CN109536511A - 一个棉花肌动蛋白基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

一个棉花肌动蛋白基因突变体及其应用，属于基因工程技术领域。该突变体基因cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的基因突变体能重塑拟南芥和棉花的外观形态，且获得的转基因植株均能正常开花结果，转化基因能稳定遗传至下一代，故该基因可以进一步运用于园艺观赏植物的塑型，培育出姿态各异的新品种，为园艺花卉型态塑造提供另一个途径；农作物、果树等矮化栽培可以减少不必要的养分消耗，有利于产量提高，便于收割和采摘；本发明为植物型态研究和细胞骨架调控提供理论依据；本发明中的转基因棉花将成为植物细胞骨架研究的有用材料。

Description

一个棉花肌动蛋白基因突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一个棉花肌动蛋白基因突变体及其应用。

背景技术

肌动蛋白是一种单一多肽链球状蛋白质，由375-377个氨基酸残基组成，分子量为42KD，是细胞骨架构建的原材料。肌动蛋白存在于所有的真核生物中，并参与真核生物的几乎所有的生命活动。微丝是由肌动蛋白分子螺旋聚合成的纤丝，即肌动蛋白丝，是细胞骨架的主要成分之一。肌动蛋白单体（G-actin）具有ATP结合位点，当两个肌动蛋白单体都结合了ATP时，由于亲和力增加而相互聚合；当ATP水解为ADP时，单体间亲和力下降而相互解聚。微丝的组装和去组装的动力学过程与细胞质内物质运输、细胞迁移、形态发生和分化等多种细胞运动密切相关。

在高等植物中，肌动蛋白基因（Actin）是属于多基因家族基因。肌动蛋白基因又被称为管家基因，具有高度的保守性，可以用来作为内参基因。目前，许多高等植物的Actin基因已经被克隆和研究。David等于1990年首次分离并解析了水稻的Actin基因Racl 的序列及其结构特征，随后又报道了水稻Actin基因家族，确定了四个水稻肌动蛋白基因的结构，并揭示了水稻Actin基因的内含子在位置和数量上都具有保守性，但比对发现植物Actin基因在序列上具有种内和种间高差异性的特点。此外，研究显示这四个基因的转录表达模式不同，表明这些基因的转录调控和细胞功能可能不同。拟南芥的Actin家族有10个成员，可分为6个进化分支，并且有5种不同的表达模式。ACT1、ACT3、ACT4、ACT11、ACT12是生殖型肌动蛋白，ACT2、ACT7、ACT8是营养型肌动蛋白。ACT1主要在成熟的花粉、正在伸长的花粉管、胚珠中表达，当它在营养器官中错误表达时，可使植株矮小且器官形态改变；而ACT2在除了花粉以外的所有的营养器官中均有表达。杨树的Actin家族包括8个成员基因，他们在成熟的木质部中的表达量都明显增加，推测其表达可能和次生组织的形成有关。还有很多高等植物如豌豆、向日葵和花生等都相继克隆到了Actin基因，但在这些植物中Actin基因在各时期各器官的表达都比较稳定。在棉花中，已克隆到的Actin基因有15个（GhACT1-GhACT15），可分为9个分支，研究表明GhACT1在棉纤维的发育中起了重要作用。

为了调查肌动蛋白细胞骨架在纤维发育过程中的作用，Li等人对陆地棉中发现的15个Actin基因 (GhACT) 进行了克隆和研究。RNA印迹和定量PCR结果显示，GhACT1主要在纤维细胞中表达。 RNA干涉GhACT1基因，能显著降低其mRNA和蛋白水平，并导致纤维中的肌动蛋白细胞骨架网络被破坏，使得棉纤维伸长缓慢、纤维丝少且排列不整齐，这表明GhACT1在纤维伸长中起了重要作用。此外，应用比较蛋白质组学方法，通过对比Li1突变体和相应野生型棉花的细胞骨架相关蛋白，结果显示在突变体Li1的纤维中，这些蛋白的丰度较野生型显著下降，从而导致肌动蛋白细胞骨架的结构变形，微管组织被改变，并严重破坏囊泡运输。

综上所述，肌动蛋白对维持植株各个器官形态方面有重要作用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一个棉花肌动蛋白基因突变体及其应用的技术方案。

所述的棉花肌动蛋白基因突变体GhACT17DM，其特征在于该基因突变体与GhACT17D基因相比，第194个碱基由G突变成T，该突变体基因cDNA ORF的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

所述的棉花肌动蛋白基因突变体GhACT17DM翻译的蛋白质，其特征在于该蛋白质与GhACT17D基因翻译的蛋白质相比，第65个氨基酸由甘氨酸突变成缬氨酸，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的基因在拟南芥或棉花塑型培育中的应用。

本发明基于生物信息学分析和现有分子生物学技术，在陆地棉李氏超短纤维突变体（Ligon lintless-1，Li1）材料中克隆到一个属于肌动蛋白基因家族的新成员，命名为GhACT17。该基因的突变体（GhACT17DM）能使拟南芥和棉花等植物的型态表现为扭曲和矮化。

本发明的有益效果在于：1、GhACT17DM基因能重塑拟南芥和棉花的外观形态，且获得的转基因植株均能正常开花结果，转化基因能稳定遗传至下一代，故该基因可以进一步运用于园艺观赏植物的塑型，培育出姿态各异的新品种，为园艺花卉型态塑造提供另一个途径；2、农作物、果树等矮化栽培可以减少不必要的养分消耗，有利于产量提高，便于收割和采摘。因此，GhACT17DM也为农林果树矮化栽培提供了新的基因和途径；3、本发明为植物型态研究和细胞骨架调控提供理论依据；4、本发明中的转基因棉花将成为植物细胞骨架研究的有用材料。

附图说明

图1 为阳性转基因拟南芥中目的基因PCR 鉴定；

图2 为转基因拟南芥表型鉴定；

图3为各类型转基因拟南芥中的基因相对表达量；

图4为 southern blot 验证转基因棉花；

图5为转基因棉花的表型，图中N:表示转基因杂合子中分离到的阴性植株，性状同野生型；

图6a、6b和6c为转基因棉花中基因表达水平，图中N:表示转基因杂合子中分离到的阴性植株，性状同野生型；4-2、4-3和4-5均来组EM-4；10-2、10-4和10-5均来组EM-10； 24-1、24-3和24-4均来组EM-24。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

实施例1：GhACT17DM基因cDNA获得及植物表达载体构建

1）引物设计

根据NCBI已报道的棉花基因组序列，通过生物信息学比对，确定GhACT17 基因DNA序列，根据该序列设计编码框（ORF）全长序列的引物，ORF序列预计大小为1134 bp。引物序列如下：

DHQ-ACT-F2：5' ATGGCAGAAAACGAAGACA 3'（如SEQ ID NO：3所示）；

DHQ-ACT-R2：5' CTAGAAGCATTTCCTGTGCA 3'（如SEQ ID NO：4所示）。

2）Li1扭曲形棉花叶片总RNA提取

取幼嫩叶片加液氮研磨至粉末状，然后使用试剂盒RNAprep pure Plant Kit （天根，中国）提取叶片总RNA。经分光光度计检测RNA 浓度及质量，浓度约为500ng/ul，OD260/OD280=2.0，OD260/OD230=2.0，可用于下一步实验。提取的总RNA立即用于下一步实验，剩余样品于-80度保存。

3）cDNA第一链合成

a）0.2 ml离心管中，加入以下试剂

于65℃水浴10 min，迅速置于冰上，后移置冰上迅速冷却。

b）离心管中依次加入：

c）反应混合物轻轻混匀后离心3sec，42℃孵育1 hr；

d）75℃ 15 min终止反应，立刻置于冰上。

4）cDNA扩增

a）使用高保真酶进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

b）反应混合物轻轻混匀后离心3sec，进行PCR扩增，条件如下：

c）反应停止后，取5 µl PCR产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

5）PCR产物纯化

使用AxyPrep PCR 清洁试剂盒（Axygen），全称按使用说明书操作，回收产物浓度为30ng/ul，片段大小约为1100 bp。

6）PCR产物加A尾

以上混合液72度延伸30min。

7）cDNA片段连接植物过表达载体

将cDNA与经XcmI酶切过的植物过表达载体pCXSN-CaMV35S进行连接反应，即在 0.2 ml的离心管中依次加入以下试剂：

轻轻混匀后离心3sec，16℃连接过夜。

8）重组质粒转化及鉴定

a）取50 µL E.coli感受态细胞加入 5µL的连接产物，轻轻混匀后，冰上静置 30 min；

b）将上述离心管转移入 42℃ 恒温水浴中热击60 s，立即置冰上2 min；

c）加入 500 µL的LB液体培养基；

d）37℃，200 rpm，摇床培养 1 hr;

e）取 50 µL转化后的菌液在超静台内均匀涂布于含Kan (50 µg/ml)的 LB 固体平板上，37℃倒置培养16 hr；

f）挑单斑于600 µL含Kan(50 µg/ml)的 LB液体培养基，于37℃摇床，250 rpm，培养 6hr；

g）菌液PCR鉴定。以培养好的菌液为模板进行PCR扩增，阳性单斑加入甘油至15%后于-20度保存；

h）测序鉴定。阳性单斑送测序公司测序鉴定，获得准确的GhACT17DM ORF 序列，如SEQID NO：1所示，其翻译蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，至此，GhACT17DM植物表达载体pCaMV35S::GhACT17DM构建完成。同时构建野生型GhACT17的表达载体作为阴性对照：pCaMV35S::GhACT17。

9）重组质粒提取

使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen）提取阳性质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，-20度保存备用，质粒浓度约为200ng/ul。

10）重组质粒转化农杆菌

a）取100 µL GV3101感受态细胞加入 5 µL(1ug)的目的载体，轻轻混匀后，冰上静置30 min；

b）液氮快速冷却1min后转置37℃水浴2min；

c）加入 250 µL的LB液体培养基；

d）28℃，150 rpm，摇床培养 2hr;

e）取全部菌液在超静台内均匀涂布于含Rif（25µg/ml）和Kan (50 µg/ml)的 LB 固体平板上，于28℃ 培养箱倒置培养24hr；

f）挑单斑于600 µL含Rif和Kan的 LB培养基，于28℃摇床，200 rpm，培养 16 hr；

g）菌液PCR鉴定。以培养好的菌液为模板进行PCR扩增，阳性单斑加入甘油至15%后于-80度保存。

实施例2：转基因拟南芥的获得

1）拟南芥种植

a）种子播种前处理：取适量的拟南芥种子置于1.5ml离心管中，无菌水冲洗1次，70%的酒精处理90s，无菌水冲洗4次,2%的次氯酸钠处理10min，无菌水处理4次；

b）播种：用枪头吸取适量处理好的拟南芥种子，直接吹打至MS固体培养基上，然后用无菌水将种子铺展开，吸去多余的无菌水，用封口膜封闭培养皿；

c）春化：将播种好的培养皿放置4℃，避光春化2-3天后，培养皿放置于16 h光照，8 h黑暗，22℃，光照平均强度为4,000 lx的条件下进行培养；

d）移苗：待拟南芥种子长出4片真叶即可移栽（约两周），每一个小盆中移栽4颗幼苗，小盆中的土壤为营养土：普通基质=1:3，混合均匀灭菌后即可用于种植。

2）花絮侵染法转化拟南芥

a）拟南芥种植一个月左右开始抽苔，剪去开花主茎，抑制顶端优势，大约一周以后，重新抽出大量侧枝，这时候侧枝具有大量花苞，在转化前一天，剪去已开的花和果荚，并浇足水；

b）取已鉴定的阳性农杆菌200μl于3mlYEP+Rif+Kan培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜，取1ml菌液于50ml相应的培养基中扩大培养，28℃，200rpm振荡培养6h，5000g，10min收集菌液，10ml 1/4MS+6%蔗糖（PH：5.3-5.4）重新悬浮菌液，OD600调至1.2-1.6，最后再加入0.02%的Silwetl-77；

c）将配置好的侵染液倒置培养皿中，使拟南芥花絮侵泡于侵染液中1min，转化完成的拟南芥植株横放，避光培养2天；

d）待拟南芥结实后，收取种子，抗性筛选转基因植株；

e）pCaMV35S::GhACT17和阴性对照pCaMV35S::GhACT17同时转化并获得T0代种子。

3）阳性植株的筛选和鉴定

将获得的转基因拟南芥T0代种子均匀的撒播在MS，含潮霉素B（50mg/l）培养基。在抗性培养基中正常生长的植株初步确定为阳性植株，对筛选出的阳性植株编号并移栽。抗性筛选出的阳性植株培养一个月左右，CTAB法提取每一株抗性拟南芥DNA，并进行目的基因PCR鉴定（图1），获得到GhACT17DM T1代共19个株系，其中扭曲型4个(扭曲型记为DM-II：图2b右和图c; 正常型记为DM-I：图2b中)，GhACT17 T1代共14个株系，其中扭曲型2个（图2a右，归为D-II类型），其余均为正常型（图2a中和2e，归为D-I类型）与野生拟南芥（图2d）无明显差异。

无论是对照组还是突变体组，扭曲型的株系都出现了严重的生长抑制，茎秆表现出弯曲不直，花絮松散，角果明显变短，花柄卷曲使得花开方向各不相同（图2c）。但相比对照组GhACT17转基因株系（图2 a），GhACT17DM转基因扭曲型株系生长受抑制的状态更为严重（图2 b，c）。如图所示，GhACT17转基因扭曲型株系成株（图2 a右， DII类型）的平均高度为21.8cm，其角果平均长度为0.8cm，而GhACT17DM转基因扭曲型株系成株（图2 b，c）的平均高度为10.5cm，其角果平均长度为0.3cm。此外，在GhACT17DM转基因的4个扭曲型株系中，有两个可稳定遗传（编号MT-16、MT-18）并获得F3代，并在其后代中分离出不育***系（图2g），该系植株幼苗期叶盘大小约可育株系（图2 f）的二分之一，且叶片呈现向背面严重卷曲，植株在开花前死亡。同时我们分析了不同类转基因型植株中转化基因的表达量情况（图3），结果显示在不育***系中GhACT17DM的表达量特别低。

肌动蛋白是细胞骨架的组成成分，它的异源表达可能会使新寄主本身产生细胞骨架的组分变化和重排，从而影响新寄主的外观表型。尽管本实验中突变体转基因株系的扭曲程度比对照组要严重的多，但是对照组也出现了扭曲。基于以上理论和结果，GhACT17DM作为棉花的肌动蛋白在拟南芥中表达的上述结果显得证据不足。因此，我们在棉花中进一步转化GhACT17DM和对照组，以深入诠释突变基因对棉花形态的影响，具体请见实施列3。

实施列3：转基因棉花的获得

1）载体构建和转化

a）分别将两种cDNA序列GhACT17DM 和GhACT17 与pGWB408-CaMV35s（CaMV35s启动子）或pGWB407-GbEXPA2 （特异性纤维表达启动子PGbEXPA2）连接，获得pCaMV35s::GhACT17、pCaMV35s::GhACT17DM、pGbEXPA2::GhACT17、pGbEXPA2::GhACT17DM四种重组表达载体。

b）将以上构建好的重组载体转化农杆菌(EHA105)，由农杆菌介导转化入受体棉花G. hirsutum YZ1。

2）转基因棉花鉴定与表型鉴定

a）经抗性初筛后，使用地高辛标记探针进行Southern blotting（图4），验证得到低拷贝株系：分别是3个转pGbEXPA2::GhACT17DM的独立株系(EM4、EM10 和 EM24)；2个转pCaMV35s::GhACT17DM的独立株系（3M3-1和3M3-6）；3个转pCaMV35s::GhACT17D （3W7、3W13和3W46）的独立株系。

b）转基因株系表型情况

使用特异性纤维表达启动子（pGbEXPA2）进行过表达，转化GhACT17DM基因的株系均变现出正常的植株外形，但是其纤维短且紧包裹种子，与突变体Li1的纤维表型一致，而从杂合子中分离到的阴性植株与野生植物无区别（图5a和b）；使用组成型启动子（CaMV35S）进行过表达，转化GhACT17DM基因的株系均变现出茎秆和叶片扭曲、植株矮化，种子表面纤维短且紧裹种子，与突变体Li1的表型几乎一致，而阴性对照组（转化GhACT17）的性状与野生植物无区别（图5c和d）。

表1 转基因棉花株系一览表

3）转基因株系GhACT17DM基因表达情况

我们对以上转基因株系进行目标基因表达的定量检测。在转化植株中，GhACT17基因表达显著，但是其植株依然表现正常，说明野生型GhACT17并不具备导致类似Li1突变体表型的功能（图6c）；在GhACT17DM转化植株中，GhACT17DM基因表达显著，说明GhACT17DM是引起植株Li1突变表型的主要原因（图6a和b）。

GhACT17DM基因能重塑拟南芥和棉花的外观形态，且获得的转基因植株均能正常开花结果，转化基因能稳定遗传至下一代，故该基因可以进一步运用用于园艺观赏植物的塑型，培育出姿态各异的新品种。此外，农作物、果树等矮化栽培可以减少不必要的养分消耗，有利于产量提高，便于收割和采摘。因此，GhACT17DM也望在农林果树栽培方向的运用。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 一个棉花肌动蛋白基因突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1134

<212> DNA

<213> 棉花(cotton)

<400> 1

atggcagaaa acgaagacat tcagcctctt gtttgtgaca atgggactgg aatggtcaag 60

gctggatttg ctggagatga tgctccaaga gctgtattcc ctagcattgt tggtcgccca 120

cgtcacactg gtgtgatggt cggtatgggc caaaaggatg cttatgtggg agatgaagct 180

caatcgaaaa gagttatttt gactttaaag tacccaattg agcatggtat tgttagcaat 240

tgggatgaca tggagaaaat ctggcatcat accttctaca atgagcttcg agttgcccct 300

gaggaacatc cggttctcct cacagaagct cctcttaacc caaaggccaa tcgtgaaaaa 360

atgactcaaa ttatgtttga gacattcaat gcccctgcta tgtatgttgc tatccaagct 420

gttctttcct tgtatgccag tggccgtaca accggtattg ttttggactc tggggatggt 480

gtgagccaca cagtccctat ctatgaaggc tatgctcttc cacatgccat cttgcgtctc 540

gacctagctg gtcgtgatct cactgatgct ctcatgaaaa tattaacgga gcgtggttat 600

tctttcacaa ctacggctga gcgggaaatt gtgagagaca tgaaggagaa actagcttac 660

attgctcttg actatgaaca agagttggag acagcaaaaa ccagctctgc cgttgagaaa 720

agctatgagc tacctgatgg acaggttatt accattgggg ctgaacgatt ccgttgtcca 780

gaagtcctct tccagccatc catgatcggg atggaagctg ctggcattca tgaaacgaca 840

tacaactcaa tcatgaagtg tgatgtggat attaggaagg atctctacgg aaacattgtc 900

ctcagtggtg gcaccactat gttccctgga atcgctgaca ggatgagcaa ggaaatcaca 960

gcattagccc caagcagcat gaagattaaa gtggttgcac caccagagag gaagtatagt 1020

gtttggatag gaggctccat tttggcatcc ctgagcacct tccagcagat gtggatttca 1080

aaggcagagt acgacgagtc tgggccatca attgtgcaca ggaaatgctt ctag 1134

<210> 2

<211> 377

<212> PRT

<213> 棉花(cotton)

<400> 2

Met Ala Glu Asn Glu Asp Ile Gln Pro Leu Val Cys Asp Asn Gly Thr

1 5 10 15

Gly Met Val Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val

20 25 30

Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Thr Gly Val Met Val Gly

35 40 45

Met Gly Gln Lys Asp Ala Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln Ser Lys Arg

50 55 60

Val Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Ser Asn

65 70 75 80

Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu

85 90 95

Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu

100 105 110

Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr

115 120 125

Phe Asn Ala Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu

130 135 140

Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly

145 150 155 160

Val Ser His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala

165 170 175

Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Ala Leu Met

180 185 190

Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg

195 200 205

Glu Ile Val Arg Asp Met Lys Glu Lys Leu Ala Tyr Ile Ala Leu Asp

210 215 220

Tyr Glu Gln Glu Leu Glu Thr Ala Lys Thr Ser Ser Ala Val Glu Lys

225 230 235 240

Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Ala Glu Arg

245 250 255

Phe Arg Cys Pro Glu Val Leu Phe Gln Pro Ser Met Ile Gly Met Glu

260 265 270

Ala Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp

275 280 285

Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn Ile Val Leu Ser Gly Gly

290 295 300

Thr Thr Met Phe Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Ser Lys Glu Ile Thr

305 310 315 320

Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu

325 330 335

Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser

340 345 350

Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Ala Glu Tyr Asp Glu Ser Gly

355 360 365

Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe

370 375

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

atggcagaaa acgaagaca 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

ctagaagcat ttcctgtgca 20

Claims (3)

1.棉花肌动蛋白基因突变体GhACT17DM，其特征在于该基因突变体与GhACT17D基因相比，第194个碱基由G突变成T，该突变体基因cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的棉花肌动蛋白基因突变体GhACT17DM翻译的蛋白质，其特征在于该蛋白质与GhACT17D基因翻译的蛋白质相比，第65个氨基酸由甘氨酸突变成缬氨酸，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的基因在拟南芥或棉花塑型培育中的应用。