt caacaggcct ggattcttgg cacagtttgt tcagcagcaa 720

aatgagagta ataagcgaat agctgaaggc agcaagaaac gaaggattaa gcaggatatt 780

gaatcacagg atccatccgt tactcctgcg gatggacaga ttgttaagta ccaacctggg 840

ataaatgagg cagcaaaggc aatgttgagg gagctttcaa aactagattc atctcctaga 900

ttagataact tcagcaacag tcctgaaagt ttcctgattg gtgatggttc accacagtct 960

aatgcatctt caggtcgtgt ttcgggagtc actcttcagg aggtcccacc aacttctggg 1020

aagcccttgc tgaatacagc ttcagcaatt gcaggtcaaa gtttgttgcc agccacttct 1080

gagatgcagt catctcatct tggcacatgt tccgaaatca tcaacaatca attgtcaaac 1140

ataatcccgt tggtaggagg tgaagatttg catcctggtt cactttctgc atccgatatg 1200

attatgcctg agttatcaca gttgcaagga attttgcctg aaaacaatac agatgtgatt 1260

ggatgtgatt ctttcatgga tactagtgca gttgagggaa aagtgggact agatattatt 1320

ggtagttgtt tgtctcctgg tgctgatatt gactggcaga gtggtttgct ggatgaaata 1380

gaagagtttc ctagtgtggg tgaccctttc tgggaaaagt ttctccaaag cccttgttcc 1440

cctgatgctg caatggatga tgatatttca aacacaagtg aaaccaaacc acaaataaat 1500

ggatgggata aaactcagaa catggaacat cttactgaac aaatgggggc tactaatatc 1560

aaacaacaaa aacatatgat ctaa 1584

<210> 6

<211> 893

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggcaagca gtcgaaaagt agttgatcag gaaaaggagc tggatgcttc taacagggaa 60

ctggaggact tgggctcaag tctggtcata tttttccata acaaggagaa cactaaagag 120

atgtgtcttg atgacctttt gaaatgtact gacaactttg atcaatcaaa tattgttgga 180

tgtggaggct tcggcttggt ctacaaggcc atccttcgtg atggtaggaa agttgccatc 240

aagcggcttt caggtgacta cgggcaaatg gagcgagaat tccaagccga agttgaatca 300

ctttcaagag ctcagcatcc gaatctggtt catcttcaag gatattgcaa gtacagaact 360

gaccggcttc taatttattc ctacatggag aatggaagtt tggattattg gctgcacgag 420

aaagttgacg gacctgcttt attggactgg gatctgaggc ttcaaattgc tcaaggggct 480

gcaagaggac tagcgtactt gcacctagcg tgcgagcctc atatcttgca ccgagatata 540

aagtctagta acattcttct tgacgaaaat ttcgaagctc acttagctga tttcggtctt 600

gcaaggatta ttcggcccta cgacactcat gtgaccactg atgttgtcgg aacattaggc 660

tatatacctc ctgaatatgg ccaagcctcc gtagctacct ataaagggga cgtttatagc 720

tttggtgtgg ttcttttgga gcttctaaca tgcaaaagac cgatggatcc gtgcaagcct 780

agagcaagcc gagatttaat ctcttgggtg atccaaatga agaaacagaa gagggaaact 840

gaagtctttg atcctctgat atatgacaag cagcacgcaa aggaaatgtt att 893

Claims

1.PSKR1基因或其编码的蛋白在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用；所述PSKR1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性的方法，其特征在于，在番茄植株中过表达PSKR1基因，所述PSKR1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)构建过表达PSKR1基因的载体；

(2)构建含步骤(1)中用于过表达PSKR1基因的载体的农杆菌基因工程菌；

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述载体为pFGC1008-3HA载体。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述农杆菌基因工程菌为根癌农杆菌GV3101菌株。