CN108192913A - 一种提高植物非生物胁迫抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种转基因方法提高植物非生物胁迫抗性的方法。本发明公开了一种在制备转苔藓PpBURP2基因抗非生物胁迫植物的用途，其特征在于其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或其编码氨基酸序列为至少与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列90％同源性且具有提高植物的抗逆性的氨基酸序列。本发明所述PpBURP2基因，在抗高温、抗旱、抗盐和抗重金属镉胁迫等具有明显的作用，因此可将本发明所述基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，提高植物抗非生物逆境的能力。

Description

一种提高植物非生物胁迫抗性的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及来源于苔藓植物的基因及其在提高植物的非生物胁迫抗性的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，农作物的正常生长对保证我国粮食安全具有重要意义。但我国是一个自然灾害频发的国家，近年来呈现发生频率增高、持续时间加长、影响范围扩大的特点，农作物在生长过程中如果遭遇严重的自然灾害，常造成农作物大量减产。为了实现长期的粮食安全和可持续发展，深入了解植物非生物胁迫生物学是农业科学技术研究的重要目标之一。植物在长期的进化过程中逐渐发展出应对各种各样的非生物逆境的机制，如干旱、高低温、盐碱、重金属污染和滞涝等。苔藓植物作为最早出现的陆生植物的代表，生活周期仍以配子体为主，在植物进化史上占据着重要的地位。挖掘和研究苔藓适应陆地生物进化而来的抗逆基因，尝试将重要的抗逆基因对农作物进行基因工程改造，也是一种有效的获得抗逆农作物新品种的育种手段。

科学研究发现，为抵抗恶劣的环境变化，植物体细胞能感受外界环境的变化并将信号传递到细胞内，诱导细胞启动表达各种抗逆基因共同来抵御不良环境对植物体的伤害。包含BURP区域的蛋白是植物中发现的一类蛋白，其基因被认为是是植物ABA信号传导研究中一个重要的参照基因，在植物发育和抗逆反应中发挥着重要作用。最早发现该类基因与植物逆境相关的研究发表在杂志《Molecular And General Genetics综合分子遗传学》(1993，238(1-2):17-25)上，文章题目为“The plant hormone abscisic acid mediatesthe drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22,agene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana(植物激素脱落酸介导的干旱诱导表达但不是种子特异表达的拟南芥基因rd22是脱水胁迫应答基因)”。该文描述了拟南芥基因RD22在脱水和盐胁迫处理下的表达，是脱落酸ABA诱导表达的正相关的基因。后来进一步的研究也确认RD22基因功能与拟南芥抗旱性相关(Harshavardhan etal,PLoS One 2014；9(10):e110065)。

在***树分析的基础上，BURP基因家族的成员可以分成四大类：BNM2-like,USP-like,RD22-like,and PG-like亚家族。RD22-like基因因与植物抗逆相关，被关注得更多。如油菜同源基因BnBDC1与拟南芥中RD22表达模式和蛋白序列呈现高度相似(Yu et al,PhysiolPlantarum 2004；122(2):210-218)。但随着研究的深入开展，发现RD22-like在逆境胁迫中的角色十分复杂。来自于红树林(Bruguieragymnorrhiza)的BgBDC3在盐处理下，表达趋势刚好与拟南芥RD22相反(Banzai et al,2002)；来源于葡萄(Vitis vinifera)的3个RD22基因(VvRD22a、VvRD22b和VvRD22c)对盐胁迫和ABA处理的响应表现不同(Matus etal,PLoSOne 2014；9(10):e110372)。但预期外的结果也被发现，如来源于水稻(Oryzasativa)的OsBURP16的超表达反而引起水稻对非生物胁迫更敏感(Liu et al,PlantCellEnviron 2014；37(5):1144-1158)。但来源于大豆(Glycine max)的RD22类基因GmRD22响应非生物胁迫诱导，通过原生质体***鉴定方法间接说明了转基因拟南芥和水稻的抗盐能力提高(Wang et al,Plant,Cell&Environment 2012；35(11):1932-1947)。在另一篇文章中，发现大豆BURP基因Sali3-2还提高了拟南芥耐铜离子和镉离子胁迫能力(Tang etal,PLoS One 2014；9(6):e98830)。上面这些研究说明BURP家族中基因在逆境胁迫中扮演的角色并不一致，其在逆境中发挥作用的机制仍不够明晰，更古老物种中该类基因在逆境中的作用还无人涉及，如来源于苔藓植物的BURP家族基因在赋予植物抗逆的角色还未被人报道，寻找更高效抗非生物逆境基因应用于我国最重要的粮食作物水稻仍具有重要意义。

发明内容

本发明是基于一部分来源于苔藓的PpBURP2基因正调控植物抗旱、耐高温和耐重金属镉等非生物胁迫抗性的发现。从某种方面来说，这个发明提供了基因工程植物超表达PpBURP2基因增强对非生物胁迫的抗性和构建基因工程植物方法，以拓展当前植物生物技术中的可应用于提高植物抗非生物胁迫能力的基因，获得新型转基因抗逆植物品种。

为此，本发明公开了一种含有编码核酸的多核苷酸的分离的DNA分子在制备转基因抗逆植物品种中的用途，其中：

其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或

其多核苷酸序列为编码PpBURP2蛋白的多核苷酸。

另一方面，本发明公开了该分离的DNA序列连接至植物中组成性启动子，其中，所述核酸能超表达PpBURP2基因。

另一方面，本发明公开了一种植物包含重组核酸含有启动子可操作地连接至编码PpBURP2的多核苷酸，其中，所述编码氨基酸序列与SEQ ID NO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。

另一方面，本发明还公开了一种改善植物对干旱、高温和重金属镉毒害等非生物胁迫抗性的方法，其方法包含向植物导入核苷酸序列，该核苷酸序列含有启动子操作连接至编码PpBURP2的多核苷酸，其中，所述编码氨基酸序列与SEQ ID NO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。。

在下列实施例中，所述核酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述的植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘或黄瓜中任意一种。

本发明的有益效果是

附图说明

图1PpBURP2为蛋白结构图。

图2为表达载体pCB4004-PpBURP2的构建示意图；

图3为在转基因水稻叶片中PpBURP2基因相对表达量水平图。

图4.幼苗期转PpBURP2基因水稻耐高温胁迫处理试验。

图5.幼苗期转PpBURP2基因水稻模拟抗旱处理试验。

图6.幼苗期转PpBURP2基因水稻盐胁迫处理试验。

图7.幼苗期转PpBURP2基因水稻耐重金属镉处理试验。

图8.成株期转PpBURP2基因水稻耐重金属镉处理试验。

具体实施方式

在本文，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

图1PpBURP2为蛋白结构图，其中，采用SignalP 4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对SEQ ID NO.2蛋白序列进行信号肽剪切位点分析，预测位点1-38为信号肽序列，用下划线标示；采用NCBI中BLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对SEQ ID NO.2蛋白序列分析，预测位点148-364为BURPdomain，用双下划线标示。

图2为表达载体pCB4004-PpBURP2的构建示意图。

图3为在转基因水稻叶片中PpBURP2基因相对表达量水平图，其中，采用实时RT-real-time PCR方法检测PpBURP2基因在转基因水稻叶片中表达量，其中，横轴的编号T1-T8表示不同转PpBURP2基因水稻株系；纵轴表示：转基因株系PpBURP2基因与参照基因actin1表达量比值。

图4.幼苗期转PpBURP2基因水稻耐高温胁迫处理试验。当水稻生长到4叶期时，将幼苗移置到高温大棚中，32℃-50℃的高温环境下生长12天后，移植到室温25℃左右的环境下生长3天后进行株高统计，单位为厘米。A，高温处理前；B，高温处理后；C，高温处理后苗长；D，高温处理后幼苗鲜重。ZH11表示非转基因野生型水稻；S2G221-230编号表示转PpBURP2基因水稻株系。

图5.幼苗期转PpBURP2基因水稻模拟抗旱处理试验。当水稻生长到4叶期时，开始使用含20％PEG6000的营养液培养，处理10天后复水处理使用正常营养液，5天后统计植株的存活率。ZH11表示非转基因野生型水稻；G227、G229编号表示转PpBURP2基因水稻株系。

图6.幼苗期转PpBURP2基因水稻盐胁迫处理试验。当水稻生长到4叶期时，开始使用含150mM NaCl的营养液培养，处理10天后复水处理使用正常营养液，7天后统计植株的存活率，其中，ZH11表示非转基因野生型水稻；G227、G229编号表示转PpBURP2基因水稻株系。

图7.幼苗期转PpBURP2基因水稻耐重金属镉处理试验。当水稻生长到4叶期时，开始使用含75mM CdCl₂的营养液浇灌水稻，处理7天后使用正常营养液复水处理，3天后统计植株的高度、根长、鲜重和干重等。ZH11表示非转基因野生型水稻；S2G221-227编号表示转PpBURP2基因水稻。

图8.成株期转PpBURP2基因水稻耐重金属镉处理试验。在同一营养钵中分别种植转基因和对照水稻，使用含150mM CdCl₂自来水灌溉2个月，然后使用自来水灌溉。4个月后水稻成熟取穗统计结实率。ZH11表示非转基因野生型水稻；S2G227和228编号表示转PpBURP2基因水稻株系。*表示P<0.05。

本发明还包括能编码具有PpBURP2相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括若干个核苷酸的缺失、***和/或取代，通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个的核苷酸的缺失、***和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个，通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内的核苷酸。

在本发明中，还包括具有与PpBURP2相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括若干个氨基酸的缺失、***和/或取代，通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个以及在C末端和/或N末端添加一个或数个，通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh,1970)分析(GCG程序)确定，其中，参数gap creation penalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。

通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。

本发明所分离出的多核苷酸，包括、SEQ ID NO.1编码PpBURP2基因的核苷酸序列；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.1中从核苷酸第78-1181位的核苷酸序列杂交；或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的PpBURP2基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因，也可以直接采用基因合成的方法合成。同样也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、cDNA中扩增得到本方面的PpBURP2基因以及任何一段DNA或其同源的一段DNA。

用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,AcademyPress,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲***载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3',5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段，然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段，然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

利用同源重组方法，将携带有特定序列接头或同源序列接头的多核苷酸与载体进行同源重组，将欲***载体DNA内的DNA区段与同样携带有特定序列或同源序列的载体通过重组酶的作用形成重组DNA分子。

多核苷酸***物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因nptⅡ、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)基因dhfr；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因EPSPS。适当宿主的代表性例子包括原生质体细胞和植物细胞，上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

目的基因或目的多核苷酸的转化方法：一类是载体介导的转化方法，即将目的基因***到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质***法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。

本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。

本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节***的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。

通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：分离克隆PpBURP2基因

户外挖取生长旺盛的苔藓，采用TRIzol试剂(GIBCO BRL,USA)抽提苔藓总RNA。利用反转录酶MLV(Tiangen，China)将其反转录成cDNA。用引物F(5’-atgctctcagaattgaggctt gg-3’)和引物R

(5‘-ttactgctgaacgggtacccaaatc-3’)，扩增出基因的全长编码cDNA(110bp)。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃60sec共35个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(Promega,USA),筛选阳性克隆并测序，获得PpBURP2基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)。PpBURP2推测的蛋白序列进行同源基因的比对分析，发现该基因编码蛋白为包含BURP domain的家族蛋白，在第148-364氨基酸为保守的BURP区域(见图1)。为了进一步了解该蛋白序列其他的一些属性，采用SignalP 4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对SEQ ID NO.2蛋白序列进行信号肽剪切位点分析，预测位点1-38为信号肽序列(见图1)。

实施例2：PpBURP2基因超表达载体的构建和遗传转化

2.1含目的基因表达载体的构建：

根据PpBURP2基因的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物和下游引物上分别添加接头引物，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真Taq酶pfu酶(Tiangen，China)进行PCR扩增后，将PpBURP2基因cDNA克隆至中间载体(如pDONR207)，进一步转化大肠杆菌DH5α，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，然后使用LR Clonase重组酶与包含启动子和终止子蛋白植物表达载体载体pCB4004进行重组反应，构成了一个完整的表达单元(见图2)，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。

2.2水稻遗传转化

2.2.1种子消毒

成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用30％NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上，每皿约30粒，于28℃暗培养。

2.2.2继代培养

经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。

2.2.3农杆菌的培养

在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含AS 100uM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。AS＝acetosringone

2.2.4共培养

将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+AS 100uM)上，28℃暗培养三天。

2.2.5洗菌

共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。

2.2.6选择培养

将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 50mg/L+Cef 250mg/L)上，再选择2周。

2.2.7分化培养

将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef 200mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。

2.2.8生根培养

约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg 15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。

2.2.9转基因苗的移栽

当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

实施例4：PpBURP2基因在转基因植株中的表达分析

3.1材料准备

转基因T1代水稻种子发芽后，移植于液体培养基，所述培养基为自来水配制成1/5MS大量元素。幼苗生长15 d后，剪取叶片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。

3.2无DNA的总RNA制备

按上海全式金生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman Coulter^TM 640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5μg，加入1μ LDNAaseI和1μL 10×反应缓冲液，补足体积至10μL，常温反应30 min，然后每管加入1μL 2 mmol L-1 EDTA终止反应，最后在70℃加热10 min使DNAaseI失活。

3.3第一链cDNA的合成

将上述RNA样品各取2μL，按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4μL 25 mmol L-1 MgCl2，2μL10×RT缓冲液，2μL dNTP混和液和1μL oligo(dT)15，加水补足体积到18.5μL，在70℃加热变性10min，快速在冰上冷却。然后加0.5μL RNase inhibitor和1μLAMVRTase，在42℃水浴60 min，70℃下加热10 min终止反应。

3.4定量PCR

根据基因PpBURP2的序列设计特异性引物BF:5’-CAATTGTACTACTGCCACCACG-3’，BR:5’-CCCACATGGTTGTATTCAAATG-3’用于荧光定量PCR，根据水稻Actin基因(GenBankaccession No.AY212324)的cDNA序列设计特异性引物AF:5’-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’，AR:5’-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国ABI7000定量PCR仪，每一个PCR设置一次重复。反应体系包含SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)10μL，正反向引物各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至25μL。反应程序为：95℃30s，然后在95℃10s，61℃34s下循环40次，设定在每个循环中60℃34s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取1μL RNA作为模板进行PCR，方法同上。

3.5分析方法

Ct是通过7000system SDS Version1.2.3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为0.2后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2^-ΔΔCT，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图。

3.6分析结果

以空白非转基因日本晴品种为参照，分别检测了8个独立的转基因株系T1-T8，除转基因株系T8表达量没有显著增强外，其它转基因株系均有较强的增强表达，尤其是株系T2和T5表达量在500倍以上，具体参照见图3，说明该基因导入到水稻后在叶片中得到明显的异位高表达，可应用于进一步的转基因水稻研究。

实施例5：PpBURP2基因过表达转基因T3代家系植株在高温胁迫条件下的生长状况

选取了5个实施例2中PpBURP2基因超量表达转基因T3代家系植株进行了苗期高温胁迫实验。具体步骤如下：在96孔PCR板上每份材料种植半板约20株左右，当植株长至4叶期时，将幼苗移置到高温大棚中，高温环境下(32℃-50℃)生长12天后，移植到室温(25℃)生长，观察转基因植株的生长状况。结果表明，本发明克隆的PpBURP2基因超表达的5份转基因植株株系的生长在正常条件下与对照无显著差异，但在高温迫处理后，对照非转基因植株生长明显地比转基因植株缓慢，在处理12天后，转移到正常生长条件下，转基因植株能够快速恢复生长，而非转基因植株生长受到明显抑制，一个星期后才开始长出新叶(见图4a和图4b)。处理后将这些植株分别统计苗长和鲜重数据(见图4c和图4d)，也说明了过表达该基因可以加强水稻抵御高温胁迫，提高了植株的抗高温能力。

实施例6：PpBURP2基因过表达转基因T3代家系植株在模拟干旱胁迫条件下的生长状况

选取了5个实施例2中PpBURP2基因超量表达转基因T3代家系植株进行了苗期渗透胁迫实验。具体步骤如下：在96孔PCR板上每份材料种植半板约24株，当植株长至4叶期时，将幼苗移置到含20％PEG6000营养液中室温(25℃)生长10天后复水处理，转换为正常营养液中培养5天，观察转基因植株的生长状况。结果表明，本发明克隆的PpBURP2基因超表达的转基因植株株系的生长在正常条件下与对照无显著差异，但在渗透迫处理后，对照非转基因植株叶片卷曲明显地早于转基因植株，在处理10天后，转移到正常生长条件下，转基因植株能成活率明显高于非转基因植株(见图5)，说明了过表达该基因可以加强水稻耐渗透胁迫能力，提高了植株的抗旱能力。

实施例7：PpBURP2基因过表达转基因T3代家系植株在盐胁迫条件下的生长状况

选取了5个实施例2中PpBURP2基因超量表达转基因T3代家系植株进行了苗期盐胁迫实验。具体步骤如下：在96孔PCR板上每份材料种植半板约24株，当植株长至4叶期时，将幼苗移置到含150mM NaCl营养液中室温(25℃)生长10天后复水处理，转换为正常营养液中培养7天，观察转基因植株的生长状况。结果表明，本发明克隆的PpBURP2基因超表达的转基因植株株系的生长在正常条件下与对照无显著差异，但在盐迫处理后，对照非转基因植株叶片卷曲明显地早于转基因植株，在处理10天后，转移到正常生长条件下，转基因植株能成活率明显高于非转基因植株(见图6)，说明了过表达该基因可以加强水稻抗盐胁迫能力。

实施例8：PpBURP2基因过表达转基因T3代家系植株在金属镉胁迫条件下的生长状况

选取了4个实施例2中PpBURP2基因超量表达转基因T3代家系植株进行了苗期金属镉透胁迫实验。具体步骤如下：在96孔PCR板上每份材料种植半板约24株，当植株长至4叶期时，将幼苗移置到含75mM CdCl₂营养液中室温(25℃)生长7天后，转换为正常营养液中培养3天，观察转基因植株的生长状况。在重金属镉处理的情况下，对照非转基因植株生长明显受到抑制，而转基因植株的耐受性明显好于对照，除了根长外，其植株的高度比对照高，而且其鲜重和干重显著高于对照(见图7)，说明了过表达该基因可以加强水稻耐重金属镉胁迫能力。

实施例8：PpBURP2基因过表达转基因T3代家系植株在金属镉胁迫条件下的成株期结实率观察

选取了2个实施例2中PpBURP2基因过量表达转基因T3代家系植株进行了成株期重金属镉透胁迫实验。具体步骤如下：将转基因植株和非转基因对照植株幼苗移栽到营养钵中，每一钵中种植5株转基因植株和5株对照，每当营养钵中水分减少时，使用含150mMCdCl₂自来水灌溉，持续灌溉2个月，之后使用自来水灌溉。最后观察植株开花结实情况。使用150mM CdCl₂自来水灌溉，明显抑制水稻的生长，开花期延迟。总体上来看，CdCl₂自来水灌溉会抑制水稻的生长，减少分蘖，降低水稻结实率，但分蘖数之间无显著差异。与同一营养钵中的对照植株ZH11相比，转PpBURP2植株结实率显著高于对照植株(见图8)，说明超表达该基因可以提高了重金属镉胁迫下的水稻的结实率。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (6)

1.一种苔藓基因PpBURP2在制备转基因抗非生物胁迫植物中的应用，其特征在于：所述苔藓基因PpBURP2的编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苔藓基因PpBURP2核酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种含有权利要求1所述苔藓基因PpBURP2的重组载体，其特征在于，所述重组载体的苔藓基因PpBURP2核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种生产胁迫耐性的转基因植物的方法，其特征在于：

该方法包括以下步骤：

1)、将苔藓基因可操作地连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体；

2)、将步骤1)所得的植物表达载体转入植物细胞；

3)、经筛选获得的转化细胞，再生为植物及其后代，所述的植物包括植物细胞、植物组织或植物种子。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱、大豆、黄瓜、苜蓿、马铃薯、蓖麻、花生、棉花、烟草、柑橘或黄瓜中任意一种。

6.一种包含权利要求1所述的苔藓基因，其特征在于，所述苔藓基因在制备具有高温、干旱、盐和重金属镉等非生物胁迫耐性的转基因植物方面的应用。