CN103237893A

CN103237893A - 抗病原体的植物及其生产方法

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Publication number: CN103237893A
Application number: CN2011800461676A
Authority: CN
Inventors: 娜塔莉亚·罗迪克; 伊夫斯·马可; 布鲁诺·法维里; 哈拉尔德·凯勒
Original assignee: Genoplante Valor SAS
Current assignee: Genoplante Valor SAS
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2031-08-05
Also published as: MX2013001482A; EP2601296A1; WO2012017067A1; US20130133101A1; CN103237893B

Abstract

本发明涉及参与植物病原体抗性的负调控的植物基因及其用途。更具体来说，本发明涉及具有有缺陷的植物磺肽素（PSK）功能并表现出对植物病原体的抗性提高的植物。本发明还涉及用于生产对各种病害有抗性的改良植物的方法。此外，本发明涉及具有有缺陷的PSK受体（PSKR）功能的植物，以及筛选和鉴定调节PSKR表达或活性的分子的方法。

Description

抗病原体的植物及其生产方法

技术领域

总的来说，本发明涉及农业生物技术和植物病害领域。具体来说，本发明涉及参与植物病原体抗性的负调控的植物基因及其用途。更具体来说，本发明涉及具有有缺陷的植物磺肽素（phytosulfokine）（PSK）功能并表现出对植物病原体的抗性提高的植物。本发明还涉及用于生产对各种病害有抗性的改良植物的方法。此外，本发明涉及具有有缺陷的PSK受体（PSKR）功能的植物，以及筛选和鉴定调节PSKR表达或活性的分子的方法。

背景技术

植物病原体代表了对作物栽培的永久性威胁。具体来说，由于产量损失和植物被毒素污染，细菌、真菌、卵菌或线虫对作物的感染可能对农业具有破坏性影响。

大多数植物病原细菌属于下列属：雷尔氏菌属（Ralstonia），欧文氏菌属（Erwinia），果胶杆菌属（Pectobacterium），泛菌属（Pantoea），土壤杆菌属（Agrobacterium），假单胞菌属（Pseudomonas），伯克霍尔德菌属（Burkholderia），食酸菌属（Acidovorax），黄单胞菌属（Xanthomonas），棒形杆菌属（Clavibacter），链霉菌属（Streptomyces），木杆菌属（Xylella），螺原体属（Spiroplasma）和植原体属（Phytoplasma）。植物病原细菌引起许多不同种类的症状，包括菌瘿和增生物、枯萎、叶斑、小斑和凋萎、软腐病以及疮痂病和黑腐病。某些植物病原细菌产生毒素或注入引起宿主细胞死亡的特殊蛋白质，或产生分解植物细胞的关键结构组分的酶。一个实例是由软腐细菌产生的降解果胶层的酶，所述果胶层使植物细胞结合在一起。其他植物病原细菌例如雷尔氏菌属菌种（Ralstonia spp.）定植于导水的木质部导管，引起植物枯萎和死亡。土壤杆菌属（Agrobacterium）菌种甚至具有遗传修饰或转化它们的宿主并导致形成被称为冠瘿的癌样增生物的能力。植物中的细菌性病害是难以控制的。重点放在防止细菌的扩散而不是治愈植物上。栽培技术可以消除或减少细菌污染来源，例如轮作以减少越冬。然而，最重要的控制方法是通过遗传改造宿主抗性以提供有抗性的变种、栽培品种或杂交种来确保的。

线虫是用显微镜可见的蠕虫样生物体。它们最通常以植物根为食，但是某些线虫也侵入叶组织。线虫吸出液体营养物并将破坏性物质注入植物中。它们损伤植物细胞或改变植物的正常生长过程。线虫的症状包括茎或根的肿胀、不规则分枝、叶片变形、不开花和根上的菌瘿。线虫可以促进病毒和真菌进入植物。根结线虫（根结线虫属物种（Meloidogyne spp.））和胞囊线虫（球胞囊线虫属物种（Globodera spp.）和异皮线虫属物种（Heterodera spp.））是对园艺和田间作物最具经济破坏性的植物寄生性线虫属。目前，杀线虫剂是控制线虫的最重要手段。然而，大多数杀线虫剂是非特异性的，具有公知的毒性，并且对土壤生态***、地下水和人类健康构成威胁。

卵菌是对农业和自然生态***具有破坏性的真菌样植物病原体。疫霉属（Phytophthora）菌种引起诸如梢枯病、马铃薯晚疫病、栎树猝死病的病害，并造成严重的作物损失（例如全世界马铃薯产量的30%）。腐霉属（Pythium）菌种是死体营养型菌种，其杀死植物并造成作物例如玉米的腐皮病。霜霉病菌例如感染葡萄的葡萄生单轴霉（Plasmoparaviticola）是活体营养型病原体，它们保持其宿主存活，但是以严重影响产量的方式使其宿主衰弱。霜霉病菌可以通过在叶片下表面上出现白色、微褐色或橄榄色的“霉”来容易地鉴定。来自于白锈菌属（Albugo）的卵菌在各种有花植物上引起白锈或白疱病。卵菌在很长的一段时间中被认为是真菌，因为它们是异养、形成菌丝体的生物体。然而，几种形态学和生物化学特征将卵菌与真菌区别开。目前的分类学将卵菌与光合生物例如褐藻或硅藻类一起分类在原生藻菌（stramenopile）界中。由于它们特殊的生理特征，目前没有针对由这些微生物引起的病害的有效治疗方法可用。目前用于对抗卵菌的杀虫剂依赖于苯基酰胺类的甲霜灵，其抑制RNA聚合酶-1。甲霜灵对环境造成影响，并且病原体快速发展出对这种杀卵菌剂的抗性，目前这种抗性已成为分别来自于马铃薯和辣椒的病原性致病疫霉（P.infestans）和辣椒疫霉（P.capsici）种群的普遍特征。

常见真菌病害包括白粉病、锈病、叶斑病、凋萎病、根腐和颈腐病、猝倒病、黑粉病，炭疽病和维管萎蔫病。目前，通过例如施用昂贵且有毒的杀真菌剂，使用例如噻菌灵、三环唑、咯喹酮和苯酞进行化学处理，或通过烧毁被感染的作物来控制真菌病害。由于真菌病原体能够发展出对化学处理的抗性，这些方法仅仅部分成功。

为了减少杀虫剂的使用量，植物育种家和遗传学家已在尝试鉴定病害的抗性基因座并利用植物的天然防御机制对抗病原体攻击。

植物能够识别某些病原体并以抗性响应的形式激活防御，所述抗性响应可以引起病原体生长的限制或停止。已经鉴定到许多抗性（R）基因，其为各种植物物种提供了对抗广范围病原体的抗性。然而，对于在植物防御机制期间开关这些基因的关键因素，仍然了解得很少。此外，病原体可能突变并克服由抗性基因提供的保护。为了控制晚疫病，经常使用显性抗性基因在易感栽培品种中的基因渐渗来管控疫霉属（Phytophthora）抗性。将来自于野生马铃薯物种野生马铃薯（Solanumdemissum）的11个R基因引入到现代马铃薯栽培品种中。然而，致病疫霉（P.infestans）菌种很快避开了栽培品种的新的单基因介导的抗性性质。因此，R基因的基因渐渗显示出其用于疫霉属（Phytophthora）抗性育种的限制，并且必须开发替代的程序来提供持久的卵菌抗性。

植物磺肽素（PSK）是一种分泌的肽，其首先在源自于芦笋（Asparagus officinalis L.）叶肉培养物的培养基中被鉴定到，并被提出是造成“调理”或“看护”即促生长效应的主要化学因子，所述效应是由先前用于细胞培养的培养基或由物理上分离的“饲养”细胞所触发的（Matsubayashi和Sakagami，1996）。

PSK肽也分离自源自于水稻（Oryza sativa L.）悬浮培养物的调理培养基，并被鉴定为以两种形式存在：硫酸酯化的五肽（[H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH]，PSKα）及其C-端截短的四肽（[H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-OH]，PSKβ）（Matsubayashi Y.等，1997）。作者提出，由PSK肽因子介导的信号转导途径参与植物细胞增殖。PSK是由约80个氨基酸长的前体肽经酪氨酸残基的翻译后硫酸酯化和蛋白水解加工而产生的（Yang等，1999）。编码PSK前体的基因冗余分布在基因组中，并在培养的细胞和各种组织包括叶、茎、花和根中表达（Matsubayashi Y.等，2006；Kutschmar等，2008）。

在不同植物物种中已鉴定到两种PSKR受体：PSKR1和PSKR2。这些受体是富含亮氨酸重复序列的受体激酶（LRR-RK）家族的成员。PSK以高度特异性方式与其受体相互作用，具有纳摩尔级的解离常数。此外，已通过光亲和标记鉴定到胡萝卜PSKR1（DcPSKR1）的PSK结合结构域（Shinohara等，2007）。作者发现，Glu503-Lys517的缺失完全破坏了DcPSKR1的配体结合活性。这个区域处于两侧带有细胞外LRR的岛结构域中，表明该结构域形成了与PSK直接发生相互作用的配体结合口袋。

已知PSK主要是内源性分泌的硫酸酯化的5个氨基酸的肽，其是调控细胞去分化和再分化的关键因子，并通过与PSK受体（PSKR）结合来影响细胞的生长潜力。最近，除了促有丝***活性之外，Bahyrycz等（2008）还提出了PSK肽的抗真菌活性。该文献显示了PSKα和β肽在体外以剂量依赖性方式抑制Phoma nareissi和郁金香葡萄孢（Botrytis tulipae）病原体的菌丝体生长。

Loivamaeki等，2010也提出了PSK信号转导在植物创伤形成中的作用。冠瘿中PSK/PSKR1的转录激活可能是由致瘤期间发生的细胞再分化过程所造成的。Motose等，Plant Physiol.150,437-447,2009也已提出作为创伤响应的PSK信号转导的激活。

Amano等，2007涉及与植物磺肽素相关的新型硫酸酯化糖肽PSY1的鉴定及其在发育过程中的参与。

WO02/083901涉及基于GREP（生长调控蛋白）多肽或其在水稻中鉴定到的PSK类似物OsPSK的表达或活性的调节来改变植物的生长、体系结构和形态的方法。

因此，在本技术领域中基本上表明PSK是细胞增殖或分化的调控物，并具有可能的抗真菌活性。在本技术领域中没有公开或提出PSK是植物中病原体抗性的关键调控物。

发明概述

本发明提供了用于生产对病原体有抗性的植物的新颖且有效方法。令人吃惊的是，本发明人发现，具有有缺陷的PSK和/或PSK受体（PSKR）基因的突变植物对植物病害有抗性，而过表达PSK或PSKR基因的植物对植物病害更易感。本发明人还证实，这种具有有缺陷的PSK或PSKR基因功能的植物获得了对不同类型的病原体例如卵菌、线虫和细菌病原体的提高的抗性，显示出这一发现的广泛应用。

因此，本发明的一个目的涉及包含有缺陷的PSK功能的植物。正如将要讨论的，所述植物表现出对植物病原体的抗性提高或增加。优选情况下，所述植物是双子叶植物，优选选自茄科（Solanaceae）植物（例如番茄）、百合科（Liliaceae）植物（例如芦笋）、伞形科（Apiaceae）植物（例如胡萝卜）、藜科（Chenopodiaceae）植物（例如甜菜）、葡萄科（Vitaceae）植物（例如葡萄）、豆科（Fabaceae）植物（例如大豆）、葫芦科（Cucurbitaceae）植物（例如黄瓜）或十字花科（Brassicacea）植物（例如油菜籽、拟南芥（Arabidopsis thaliana）），或者是单子叶植物，优选选自禾本科（Poaceae）谷类植物（例如小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱或玉米）。

更具体来说，本发明涉及具有有缺陷的PSK肽和/或PSK受体并表现出对植物病原体的抗性提高的植物，其中所述PSK受体优选为PSKR1受体。

本发明的另一个特定目的涉及包含有缺陷的PSK基因并表现出对植物病原体的抗性提高的植物。

本发明的另一个特定目的涉及包含有缺陷的PSKR基因并表现出对植物病原体的抗性提高的植物。

本发明的另一个目的涉及本发明的植物的种子，或从所述种子长成的或通过其他方式衍生的的植物或植物的后代。

本发明的另一个目的涉及用于生产对植物病原体具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

（a）失活植物细胞中的PSK和/或PSKR基因；

（b）任选地，选择具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的步骤（a）的植物细胞；

（c）从步骤（a）或（b）的细胞再生成植物；以及

（d）任选地，选择对病原体具有提高的抗性的（c）的植物，所述植物具有有缺陷的PSK或PSKR基因。

正如将在本申请中进一步公开的，可以通过各种技术例如一个或多个核苷酸的缺失、***和/或取代、位点特异性诱变、甲磺酸乙酯（EMS）诱变、定向诱导基因组局部突变（TILLING）、EcoTILLING、敲除技术或通过由RNA干扰诱导的基因沉默，来使PSK功能变成有缺陷的。也可以通过例如使用特异性抗体或可溶性受体改变PSK肽或受体的活性，来使PSK功能变成有缺陷的。

本发明还涉及用于使植物具有对植物病原体的抗性或提高植物对植物病原体的抗性的方法，所述方法包括通过例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表达来永久或暂时地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步骤。

本发明还涉及用于保护植物抵抗病原体的方法，所述方法包括通过例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表达来永久或暂时地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步骤。

本发明还涉及用于减少植物中的病原体增殖的方法，所述方法包括通过例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表达来永久或暂时地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步骤。

本发明的另一个目的涉及抑制PSK和/或PSKR基因的表达（例如转录或翻译）的抑制性核酸例如RNAi、反义核酸或核酶。本发明的另一个目的涉及这样的核酸的以下用途：用于提高植物或植物细胞对植物病原体的抗性，和/或用于减少植物或植物细胞中的植物病原体增殖，和/或用于保护植物或植物细胞抵抗植物病原体。

本发明还涉及调节PSKR基因表达的分子的鉴定方法，所述方法包括：

（a）提供包含核酸构建物的细胞，所述核酸构建物包含与报告基因可操作连接的PSKR基因启动子序列；

（b）将所述细胞与候选分子相接触；

（c）通过监测所述细胞中由报告基因编码的标志物蛋白的表达来测定PSKR启动子的活性；

（d）选择调节所述标志物蛋白的表达的分子。

优选情况下，选择的分子抑制PSKR的表达或活性，所述PSKR优选为PSKR1。

本发明还涉及按照上述方法选择的分子的以下用途：用于提高植物对植物病原体的抗性，和/或用于减少植物或植物细胞中的植物病原体增殖，和/或用于保护植物或植物细胞抵抗植物病原体。

本发明还涉及与PSK肽或PSK受体特异性结合的抗体，或这样的抗体的具有基本上相同的抗原特异性的片段或衍生物，以及所述抗体或其片段或衍生物的以下用途：用于在植物中提高或产生病原体抗性，和/或用于减少植物或植物细胞中的植物病原体增殖，和/或用于保护植物或植物细胞抵抗植物病原体。

本发明适用于生产对病原体具有提高的抗性的豆科植物、蔬菜和谷类植物，并且特别适合于生产有抗性的番茄、马铃薯、芦笋、胡萝卜、甜菜、油菜籽、葡萄、小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱或玉米。

附图说明

图1：PSK2基因的组成性表达。PSK2基因的表达（转基因拟南芥（Arabidopsis）株系PSK2pro:GFP:GUS）受到发育性调控。（A-E）：根系中PSK2的表达。（A，B）揭示出PSK2启动子激活的GUS活性（A）和GFP（B）可以在根尖（侧根冠）中被检测到，但是不能在伸长区中被检测到。（C，D）在充分分化的根中，PSK2表达集中在维管柱中。（E）侧根原基中PSK2的表达；（F-I）：芽中PSK2的表达集中在叶和子叶的维管***（F）、毛状体（G）和气孔（H，I）中。在2周龄幼苗上执行所有分析。

图2：线虫和卵菌感染后拟南芥（Arabidopsis thaliana）中PSK基因的表达模式。（2A）通过微阵列杂交来分析PSK基因的表达情况。在分别用南方根结线虫（M.incognita）和H.arabidopsidis感染后的不同时间点，从分离的菌瘿和感染的子叶制备样品。所显示的是两个生物学平行样的感染和未感染组织之间的比率的以2为底的对数（Log2）的平均值。nc，不改变。（2B）在线虫接种后（DAI）7天（白色条）、14天（灰色条）和21天（黑色条）时通过定量RT-PCR测定的拟南芥菌瘿中与未感染的根相比的PSK转录本的相对本积累量。示出的是代表性实验，其给出了来自于3个技术平行样的平均值（±SD）。（2C）在转基因拟南芥株系PSK2pro:GFP:GUS的被南方根结线虫感染的根的菌瘿中PSK2的表达模式。A，B.在发育中的菌瘿的中心，揭示出GUS活性的降低。C.在连续共聚焦光学体内切面的投影中，在线虫饲养细胞中没有检测到GFP信号。*，巨细胞；n，线虫。

图3：PSKR1基因的发育调控的表达。（A）在转基因拟南芥株系PSKR1pro:GFP:GUS中，揭示出PSKR1启动子激活的GUS活性可以在分化的根组织和根冠中被检测到，但是不能在***和伸长区中被检测到。（B）在根细胞中通过GFP荧光监测到的组成性PSKR1转录。（C）PSKR1的转录发生在根和过渡区中，但不发生在下胚轴中。（D-E）子叶表皮中的GFP荧光集中于气孔。使用2周龄幼苗执行所有分析。

图4：卵菌感染后拟南芥中PSKR1基因的表达模式。（4A）在用水或霜霉病病原体Hyaloperonospora arabidopsidis（Hpa）的40,000个孢子/ml的分生孢子悬液对拟南芥（生态型Ws-0）子叶进行喷雾处理后的不同时间点，通过qRT-PCR分析PSKR1转录本的丰度。示出了来自于3个技术平行样的平均值（±SD），所述值是通过qBase1.3.5软件计算得到的，并对来自于2个参比基因（At5g62050和At5g10790）的值进行了归一化。使用来自于两个生物学平行样的样品进行的实验给出了相似的趋势。Dpi：接种后天数。（4B）通过转基因拟南芥株系PSKR1pro:GFP:GUS中GUS报告基因的活性所监测到的对Hpa感染作出响应的PSKR1转录激活。在接种之前，通过0时间点时子叶中的GUS活性可观察到PSKR1的组成性表达。在接种后，表达继续增加并集中于叶肉的被感染区域。

图5：线虫感染后拟南芥中PSKR1基因的表达模式。（5A）在接种后（DAI）7天（白色条）、14天（灰色条）和21天（黑色条）时通过qRT-PCR进行的PSKR1转录本分析。进行了两个生物学平行实验。条表示来自于两个独立实验的平均值（±SD）。（5B）在用150个表面除菌的新鲜孵化的南方根结线虫J2幼虫接种后7天（A）和21天（B）时，转基因拟南芥株系PSKR1pro:GFP:GUS的菌瘿中在PSKR1启动子控制下的GFP报告基因的表达模式，所述表达模式是由根中的南方根结线虫诱导的。

图6：psk3敲除突变体对卵菌感染的易感性降低。（6A）关于PSK3（基因座At3g44735）的基因组组织、引物附着位点以及T-DNA在来自于株系psk3-1（SAIL_378_F03）的基因组DNA中的***和方向的示意图。条表示外显子，线对应于内含子（在外显子之间）和非翻译序列（在5’末端和3’末端处）。T-DNA的***集中在第三外显子内。在突变株系中没有检测到揭示出PSK3转录本的扩增子，因此证实了分子敲除表型。组成性表达的EF1α基因（At1g07930）转录本的扩增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR实验。（6B）PSK3敲除突变体与H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。与野生型植物（Col-0）相比，在拟南芥psk3-1突变体的子叶上H.arabidopsidis分离株Noco2的孢子形成减少大于50%。在接种后7天，将小植株收集在1ml水中，涡旋振荡，并使用血细胞计数器测定释放出的分生孢子的滴度。对于统计学分析来说，为每个株系和分析制备了10个小植株的20个样品。条表示平均值（±SD）。将实验重复3次，结果相近。通过Student’s t-检验来确定值与野生型相比的统计学显著性差异（^***P<0.0001）。

图7：PSK2或PSK4基因的过表达提高了对H.arabidopsidis、南方根结线虫（M.incognita）和青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）的易感性。（7A）过量生产PSK2（拟南芥株系p35S:PSK2）和PSK4（拟南芥株系p35S:PSK2）的转基因株系与H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。条表示平均值（±SD）。将实验重复3次，结果相近。通过Student’s t-检验来确定值与野生型相比的统计学显著性差异（***P<0.0001）。（7B）在组成性过表达PSK的转基因株系中根结线虫感染被显著刺激。在萌芽后14天，用150个表面除菌的新鲜孵化的南方根结线虫J2对拟南芥植物进行体外感染。通过Student’s t检验来确定统计学显著性差异（^*P<0.01，^**P<0.001，^***P<0.0001）。（7C）在组成性过表达PSK的转基因株系中细菌繁殖被强烈增加。将4周龄植物用含有10⁷个细菌/ml的致病性细菌分离株RD15的溶液进行根部接种。为了分析细菌的内部生长，将三个接种后植物的地上部分称重，并在添加无菌水（每克湿重2.0ml）后在研钵中研磨。然后使用无菌水进行研磨材料的各种不同稀释，并将3x40μl细菌悬液点样在含有固体SMSA培养基的皮氏培养皿上（Elphinstone等，1996），在30℃下生长。对于每个时间点，对每个拟南芥株系进行三份平行测定。条表示平均值（±SD）。

图8：pskr1敲除突变体对H.arabidopsidis感染的易感性降低。（8A）AtPSKR1（基因座At2g02220）的基因组组织、引物附着位点以及T-DNA在基因组DNA中的***和方向的示意图。（8B）RT-PCR揭示出野生型拟南芥（Col-N8846、Ws、Col-0和Col-8CS60000）中的PSKR1转录本。组成性表达的AtEF1α基因（At1g07930）转录本的扩增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR实验。（8C）pskr1等位基因突变体显示出H.arabidopsidis孢子形成减少。对于统计学分析来说，为每个株系和分析制备了10个小植株的20个样品。条表示平均值（±SD），***指示通过Student’s t-检验确定的野生型与突变体株系之间的显著性差异，其中P<0.0001。所有实验被重复3次并给出相近结果。1-1、1-2、1-3和1-4分别表示突变体pskr1-1、pskr1-2、pskr1-3和pskr1-4。

图9：pskr1敲除突变体对南方根结线虫感染的易感性降低。正如在接种后10天（10Dpi）所分析的，在pskr1突变体和野生型植物中，线虫以相似程度感染根并引发菌瘿形成。在21Dpi时，在pskr1突变体中观察到成熟菌瘿的量减少。在卵块的单性繁殖生产期间，在不存在PSKR1的情况下线虫发育的抑制变得最为明显，所述单性繁殖生产在pskr1突变体上在75Dpi时被强烈减少。数据表示来自于至少两个实验的平均值（±SD），在每个实验中对每种株系的最少50个幼苗进行了线虫感染评估。***表示通过Student’s t-检验确定的统计学显著性差异，其中P<0.0001。

图10：pskr1敲除突变体对青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）感染的易感性降低。将具有Ws（A）和Col（B）遗传背景的植物分别用致病性细菌分离株RD15和GMI1000进行根部接种。从Jiffy盆的底部切出约2cm，并将植物暴露出的根在含有10⁷个细菌/ml的悬液中浸泡3min。然后将植物转移至生长室，日/夜周期分别为27℃、120-140μE m-1s-28小时和26℃16小时，保持相对湿度为75%。在接种后3、4、5、6和7天，按照病害指数（DI）对接种后植物上的病害症状进行评分，所述病害指数覆盖DI0（无枯萎）和分别表示25%、50%、75%和100%叶片枯萎的DI1、DI2、DI3和DI4。显示了具有相似结果的数次平行实验中的代表性实验，给出了来自于至少28株植物/株系的接种的平均值（±SD）。在接种后3至5天之间的细菌指数生长期中，所有pskr1突变体具有显著降低的易感性，其中P<0.0001。拟南芥的Col遗传背景（B）显示出对青枯雷尔氏菌总体较高的易感性，并且pskr1突变的效应在Ws遗传背景（A）中在pskr1-2中最为显著。通过将功能完整的PSKR1基因导入pskr1-2遗传背景中（互补拟南芥株系Cppskr1-2，与图11的图例说明进行比较），对青枯雷尔氏菌的全部易感性得以恢复。在组成性35S启动子控制下过表达PSKR1的株系（过表达株系PSKR1-OE，与图11的图例说明进行比较）中，观察到病害在感染的晚期时间点加速。

图11：通过表达有功能的PSKR基因逆转了pskr突变体的降低的易感性。PSKR基因的过表达提高了对H.arabidopsidis的易感性。霜霉病易感性与PSKR1的表达相关（A）在用H.arabidopsidis感染后在pskr1-2突变体和转基因株系中获得的分生孢子/mg FW的水平。在Cppskr1-2株系中，通过用包含At2g02220的1,771bb的翻译起始密码子5'区、3027bp的整个编码序列和650bp的3’非翻译区的5,472bp的基因组片段进行互补，pskr1-2（Ws-0背景）的突变体表型被完全逆转。通过PCR扩增该基因组片段，将其克隆到Gateway目的载体pHGW（Karimi等，2002）中，并通过土壤杆菌介导的转化转入pskr1-2中。PSKR1在Ws-0野生型中的过表达（株系PSKR1-OE）使霜霉病易感性增加几乎100%。为了基因的过表达，从基因组DNA扩增包括起始和终止密码子的3,060bp的编码区，将其克隆到Gateway目的载体pH2GW7（Karimi等，2002）中，并通过土壤杆菌介导的转化转入拟南芥中。如上所述进行病原体测定。条表示平均值（±SD），***表示通过Student’s t-检验确定的野生型与突变体株系之间的显著性差异，其中P<0.0001。所有实验被重复3次并给出相似结果。（B）在用H.arabidopsidis感染后获得的在不同突变体和转基因株系中的PSKR1表达水平。通过定量实时RT-PCR测定拟南芥幼苗（播种后15天）中PSKR1转录本的相对积累量。使用2^-(ΔΔCT)方法来计算表达比率，将UBP22（At5g10790）用于归一化，并以野生型PSKR1表达作为参比物。条（±SD）表示三个技术平行样的平均值。

图12：pskr1突变体的降低的病害易感性不是组成性激活或病原体触发的防御响应的结果。拟南芥中水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（JA/乙烯）介导的防御信号转导途径的激活不依赖于PSKR1。SA、JA和JA/乙烯介导的信号转导途径的标志物基因分别是PR1a（At2g14610）、PDF1.2（At5g44420）和PR4（At3g04720）。在野生型（Ws）、突变体（pskr1-2）和转基因PSKR1过表达株（PSKR1-OE）植物中，在用水或H.arabidopsidis分离株Emwa1的分生孢子悬液（40,000个孢子/ml）对子叶进行喷雾处理后，通过定量实时RT-PCR分析了这些防御相关基因的表达。在0时间点以及处理开始后24、48、72和120小时，制备用于RNA提取和qRT-PCR的样品。使用Q-Base软件，用AtOXA1（At5g62050）和AtUBP22（At5g10790）对标志物基因转录本的相对量进行归一化。显示的是来自于3个技术平行样的平均值（±SD）。两个独立的实验给出相似结果。

图13：PSKR1的抑制引起青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）、H.arabidopsidis和南方根结线虫（M.incognita）的增殖降低。（A，B）在pskr1-2突变体中，在不存在PSKR1的情况下细菌繁殖被强烈地减少。对于每个拟南芥株系，在每个时间点执行三份平行测定。条表示平均值（±SD）。A和B是相同实验结果的图示，其中细菌滴度分别作为绝对值和对数值给出。细菌繁殖在pskr1-2突变体中急剧减少（～1,000倍），在互补株系Cppskr1-2中恢复，并在过表达株系PSKR1-OE中增加（～2倍）。（C）在pskr1-2突变体中，在不存在PSKR1的情况下叶组织中的卵菌菌丝发育减少。将植物用40,000个孢子/ml进行喷雾接种，并在接种后5天收集子叶。被感染子叶中菌丝的发育通过台盼蓝染色来观察。在Ws野生型植物中观察到充分发育的分枝菌丝网络。这种网络和菌丝分枝在不存在PSKR1的情况（株系pskr1-2）下被强烈地减少，但是在PSKR1过表达（株系PSKR1-OE）后变得异常。显示的是代表性透射光学显微照片。（D）在不存在PSKR1的情况下南方根结线虫卵块生产的减少是巨细胞尺寸减小的结果。为了进行形态学分析，在接种后第7、14和21天，将pskr1-2、PSKR1-OE和野生型植物（生态型Ws）的被线虫感染的根在含2%戊二醛的50mMPipes缓冲液（pH6.9）中固定，然后脱水并按照制造商所述包埋在Technovit7100（Heraeus Kulzer，Wehrheim，Germany）中。将包埋的组织切片（3μm），在0.05%甲苯胺蓝中染色，固定在Depex（Sigma）中，并使用亮视野光学部件执行显微术。使用数字相机（Axiocam；Zeiss）收集图像。与对照相比，在接种后7天来自于pskr1-2和PSKR1-OE的菌瘿的组织切片在菌瘿和巨细胞形成方面未显示出差异。在菌瘿发育的较晚阶段（接种后14和21天），来自于pskr1-2突变体植物的巨细胞显著更小。为了进行巨细胞表面测量，使用AxioVision V4.8.1.0软件检查用甲苯胺蓝染色的连续切片。选择来自于每种表型至少50个菌瘿中每个菌瘿的3个最大的巨细胞进行测量。在接种后14天，来自于pskr1-2突变体植物的菌瘿与对照植物相比含有显著更小的巨细胞。

图14：TILLING策略后鉴定到的在SlPSKR1中的番茄突变的图示。在TILLING方法中被靶向的SlPSKR1基因组区域由箭头靶1和靶2标出。使用TILLING方法鉴定到的6个突变如下：pskr1.1A88T，pskr1.2T119C，pskr1.3G502A，pskr1.4G856A，pskr1.5G2285A和pskr1.6G1978A。图中还将蛋白结构域表示为底部的箭头，标出了信号肽（SP）、富含亮氨酸的重复序列结构域（LRR）、跨膜结构域（TM）和激酶结构域。用大写字母标出用于TILLING的引物附着位点。

发明详述

本发明提供了用于生产具有有缺陷的PSK和/或PSK受体功能并对病原体具有抗性的植物的新颖且有效的方法。

现在，本发明人令人吃惊地发现PSK起到植物对植物病原体的抗性的负调控物的作用，也就是说，它们的抑制通过降低易感性而提高抗性。就我们所知，这是植物中抗性受生长因子负调控的第一个实例。因此，PSK信号转导途径代表了用于生产对病原体具有提高的抗性的目标植物的新的且高度有价值的靶点。本发明人进一步证实，具有有缺陷的PSK和/或PSK受体功能的植物对不同类型的病原体例如卵菌、线虫和细菌病原体具有降低的易感性，显示出本发明的广泛应用。

通过参考下面的定义，将最好地理解本公开：

定义

当在本文中使用时，术语“PSK肽”是指起到植物抗性的负调控物作用的硫酸酯化的植物磺肽素肽。这样的PSK肽优选包含氨基酸序列H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-OH（SEQ ID NO：1）或氨基酸序列H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH（SEQ ID NO：2），或其任何自然变体（例如在其他植物中存在或来自于多态现象的变体）。优选情况下，PSK肽含有至少4个氨基酸。更优选情况下，PSK肽含有至少5个氨基酸。典型情况下，PSK肽含有至少两个硫酸酯化的氨基酸残基，所述氨基酸残基优选为酪氨酸残基。术语PSK肽还指称所述肽的任何前体或未成熟形式，例如包含SEQ ID NO：3、4、5、6或7的氨基酸序列的PSK前体蛋白。PSK前体的具体实例包括包含选自SEQ ID NO：8-13的序列的三角叶杨（Populus trichocarpa）PSK前体，包含选自SEQ ID NO：14-19、95、97、99、101、103的序列的水稻（Oryzasativa）PSK前体，包含选自SEQ ID NO：20-24的序列的酿酒葡萄（Vitisvinifera）PSK前体，以及包含选自SEQ ID NO：69、71、73或75的序列的番茄（Solanum lycopersicum）前体。

在本发明的文本中，术语“PSK基因”是指编码PSK肽（或其前体）的任何核酸。根据具体情况，术语“PSK基因”包括PSK DNA（例如基因组DNA）和PSK RNA（例如mRNA）。具体来说，“PSK基因”包括编码如上所定义的植物磺肽素肽或这样的肽的自然变体的任何核酸。PSK基因的实例包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum（Lycopersicon esculentum））、水稻（Oryzasativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、小麦（Triticumaestivum）、芦笋（Asparagus officinalis）、甘蓝型油菜（Brassica napus）、甜菜（Beta vulgaris）、马铃薯（Solanum tuberosum）、大豆（Glycinemax）、酿酒葡萄（Vitis vinifera）和胡萝卜（Daucus carota）的PSK基因组DNA或RNA。PSK基因的具体实例包含SEQ ID NO：25-29、86-90的核酸序列（拟南芥），SEQ ID NO：68、70、72或74的核酸序列（番茄），SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、105的核酸序列（水稻）。

PSK基因或肽的其他实例如下所列：

水稻（Oryza sativa）

GenBank：BAF11381.2，Os03g0232400

NCBI参考序列：NP_001050886.1，Swiss-Prot：Q9FRF9.1Q9FRF9，PSK3

GenBank：AAG46077.1

GenBank：BAF12800.1

GenBank：EEC75912.1，假设的蛋白OsI_12987

GENE ID：4333708Os03g0675600

GenBank：ABF98161.1，推测的植物磺肽素3前体

GenBank：EAZ28113.1，假设的蛋白OsJ_12080

玉米（Zea mays）

GenBank：ACG49207.1，PSK4

GenBank：DAA00297.1，PSK

NCBI参考序列：NP_001105796.1，PSK1

GenBank：ACG23972.1，PSK

GenBank：ACG41544.1，植物磺肽素前体蛋白

GenBank：ACG27399.1，植物磺肽素前体蛋白

高粱（Sorghum bicolor）

GENE ID：8085257SORBIDRAFT_01g042120

GENE ID：8084300SORBIDRAFT_02g001950

GenBank：EES08686.1SORBIDRAFT_05g021760

小麦（Triticum aestivum）

GenBank：DAA00296.1，推测的植物磺肽素肽前体

GenBank：ABG66637.1，植物磺肽素-α2前体

GenBank：ABG66638.1，植物磺肽素-α2前体

野生芦笋（芦笋（Asparagus officinalis））

Swiss-Prot：Q9FS10，PSK

GenBank：BAB20706.1，前植物磺肽素原

油菜籽（甘蓝型油菜（Brassica napus））

GenBank：DAA00277.1，推测的植物磺肽素肽前体

甜菜（Beta vulgaris）

Swiss-Prot:CAK22422.1，植物磺肽素-α肽前体

番茄（Solanum lycopersicum）

GenBank：DAA00287.1，PSK4

马铃薯（Solanum tuberosum）

GenBank：DAA00294.1，PSK

GenBank：DAA00293.1，PSK

大豆（Glycine max）

GenBank：ACU23402.1，植物磺肽素肽前体

GenBank：DAA00280.1，推测的植物磺肽素肽前体

GenBank：DAA00283.1，推测的植物磺肽素肽前体

GenBank：DAA00282.1，推测的植物磺肽素肽前体

GenBank：DAA00279.1，推测的植物磺肽素肽前体

葡萄（酿酒葡萄（Vitis vinifera））

GenBank：CBI38497.3，PSK

GenBank：CAN65538.1和CBI25131.3，PSK

GenBank：CBI19372.1，PSK

GenBank：CBI30250.3，未命名的蛋白质产物

GenBank：CBI17083.3

GenBank：CAN62427.1，假设的蛋白质

香蕉（Musa acuminata）

GenBank：ABF70025.1，植物磺肽素家族蛋白

百日菊（Zinnia violacea）

Swiss-Prot：Q8H0B9，前植物磺肽素原

木棉（Gossypium arboreum）

GenBank：DAA00278.1，推测的植物磺肽素肽前体

白杨（三角叶杨（Populus trichocarpa））

NCBI参考序列：XP_002320667.1，PSK

GenBank：EEE98982.1，PSK

NCBI参考序列：XP_002320021.1，PSK

NCBI参考序列：XP_002301142.1，PSK

GenBank：EEE87877.1

松树（火炬松（Pinus taeda））

GenBank：DAA00289.1，PSK

花旗松（Pseudotsuga menziesii）

GenBank：ACH59688.1

GenBank：ACH59689.1

GenBank：ACH59690.1

GenBank：ACH59691.1

GenBank：ACH59692.1

GenBank：ACH59693.1

GenBank：ACH59694.1

GenBank：ACH59695.1

GenBank：ACH59696.1

GenBank：ACH59697.1

GenBank：ACH59698.1

GenBank：ACH59699.1

GenBank：ACH59701.1

GenBank：ACH59702.1

GenBank：ACH59703.1

GenBank：ACH59704.1

GenBank：ACH59705.1

GenBank：ACH59706.1

GenBank：ACH59707.1

GenBank：ACH59708.1

GenBank：ACH59709.1

当在本文中使用时，术语“PSKR”或“PSK受体”是指PSK肽的受体。典型情况下，PSKR具有与如上定义的PSK肽结合的细胞外结构域和具有激酶活性的细胞内信号转导结构域。已经从包括拟南芥、番茄、胡萝卜、水稻和酿酒葡萄在内的多个物种分离并克隆了PSKR。PSKR的示例性序列被提供为SEQ ID NO：30、31（拟南芥），SEQ IDNO：32（胡萝卜），SEQ ID NO：33（酿酒葡萄），SEQ ID NO：111、113（三角叶杨），SEQ ID NO：34、107、109（水稻）和SEQ ID NO：35、114（番茄）。本发明的优选PSKR是PSKR1受体。

“PSKR基因”是指编码PSKR受体的任何核酸。具体来说，视情况而定，“PSKR基因”可以是编码植物磺肽素肽的受体的任何DNA或RNA。PSKR基因的具体实例包括包含SEQ ID NO：36或37的序列的核酸，所述序列编码拟南芥的PSKR1或PSKR2的氨基酸序列。在另一个实施方案中，“PSKR基因”编码PSKR1或PSKR2蛋白的任何天然变体或同源物。PSKR基因的实例包括番茄、胡萝卜、酿酒葡萄的PSKR基因或RNA。示例性序列被提供为SEQ ID NO：38、39、40、67、91、92、93、108、109、110或112。

在本发明的文本中，术语“病原体”总的来说是指植物的所有病原体。更具体来说，病原体是真菌、卵菌、线虫或细菌病原体。在特定实施方案中，真菌病原体是谷类植物的真菌病原体。这样的病原体的实例包括但不限于稻瘟病菌属（Magnaporthe）、柄锈菌属（Puccinia）、曲霉属（Aspergillus）、黑粉菌属（Ustilago）、壳针孢属（Septoria）、白粉菌属（Erisyphe）、丝核菌属（Rhizoctonia）和链孢霉属（Fusarium）菌种。

在更优选实施方案中，病原体是活体营养或半活体营养的选自疫霉属（Phytophthora）、霜霉属（Peronospora）、Hyaloperonospora属和单轴霉属（Plasmopara）的卵菌病原体。最优选的卵菌病原体是Hyaloperonospora arabidopsidis、寄生疫霉（Phytophthora parasitica）、致病疫霉（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和葡萄单轴霉（Plasmopara viticola）。

在另一个优选实施方案中，病原体是线虫病原体。最优选的线虫病原体是根结线虫属物种（Meloidogyne spp.）（南方根结线虫（M.incognita）、爪哇根结线虫（M.javanica）、花生根结线虫（M.arenaria）、北方根结线虫（M.hapla）、拟禾本科根结线虫（M.graminicola））、球胞囊线虫属物种（Globodera spp.）和异皮线虫属物种（Heteroderaspp.）。

在另一个优选实施方案中，病原体是细菌病原体。最优选的细菌病原体是青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。

现在将进一步更详细地描述本发明的不同实施方案。除非另有指明，否则如此定义的每个实施方案可以与任何其他实施方案组合。具体来说，被指明为优选或有利的任何特征可以与被指明为优选或有利的任何其他特征组合。

PSK或PSKR缺陷的植物

如前所述，本发明是基于PSK和PSKR基因是植物对植物病原体的抗性的负调控物这一发现。本发明人证实，PSK或PSKR基因的失活提高了植物对植物病原体的抗性。

因此，本发明涉及基于PSK途径的调控来提高植物中的病原体抗性的方法。本发明还涉及通过降低或抑制所述植物中的PSK功能以保护植物抵抗病原体的方法。

本发明还涉及具有有缺陷的PSK功能的植物或植物细胞。

本发明还涉及适用于生产这样的植物和细胞的构建物（例如核酸、载体、细胞等），以及用于生产植物抗性调控物的方法。

根据第一实施方案，本发明涉及包含有缺陷的PSK功能的植物或植物细胞。术语“PSK功能”表示在植物细胞中由PSK肽或受体介导的任何活性。PSK功能可以通过PSK基因表达或PSK肽活性以及PSKR基因表达或PSKR受体活性来实现。

在本发明的文本中，与PSK功能相关的术语“有缺陷的”、“失活的”或“失活”是指细胞或植物中存在的活性PSK肽或活性PSKR受体的水平降低。与野生型植物相比，这样的降低典型为约20%，更优选30%。降低可以是更加显著（例如，超过50%、60%、70%、80%或更高）或完全的（即敲除植物）。

PSK或其受体的失活可以通过在本技术领域中本身已知的技术来执行，例如但不限于通过遗传学方法、酶学技术、化学方法或其组合。失活可以在DNA、mRNA或蛋白质水平上进行，并且抑制PSK或PSKR的表达（例如转录或翻译）或活性。

优选的失活方法影响表达，并引起在细胞内不产生有功能的PSK肽和/或PSKR受体。应该指出，PSK或PSKR的抑制可以是暂时或永久的。

在第一实施方案中，通过在一个或多个PSK或PSKR基因中缺失、突变、***和/或取代一个或多个核苷酸来获得有缺陷的PSK或PSKR。在优选实施方案中，目标植物中的所有PSK基因被失活。这可以通过在本技术领域中本身已知的技术来执行，所述技术例如为位点特异性诱变、甲磺酸乙酯（EMS）诱变、定向诱导基因组局部突变（TILLING）、EcoTILLING、同源重组、接合等。

本发明的TILLING方法旨在从诱变群体中鉴定PSK或PSKR基因中的SNP（单核苷酸多态性）和/或***和/或缺失。它能够提供一系列等位的沉默、错义、无义和剪接位点突变，以研究基因中各种突变的效应。EcoTILLING是TILLING的一种变体，其研究群体中的自然遗传变异。

另一种特定方法是通过***外来序列，例如通过使用被称为转座子的移动遗传元件的转座子诱变来进行基因失活，所述转座子可以是自然或人造来源的。

在最优选实施方案中，有缺陷的PSK或PSKR是通过敲除技术来获得的，例如使基因的全部或一部分缺失，被缺失部分的尺寸足以防止从所述基因表达有功能的蛋白。被缺失部分优选包含基因的至少50个连续的核苷酸。在特定实施方案中，用***的外来核酸代替基因组中被缺失的基因或部分。

根据另一个优选实施方案，通过使用RNA干扰、核酶或反义技术进行基因沉默来获得有缺陷的PSK或PSKR。在特定实施方案中，用于基因沉默的抑制性核酸分子包含与数个PSK或PSKR基因或RNA共有的序列互补的序列。优选情况下，这样的抑制性核酸分子包含与同一物种的所有PSK基因或RNA或PSKR基因或RNA中存在的序列互补的序列，所述物种例如拟南芥、番茄、水稻、玉米、高粱、小麦、芦笋、甘蓝型油菜、甜菜、马铃薯、大豆、酿酒葡萄和/或胡萝卜。

也可以通过突变或沉默参与PSK或PSKR生物合成途径的基因，例如PSK酪氨酸残基的硫酸酯化所需的磺基转移酶（SOT）的编码基因，来减少植物中PSK或PSKR的合成。可选地，也可以通过表达（过表达）PSK或PSKR的负调控物例如转录因子或第二信使，来操纵PSK或PSKR的合成和/或活性。在另一个实施方案中，可以在植物中表达（过表达）参与PSK或PSKR合成的基因的突变的等位基因。

也可以例如通过向植物施加（例如喷洒）外源试剂例如抑制PSK或PSKR活性的分子，来暂时地执行PSK或PSKR的失活。

优选的失活是由破坏PSK或PSKR基因的完整性、例如通过缺失基因序列的片段（例如至少50个连续的bp）和/或***外来序列而产生的永久性失活。正如在实施例中所示的，具有有缺陷的PSK或PSKR基因的psk或pskr敲除植物仍然是活的，不显示异常发育表型，并且表现出对植物病原体的抗性提高。

在特定实施方案中，通过敲除技术使一个以上的PSK或PSKR基因变成有缺陷的。

在另一个实施方案中，在PSK肽的水平上获得有缺陷的PSK功能。例如，可以通过将植物暴露于针对PSK肽的抗体（例如抗磺基酪氨酸单克隆抗体）或通过在植物细胞中表达所述抗体，来失活PSK肽。

还可以通过将植物暴露于含有细胞外结合结构域但不含细胞内信号转导结构域的PSKR或通过过表达所述PSKR，来失活PSK肽。

可选地，通过改变PSKR受体的活性来获得有缺陷的PSK功能。更具体来说，可以通过PSKR受体的拮抗剂来失活PSKR受体。在特定实施方案中，这样的拮抗剂结合于PSKR受体的Glu503-Lys517残基。

因此，可以在PSK基因组DNA、PSK mRNA、PSK肽、PSKR基因组DNA、PSKR mRNA或PSKR受体活性的水平上控制PSK在植物抗性中的功能。

在一种变体中，本发明涉及对植物病原体具有提高的抗性的植物，其中所述植物包含失活的PSK基因，更具体来说是失活的PSK基因组DNA。有缺陷的PSK基因优选选自PSK1、PSK2、PSK3、PSK4和PSK5。在另一个优选实施方案中，植物中存在的所有PSK基因都是有缺陷的，例如全部PSK1-5基因。

在另一种变体中，本发明涉及对植物病原体具有提高的抗性的植物，其中所述植物包含失活的PSK肽。

在另一种变体中，本发明涉及对植物病原体具有提高的抗性的植物，其中所述提高的抗性是由PSKR基因组DNA的失活造成的。有缺陷的PSKR基因可以是拟南芥PSKR1基因的直向同源基因。

在另一种变体中，本发明涉及对植物病原体具有提高的抗性的植物，其中所述提高的抗性是由PSK或PSKR mRNA的失活造成的。

在另一个实施方案中，本发明涉及已通过PSK功能的失活被工程化改造成对植物病原体（更）有抗性的转基因植物或植物细胞。在特定实施方案中，改良植物是丧失功能的psk或pskr突变体植物，对植物病原体具有提高的抗性。

本发明还涉及本发明的植物的种子，以及从所述种子长成的或通过其他方式衍生的植物或植物的后代，所述植物对病原体具有提高的抗性。

本发明还涉及本发明的植物的植物性材料，例如根、叶、花、愈合组织等。

本发明还涉及用于生产对病原体具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

（a）失活植物细胞中的PSK和/或PSKR基因；

（c）从步骤（a）或（b）的细胞再生成植物；以及

（d）任选地，选择对病原体具有提高的抗性的植物，所述对病原体具有提高的抗性的植物具有有缺陷的PSK或PSKR基因。

PSK和/或PSKR基因的失活可以如上所公开的来进行。PSK或PSKR基因中的遗传改变，也可以按照例如由Toki等（2006）所描述的方案，使用Ti质粒和土壤杆菌感染方法通过转化来进行。在优选方法中，失活是由使用例如敲除技术进行的PSK或PSKR基因破坏所造成的。

具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的植物细胞的选择，可以通过技术人员本身已知的技术（例如PCR、杂交、使用可选择标志物基因、蛋白定量、western印迹等）来进行。

可以使用技术人员本身已知的方法获得来自于改良细胞的植物世代。具体来说，可以从愈合组织培养物或其他未分化的细胞生物质诱导芽和根的形成。可以将由此获得的小植株移栽出来并用于栽培。例如Fennell等（1992）Plant Cell Rep.11:567-570，Stoeger等（1995）Plant Cell Rep.14:273-278描述了从细胞再生成植物的方法。

得到的植物可以按照本技术领域中已知的技术进行育种和杂交。优选情况下，应该生长两代或更多代以便确保基因型或表型是稳定并且可遗传的。

对病原体具有提高的抗性的植物的选择，可以通过向植物施加病原体、测定抗性并与野生型植物进行比较来进行。

在本发明的文本中，术语对病原体的“提高的抗性”是指抗性优于尚未应用本发明的方法的对照植物例如野生型植物的抗性。“提高的抗性”还表示由病原体引起的病害症状的表现减少、减弱或被阻止。病害症状优选包括直接或间接对植物品质，产量，植物在饲料、播种、生长、收获等中的用途造成不利影响的症状。这样的症状包括例如植物或其部分（例如不同组织、叶、花、果实、种子、根、芽）的感染和病变、被感染组织表面上出现色点和孢子床、组织的浸解、真菌毒素的积累、组织坏死、组织的产孢病变、色斑等。优选情况下，根据本发明，与对照植物相比，病害症状减少至少5%或10%或15%，更优选至少20%或30%或40%，特别优选50%或60%，最优选70%或80%或90%或更高。

术语植物对病原体的“提高的抗性”还表示植物对植物病原体感染的易感性降低或缺少这样的易感性。本发明人第一次证实了PSK或PSKR基因的表达与对感染的易感性之间的关联性。正如在实验部分中所示的，用卵菌病原体感染植物触发了PSK和PSKR1基因的转录激活。此外，本发明人显示，PSK基因和PSKR1的过表达促进病害，而PSK3和PSKR1的敲除提高抗性。因此，本发明人提出，PSK信号转导提高了植物对感染的易感性并有利于病害的发展。因此，在优选实施方案中，PSK或PSKR缺陷的植物对植物病原体的抗性是由这些植物失去对病原体的易感性造成的。

本发明的优选植物或细胞对于PSK或PSKR基因失活来说应该是纯合的，即两个PSK或PSKR等位基因均无活性。

在最优选实施方案中，本发明的方法被用于产生具有有缺陷的PSK或PSKR基因并对卵菌、线虫和/或细菌病原体具有提高的抗性的双子叶植物或单子叶植物。这样的植物的实例以及它们抵抗病原体的能力被公开在实验部分中。

本发明的具体目的涉及茄科（Solanaceae）植物，优选为番茄植物，其中所述植物的细胞缺少全部或一部分PSK或PSKR1基因并且PSK功能是有缺陷的。这样的植物对病原体例如真菌、卵菌、线虫或细菌病原体表现出提高的抗性。在优选实施方案中，本发明涉及番茄植物，其中所述植物的细胞缺少全部或一部分PSKR1基因。优选的植物至少缺少如图13所公开的靶1或靶2中的基因的一部分（即超过50个连续核苷酸）。更优选情况下，被缺失部分涵盖至少一个下述核苷酸：A88，T119，G502，G856，G2285和G1978。

本发明的另一个具体目的涉及茄科植物，优选为番茄植物，其中所述植物的细胞具有突变的PSKR1基因并且PSK功能是有缺陷的。这样的植物对病原体例如真菌、卵菌、线虫或细菌病原体表现出提高的抗性。在优选实施方案中，突变存在于如图13所公开的靶1和靶2结构域中。更优选情况下，突变选自pskr1.1A88T、pskr1.2T119C、pskr1.3G502A、pskr1.4G856A、pskr1.5G2285A和pskr1.6G1978A。

本发明的另一个具体目的涉及伞形科（Apiaceae）植物，优选为胡萝卜植物，其中所述植物的细胞缺少全部或一部分PSK或PSKR1基因并且PSK功能是有缺陷的。这样的植物对病原体例如真菌、卵菌、线虫或细菌病原体表现出提高的抗性。

本发明的另一个具体目的涉及禾本科（Poaceae）植物，优选为小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱或玉米植物，其中所述植物的细胞缺少全部或一部分PSK或PSKR1基因并且PSK功能是有缺陷的。这样的植物对病原体例如真菌、卵菌、线虫或细菌病原体表现出提高的抗性。

植物抗性调节物的筛选

本发明还公开了选择或生产植物抗性调控物的新方法，以及在这样的方法中使用的工具和构建物。

在特定方面，本发明涉及用于筛选或鉴定调节植物抗性的分子的方法，所述方法包括测试候选化合物是否调节PSKR基因的表达或活性。所述测试可以在含有被克隆在PSKR启动子序列控制下的报告物DNA构建物的细胞或表达PSKR或PSKR融合蛋白的细胞中进行。

优选情况下，这样的方法包括以下步骤：

-提供包含核酸构建物的细胞，所述核酸构建物包含与报告基因可操作连接的PSKR基因启动子序列；

-将所述细胞与候选分子相接触；

-通过监测所述细胞中由报告基因编码的标志物蛋白的表达来测定PSKR启动子的活性；以及

-选择调节所述标志物蛋白的表达的分子。

在另一个实施方案中，本发明还涉及用于筛选或鉴定调节PSKR活性的分子的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供细胞，所述细胞包含在转录因子控制下的报告基因以及包含与所述转录因子的DNA结合结构域融合的PSKR蛋白的融合蛋白；

-将所述细胞与另一个融合蛋白相接触，所述另一个融合蛋白包含与所述转录因子的转录激活结构域融合的候选分子；

-通过监测所述细胞中由报告基因编码的标志物蛋白的表达来测定PSKR的活性，所述标志物蛋白只有在两种融合蛋白相互作用时才表达；

-选择诱导所述标志物蛋白的表达的分子。

优选的调节物是PSKR表达的抑制物。

在另一个实施方案中，本发明还涉及抑制PSKR表达或活性的化合物用于提高植物对植物病原体的抗性的用途。典型地使用上述筛选方法来鉴定这样的化合物。这样的化合物的使用典型地包括通过例如喷洒或浸泡在与水的混合物中将植物暴露于这样的化合物，由此引起PSK暂时失活以及对病原体的抗性的暂时提高。

就此而言，本发明还涉及与PSK肽或受体特异性结合的抗体，或这样的抗体的具有基本上相同的抗原特异性的片段或衍生物。这样的抗体可以是多克隆抗体，或者更优选是单克隆抗体。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab’片段、CDR结构域。衍生物的实例包括单链抗体、人源化抗体、重组抗体等。这样的抗体可以通过本技术领域中本身已知的技术来生产，例如免疫和多克隆抗体的分离，或免疫、分离抗体产生细胞、选择并将其与例如骨髓瘤细胞融合以产生生产单克隆抗体的杂交瘤。可以使用已知技术来制备片段及其衍生物。PSK肽或受体的特异性抗体是与这样的肽或受体结合的亲和性比与其他肽或受体结合的亲和性高的抗体。优选的特异性抗体基本上不与其他肽或受体结合。

在另一个实施方案中，本发明还涉及与PSKR相互作用、为功能性PSKR信号转导所需的、并可以作为附加的靶点进行失活以提高抗性的蛋白的鉴定方法。这样的筛选方法优选为允许鉴定细胞质与膜结合蛋白的相互作用对的Y2H***，例如分离-泛素（split-ubiquitin）***（Stagljar等，1998）和基于交配的分离-泛素（mating-basedsplit-ubiquitin）***（Grefen等，2009）。也可以使用在酵母核中起作用的经典GAL4Y2H***（Fields和Song，1989）来鉴定与单个PKSR结构域相互作用的蛋白质。

本发明的其他方面和优点被提供在下面的实施例中，提供所述实施例是出于示例的目的而不是为了限制。

实施例

材料和方法

用于植物磺肽素PSK1、PSK2、PSK3、PSK4、PSK5及其受体PSKR1的编码基因的功能分析的突变体和转基因拟南芥（Arabidopsis）株系的产生。

本发明人对表1中列出的数种突变体和转基因株系进行了分析。

表1：突变体和转基因拟南芥（Arabidopsis）株系

对于p35s:PSK2来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTTCACCATGGCAAACGTCTCCGCTTTGC-3’；SEQ ID NO：41）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTGTCAAGGATGCTTCTTCTTCTGG-3’；SEQID NO：42），通过PCR扩增整个编码序列的294bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pK2GW7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌（Agrobacterium）介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。

对于PSK2pro:GFP:GUS融合体来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTTCTGAAGTTTGGTGCATTAATTTA-3’；SEQID NO：43）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTGTTTTGTGATATTTTCTTTGAAG-3’；SEQ IDNO：44），通过PCR扩增起始密码子上游的1005bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pKGWFS7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。使用PSK2pro:GFP:GUS构建物，本发明人证实了PSK2基因受到发育性调控（图1）。

对于p35s:PSK2:GFP融合体和PSK2-RNAi来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTTCACCATGGCAAACGTCTCCGCTTTGC-3’；SEQ ID NO：45）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTGAGGATGCTTCTTCTTCTGG-3’；SEQ IDNO：46），通过PCR扩增不含终止密码子的整个编码序列的291bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pK7FWG2,0（Karimi等，2002）（用于p35s:PSK2:GFP）或pH7GWIWG2（II）（Karimi等，2002）（用于PSK2-RNAi）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体分别转移到Col和Ws野生型中。

对于p35s:PSK4来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTTCACCATGGGTAAGTTCACAACCATTT-3’；SEQID NO：47）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTGTCCACCTCCGGATCAGGGCTTGTGATTCTGAGTA-3’；SEQ ID NO：48），通过PCR扩增整个编码序列的282bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pK2GW7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。

产生了转基因株系spPSK4-pepPSK以便组成性表达用于分泌的PSK4信号序列与PSKα最小基序之间的融合体。通过将两个引物forPSK4PS-PSK（5’-AATTCATGGGTAAGTTCACAACCATTTTCATCATGGCTCTCCTTCTTTGCTCTACGCTAACCTACGCAGAAGAGTTTCATACGGACTACATCTACACTCAGGACGTAA-3’；SEQ ID NO：49）和revPSK4PS-PSK（5’-AGCTTTACGTCCTGAGTGTAGATGTAGTCCGTATGAAACTCTTCTGCGTAGGTTAGCGTAGAGCAAAGAAGGAGAGCCATGATGAAAATGGTTGTGAACTTACCCATG-3’；SEQ ID NO：50）退火，获得了包含融合体的113bp片段。将该片段连接到EcoRI/HindIII消化的pBlueScript中。然后将使用该载体作为模板、利用引物attB1forPSK-B1（5’-AAAAAGCAGGCTTCATGGGTAAGTTCACAACC-3’；SEQ IDNO：51）和attB2revPSKstop-B2（5’-AGAAAGCTGGGTATCACTTTACGTCCTGAGTGTAG-3’；SEQID NO：52）获得的135bp PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pK2GW7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。

产生了转基因株系spPSK4-pepPSK-HA以便组成性表达用于分泌的PSK4信号序列与带有C-端HA标签的PSKα最小基序之间的融合体。通过将两个引物forPSK4PS-PSK（5’-AATTCATGGGTAAGTTCACAACCATTTTCATCATGGCTCTCCTTCTTTGCTCTACGCTAACCTACGCAGAAGAGTTTCATACGGACTACATCTACACTCAGGACGTAA-3’；SEQ ID NO：53）和revPSK4PS-PSK（5’-AGCTTTACGTCCTGAGTGTAGATGTAGTCCGTATGAAACTCTTCTGCGTAGGTTAGCGTAGAGCAAAGAAGGAGAGCCATGATGAAAATGGTTGTGAACTTACCCATG-3’；SEQ ID NO：54）退火，获得了113bp片段。将该片段连接到EcoRI/HindIII消化的pBlueScript中。对于3HA标签的***来说，使用引物forHA-Hind（5-’GGTAAGCTTTACCCATACGATGTTCCTG-3’；SEQ ID NO：55）和revHA-XhoI（5-’GAACTCGAGTCAAGCGTAATCTGGAACGTC-3’；SEQ ID NO：56）在pNX32-Dest上通过PCR扩增111bp的片段，然后用HindIII/XhoI消化。将消化后的3HA标签片段连接到HindIII/XhoI消化的含有PSK4信号序列与PSKα最小序列（不含终止密码子）之间的融合体的pBlueScript中。使用引物attB1forPSK-B1（5’-AAAAAGCAGGCTTCATGGGTAAGTTCACAACC-3’；SEQ IDNO：57）和attB2revPSK-HAstop-B2（5’-AGAAAGCTGGGTGTCAAGCGTAATCTGGAACG-3’；SEQ IDNO：58），通过PCR扩增228bp的片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pK2GW7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。

对于Cppskr1-2来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTTCATGGCAAGAAAATGTGAGAC-3’；SEQ IDNO：59）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTGGAACCATTATAGGAAGCGTACTAATC-3’;SEQ ID NO：60），通过PCR扩增包含起始密码子上游的1771bp（启动子和5’UTR）、3027bp的整个编码序列和650bp的3’非编码序列（3’UTR和终止子）的5472bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pHGW（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的植物表达载体转移到pskr1-2突变体中。

对于p35s:PSKR1（PSKR1-OE）来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTGTTCTTGAAATGCGTGTTCATCG-3’；SEQ IDNO：61）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTCTAGACATCATCAAGCCAAGAGAC-3’；SEQ ID NO：62），通过PCR扩增整个编码序列的3060bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pH2GW7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。

对于p35s:PSKR1:GFP融合体来说，使用引物attB1（5’-AAAAAGCAGGCTTTACCATGCGTGTTCATCGTTTT-3’；SEQ IDNO：63）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTAGACATCATCAAGCCAAGAGACT-3’；SEQID NO：64），通过PCR扩增不含终止密码子的整个编码序列的3056bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pK7FWG2.0（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。

对于PSKR1pro:GFP:GUS融合体来说，使用引物attB15’-AAAAAGCAGGCTTCATGGCAAGAAAATGTGAGAC-3’；SEQ IDNO：65）和attB2（5’-AGAAAGCTGGGTTTCAAGAACAGAGGAAGAAG-3’；SEQ ID NO：66），通过PCR扩增起始密码子上游的1795bp片段。将PCR片段***到pDON207供体载体中，然后使用Gateway技术（Invitrogen）***到植物表达载体pKGWFS7（Karimi等，2002）中。通过土壤杆菌介导的转化将T-DNA从得到的载体转移到Ws野生型中。使用PSKR1pro:GFP:GUS构建物，本发明人证实了PSKR1基因受到发育性调控（图3）。

实施例1：PSK突变体对南方根结线虫（M.incognita）和H.arabidopsidis的感染具有更高抗性。

I）植物发育期间的PSK表达：

在转基因株系PSK2pro:GFP:GUS中通过报告基因的活性分析了根和叶发育期间PSK2基因的表达。

结果：

如图1中所示，PSK2基因的表达受到发育性调控。揭示出PSK2启动子激活的GUS活性（A）和GFP（B）可以在根尖（侧根冠）中被检测到，但是不能在伸长区中被检测到。在充分分化的根中（C，D），PSK2表达集中在维管柱以及侧根原基（E）中。芽中PSK2的表达集中在叶和子叶的维管***（F）、毛状体（G）和气孔（H，I）中。

II）使用微阵列进行的对病原体的响应的基因表达分析：

通过微阵列杂交分析了在与南方根结线虫和H.arabidopsidis的相容相互作用期间PSK基因的表达情况。在分别用南方根结线虫和H.arabidopsidis感染后的不同时间点，从分离的菌瘿和感染的子叶制备样品。样品制备、在CATMA（南方根结线虫）和Affymetrix ATH1（H.arabidopsidis）微阵列上的杂交以及数据分析均按照所描述的（Jammes等，2005；Hok等，2011）进行。

结果：

如图2A中所示，在CATMA阵列上只显示出编码PSK2和PSK4的基因，并且这两种基因在菌瘿发育的所有阶段都被下调。同样的基因在感染的子叶中被上调，特别是在霜霉病感染的晚期。此外，在用H.arabidopsidis感染后观察到编码PSK5的基因的上调，而编码PSK1和PSK3的基因不改变（nc）表达强度。

III）使用实时定量RT-PCR进行的对病原体的响应的基因表达分析

在线虫接种后（DAI）7天（白色条）、14天（灰色条）和21天（黑色条），通过定量RT-PCR测定拟南芥菌瘿中与未感染的根相比的PSK转录本的相对积累量。使用2^-(ΔΔCt)方法，将目标基因的ΔCt（未感染的Ct–感染的Ct）与参比基因的ΔCt（未感染的Ct–感染的Ct）进行比较来建立PSK表达比率，其中目标基因是所分析的拟南芥PSK基因（PSK1-PSK5）之一，参比基因是AtUBP22（At5g10790）。等于1的比率表明PSK基因不受线虫感染调控。<-1和>1的比率分别指示基因抑制和激活。进行了两个生物学平行试验。结果显示在图2B中。

IV）使用报告基因表达进行的对病原体的响应的基因表达分析

如图2C中所示，分析了拟南芥PSK2pro:GFP:GUS报告物株系的被南方根结线虫感染的根的菌瘿中PSK2的表达模式。图2C的图像A和B显示出降低的GUS活性，在接种后5天（A）和14天（B）时形成的菌瘿的中心揭示出该GUS活性的降低。图2C的图像C显示了连续共聚焦光学体内切面的投影，其显示出GFP积累量的下调，所述GFP积累量表示巨细胞中的PSK2表达。

V）PSK敲除突变体的相互作用表型的定量分析

进行了PSK3敲除突变体（图6A）与H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析（图6B）。将来自于不同拟南芥株系的种子播种在土/砂混合物中，在4℃下砂藏3天，然后在生长室中在20℃和12h光照期下生长。如前所述（Dangl等，1992），每周将H.arabidopsidis分离株Emwa1和Noco2分别转移到易感登记株Ws-0和Col-0上。为了进行感染，将10日龄植物用致病性分离株Noco2的40,000个孢子/ml的孢子悬液喷雾接种至饱和。使用12h光照期将植物保持在16℃的生长柜中6天。通过用水喷洒植物，并将它们在高湿度下保持24h来诱导孢子形成。在接种后7天，将小植株收集在1ml水中，涡旋振荡，并使用血细胞计数器测定释放出的分生孢子的滴度。与野生型植物（Col-0）相比，在拟南芥psk3-1突变体的子叶上H.arabidopsidis分离株Noco2的孢子形成减少大于50%。在接种后7天，将小植株收集在1ml水中，涡旋振荡，并使用血细胞计数器测定释放出的分生孢子的滴度。对于统计学分析来说，为每个株系和分析制备了10个小植株的20个样品。将实验重复3次，结果相近。通过Student’s t-检验来确定值与野生型相比的统计学显著性差异（^***P<0.0001）。

实施例2：Pskr1敲除突变体对H.arabidopsidis的易感性降低

进行了4种拟南芥pskr1等位基因敲除突变体的分子分析。突变株系pskr1-1（SAIL_245_H03）、pskr1-2（FLAG_407D02）、pskr1-3（GABI_308B10）和pskr1-4（SALK-008585）分别来自于SyngentaArabidopsis Insertion Library、INRA（Versailles,France）、Max-Planck-Institut（Cologne,Germany）和SALK Institute（LaJolla,USA）。所有株系均是公众可获得的，并且可从诺丁汉拟南芥保藏中心（Nottingham Arabidopsis Stock Center）（pskr1-1、pskr1-3和pskr1-4）以及INRA Versailles（pskr1-2）获得。

在图8A中标出了引物附着位点和T-DNA在基因组中的***位点和方向。

如图8B中所示，RT-PCR揭示出野生型拟南芥（Col-N8846、Ws、Col-0和Col-8CS60000）中的PSKR1转录本。在所有等位基因突变体中不存在跨过***位点的扩增子。揭示出带有***位点的3’端的引物的转录本的扩增子最有可能源自于T-DNA内的转录起始，正如以前对其他***株系所报道的（Chinchilla等，2007，Nature448，497-500）。组成性表达的AtEF1α基因（At1g07930）转录本的扩增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR实验。

为了进行感染，将10日龄植物用致病性分离株（在Ws野生型和pskr1-2上使用Emwa1，在其他野生型和突变体上使用Noco2）的40,000个孢子/ml的孢子悬液喷雾接种至饱和。对于孢子形成的统计学分析来说，为每个株系和分析制备了10个小植株的20个样品。条表示平均值（±SD），***指示通过Student’s t-检验确定的野生型与突变体株系之间的显著性差异，其中P<0.0001。所有实验被重复3次并给出相近结果。1-1、1-2、1-3和1-4分别表示突变体pskr1-1、pskr1-2、pskr1-3和pskr1-4。

结果：

如图8C中所示，所有pskr1等位基因敲除突变体表现出提高的霜霉病抗性。无性繁殖，一种由霜霉病卵菌病原体引起的病害的指示，减少了大于50%。

实施例3：Pskr1敲除突变体对南方根结线虫的易感性降低。

在萌芽后14天，用150个表面除菌的新鲜孵化的南方根结线虫J2在体外感染拟南芥植物。使用16-h的光照期将感染的幼苗保持在20℃下。在感染试验期间，在60DAI（接种后天数）时执行卵块计数，以允许线虫完成其生命周期。正如在接种后10天（10Dpi）所分析的，在pskr1突变体和野生型植物中，线虫以相似程度感染根并引发菌瘿形成。在21Dpi时，在pskr1突变体中观察到成熟菌瘿的量减少。在卵块的单性繁殖生产期间，在不存在PSKR1的情况下线虫发育的抑制变得最为明显，所述卵块的单性繁殖生产在pskr1突变体上在75Dpi时被强烈减少。

结果：

如图9中所示，pskr1等位基因突变体对南方根结线虫的易感性降低，因为在不存在PSKR1的情况下根结线虫的繁殖被强烈抑制。作为由根结线虫引起的病害的指示，菌瘿和卵块的生产被强烈地降低。

实施例4：pskr1敲除突变体对青枯雷尔氏菌（R.solanacearum）感染的易感性降低。

将拟南芥种子用12%次氯酸钠溶液除菌20分钟，用无菌水洗涤数次，并播种在MS培养基上。然后将在生长室中在20℃下生长8天的小植株转移至Jiffy盆（Jiffy France，Lyon，France），并在短日照条件（以500μE s^–1m^–2光照10小时）下生长3周。将具有Ws和Col遗传背景的植物（突变体植物、互补的突变体植物和过表达PSKR1的植物）分别用致病性细菌分离株RD15和GMI1000进行根部接种。从Jiffy盆的底部切出约2cm，并将植物暴露出的根在含有10⁷个细菌/ml的悬液中浸泡3min。然后将植物转移至生长室，日/夜周期分别为27℃、120-140μEm-1s-28小时和26℃16小时，保持相对湿度为75%。在接种后3、4、5、6和7天，按照病害指数（DI）对接种后植物上的病害症状进行评分，所述病害指数覆盖DI0（无枯萎）和分别表示25%、50%、75%和100%叶片枯萎的DI1、DI2、DI3和DI4。

结果：

pskr1敲除突变体表现出对细菌病原体青枯雷尔氏菌（Ralstoniasolanacearum）的易感性降低，因为在不存在PSKR1的情况下细菌性枯萎症状的出现被延迟（图10）。在接种后3至5天之间的细菌指数生长期中观察到的提高的抗性是显著的，其中P<0.0001。拟南芥的Col遗传背景（图10B）显示出对青枯雷尔氏菌总体较高的易感性，并且pskr1突变的效应在Ws遗传背景（图10A）中在pskr1-2中最为显著。通过将有功能的PSKR1基因导入pskr1-2遗传背景中（互补株系Cppskr1-2），对青枯雷尔氏菌的全部易感性得以恢复。在组成性35S启动子控制下过表达PSKR1的株系（过表达株系PSKR1-OE）中，观察到病害在感染的晚期时间点加速。

实施例5：在用霜霉病卵菌病原体H.arabidopsidis感染后拟南芥中PSKR1基因的表达模式

在用水或霜霉病病原体Hyaloperonospora arabidopsidis（Hpa）的40,000个孢子/ml的分生孢子悬液对拟南芥（生态型Ws-0）的子叶进行喷雾处理后的不同时间点，通过qRT-PCR分析PSKR1转录本的丰度（参见图4A）。如图4B中所示，在感染后，PSKR1的表达继续增加并集中于叶肉的被感染区域。

实施例6：根结线虫南方根结线虫（M.incognita）的感染不触发PSKR1基因的转录激活，但是下调巨细胞中的表达。

在根部接种后7、14和21天时，首先通过qRT-PCR分析PSKR1转录本的丰度。在萌芽后14天，用150个表面除菌的新鲜孵化的南方根结线虫J2幼虫在体外感染拟南芥植物。使用16-h的光照期将感染的幼苗保持在20℃下。使用Q-Base将PSKR1mRNA的相对量用AtUBP22（At5g10790）进行归一化。比率等于1表示PSKR1基因不受线虫感染调控（图5A）。在用150个表面除菌的新鲜孵化的南方根结线虫J2幼虫接种后7天（A）和21天（B）时，菌瘿中在PSKR1启动子控制下的GFP报告基因的表达模式是由拟南芥根中的南方根结线虫诱导的（图5B）。有趣的是，由线虫在巨细胞中诱导的PSKR1的表达似乎被下调。

本发明人假设，PSKR直接参与巨细胞的个体发生，或者可能在巨细胞周围的细胞（其中表达PSKR）中对它们的***或维管元件的重新形成有作用。在繁殖之前，周围的细胞对于获得有功能的饲养细胞、即构成线虫专门的营养物源的特化泡（specialized sink）来说，也应该是重要的。

实施例7：过表达PSK基因的植物对H.arabidopsidis和南方根结线虫的易感性更高。

进行了过量生产PSK2和PSK4的转基因株系与H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。当与野生型植物（Ws）相比时，在过表达PSK的拟南芥株系的子叶上H.arabidopsidis分离株Emwa1的孢子形成强烈增加。为了进行统计学分析，为每个株系和分析制备了10个小植株的20个样品。将实验重复3次，结果相近。通过Student’s t-检验来确定值与野生型相比的统计学显著性差异（^***P<0.0001），如图7A中所示。

图7B显示了在组成性过表达PSK的转基因株系中根结线虫繁殖被显著刺激。在萌芽后14天，用150个表面除菌的新鲜孵化的南方根结线虫J2对拟南芥植物进行体外感染。使用16-h的光照期将感染的幼苗保持在20℃下。在感染试验期间，在75Dpi（接种后天数）时执行卵块计数，以允许线虫完成其生命周期。正如分别在接种后10天和21天所分析的，在过表达PSK的植物中与野生型植物中相比，线虫以更高的程度感染根和引发菌缨形成，并发育成成熟菌瘿。通过Student’s t检验确定统计学显著性差异（^*P<0.01，^**P<0.001，^***P<0.0001）。

为了确定过表达PSK的株系对青枯雷尔氏菌的易感性，建立了细菌生长曲线。将4周龄植物用含有10⁷个细菌/ml的致病性细菌分离株RD15的溶液进行根部接种。然后将植物转移至生长室，日/夜周期分别为27℃、120-140μE m^-1s^-28小时和26℃16小时，保持相对湿度为75%。为了建立细菌的内部生长曲线，将三个接种后植物的地上部分称重，用250ml70%乙醇除菌3min，在无菌水中清洗3次，并在添加无菌水（每克湿重2.0ml）后在研钵中研磨。然后使用无菌水进行研磨材料的各种不同稀释，并将3x40μl细菌悬液点样在含有固体SMSA培养基的皮氏培养皿上（Elphinstone等，1996），在30℃下生长。对于每个时间点，对每个细菌菌株和拟南芥登记株进行三份平行测定。

结果：

-过表达PSK2或PSK4基因的植物对H.arabidopsidis更加易感。在两种转基因株系中，作为由霜霉病卵菌病原体引起的病害的指示的无性繁殖被显著增加（图7A）。

-过表达PSK2或PSK4基因的转基因植物对线虫病原体南方根结线虫更加易感。当与野生型相比时，在转基因株系中在75Dpi时卵块的单性生殖生产被显著增加（图7B）。

-过表达PSK2或PSK4基因的植物对青枯雷尔氏菌更加易感。图7C显示出在过量生产PSK2的转基因株系中细菌繁殖更快。在3Dpi时青枯雷尔氏菌的繁殖被强烈增加，导致被感染的PSK过表达株系中细菌的量与野生型植物相比高出100至1000倍（图7C）。

实施例8：过表达PSKR基因的植物对H.arabidopsidis更加易感。

为了基因的过表达，从基因组DNA扩增包含起始和终止密码子的3,060bp的编码区，将其克隆到Gateway目的载体pH2GW7（Karimi等，2002）中，并通过土壤杆菌介导的转化转入拟南芥中。如前所述进行病原体测定。所有实验被重复三次，并给出相近结果（参见图11A）。通过定量实时RT-PCR测定拟南芥幼苗（播种后15天）中PSKR1转录本的相对积累量。使用2^-(ΔΔCT)方法来计算表达比率，将UBP22（At5g10790）用于归一化，并以野生型PSKR1表达作为参比物。条（±SD）表示三个技术平行样的平均值（参见图11B）。

结果：

在过表达PSKR的突变体植物中分析PSKR的表达。如图11中所示，PSKR1的过表达（株系PSKR1-OE）使霜霉病易感性增加几乎100%。因此，霜霉病易感性与PSKR1的表达相关。

实施例9：pskr1突变体的抗性提高表型不是由防御机制提高造成的。

水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（JA/乙烯）介导的信号转导途径的标志物基因分别是PR1a（At2g14610）、PDF1.2（At5g44420）和PR4（At3g04720）。在野生型（Ws）、突变体（pskr1-2）和转基因PSKR1过表达株（PSKR1-OE）植物中，在用水或用H.arabidopsidis分离株Emwa1的分生孢子悬液（40,000个孢子/ml）对子叶进行喷雾处理后，通过定量实时RT-PCR分析了这些防御相关基因的表达。在0时间点以及处理开始后24、48、72和120小时，制备用于RNA提取和qRT-PCR的样品。使用Q-Base软件将标志物基因转录本的相对量用AtOXA1（At5g62050）和AtUBP22（At5g10790）进行归一化。显示的是来自于3个技术平行样的平均值（±SD）。两个独立的实验给出相似结果。

结果：

如图12中所示，拟南芥中SA、JA和JA/乙烯介导的防御信号转导途径的激活不依赖于PSKR1。pskr1-2突变体和PSKR过表达植物的这些防御信号转导途径未改变，即pskr1-2突变体抗性的提高与防御增加无关，并且过表达株系的易感性提高与防御降低无关。在H.arabidopsidis接种的pskr1-2突变体植物中防御激活的大幅降低，最可能反映了霜霉病发展的降低。

实施例10：PSKR1的抑制引起病原体的增殖降低

如实施例4中所公开的，产生Pskr1突变体。这些植物与野生型植物相比显示出延迟的病害发展。

在另一组实验中（参见图13），本发明人调查了这种降低的易感性是否由病原体的增殖降低引起。为此目的，使用三种不同病原体，即青枯雷尔氏菌（图13A和13B）、H.arabidopsidis（图13C）和南方根结线虫（图13D），对野生型植物、pskr1突变体、过表达株系和互补株系进行接种。

-青枯雷尔氏菌的增殖分析（图13A和13B）

将四周龄植物用含有10⁷个细菌/ml的致病性细菌分离株RD15的溶液进行根部接种。为了分析青枯雷尔氏菌的细菌内部生长，执行上述方法步骤（参见图7C的图例说明以及实施例7）。在接种后的不同时间点重新提取青枯雷尔氏菌以测定病原体的滴度。对于每个时间点，对每种拟南芥株系执行三份平行测定。

-H.arabidopsidis的增殖分析（图13C）

将植物用40,000个孢子/ml进行喷雾接种，并在接种后5天收集子叶。通过台盼蓝染色在显微镜下分析H.arabidopsidis的细胞内生长和分枝。将感染的幼苗用台盼蓝溶液（0.01%w/v，在10%苯酚、10%乳酸、10%水、20%甘油和50%乙醇中，v/v）覆盖，煮沸3min，在室温下储存过夜，用2.5g/ml水合三氯乙醛漂白，然后在50%甘油中被固定在显微镜载片上，并进行拍照。

-南方根结线虫的增殖分析（图13D）

为了进行形态学分析，在接种后第7、14和21天，将pskr1-2、PSKR1-OE和野生型植物（生态型Ws）的被线虫感染的根固定在含有2%戊二醛的50mM Pipes缓冲液（pH6.9）中，然后脱水并按照制造商的描述包埋在Technovit7100（Heraeus Kulzer，Wehrheim，Germany）中。将包埋的组织切片（3μm），在0.05%甲苯胺蓝中染色，固定在Depex（Sigma）中，并使用亮视野光学部件执行显微术。使用数字相机（Axiocam；Zeiss）收集图像。与对照相比，在接种后7天来自于pskr1-2和PSKR1-OE的菌瘿的组织切片在菌瘿和巨细胞形成方面未显示出差异。在菌瘿发育的较晚阶段（接种后14和21天），来自于pskr1-2突变体植物的巨细胞显著更小。为了进行巨细胞表面测量，使用AxioVision V4.8.1.0软件检查用甲苯胺蓝染色的连续切片。

最后，在从分离自不同株系的切成薄片的、甲苯胺蓝染色的根获得的数字化显微照片上，对南方根结线虫感染后巨细胞的发育进行定量。选择来自于每种表型至少50个菌瘿中每个菌瘿的3个最大的巨细胞进行测量。在接种后14天，来自于pskr1-2突变体植物的菌瘿与对照植物相比含有显著更小的巨细胞。

结果：

图13清楚地显示，PSKR1的抑制引起下列病原体的增殖降低：青枯雷尔氏菌（细菌），H.arabidopsidis（卵菌）和南方根结线虫（线虫）。

具体来说，图13A和13B显示，在pskr1-2突变体中，在不存在PSKR1的情况下细菌青枯雷尔氏菌的繁殖被强烈地减少。在将有功能的PSKR1基因导入pskr1-2遗传背景中（互补株系Cppskr1-2）后，细菌繁殖恢复到野生型水平，并且在组成性35S启动子控制下过表达PSKR1的株系（过表达株系PSKR1-OE）中，细菌繁殖增加。由此得出结论，细菌繁殖在pskr1-2突变体中急剧减少（～1,000倍），在互补株系Cppskr1-2中恢复，并在过表达株系中增加（～2倍）。

图13C显示，在pskr1-2突变体中，在不存在PSKR1的情况下卵菌H.arabidopsidis的网络和菌丝分枝被强烈地减少，但是在PSKR1-OE株系中在PSKR1过表达后变得异常。

图13D显示，在不存在PSKR1的情况下，线虫南方根结线虫卵块生产的减少是巨细胞尺寸减小的结果。

实施例11：通过TILLING策略产生PSKR1基因的突变体番茄株系

使用番茄SlPSKR序列（SEQ ID NO：67）作为用于TILLING策略的靶，以获得具有失活的PSKR1蛋白并对植物病原体具有降低的易感性的番茄株系。

TILLING方法本身在本技术领域中是公知的，包括制备基因组DNA，产生DNA库和超库，定向鉴定单核苷酸交换，以及反演步骤，以获得个体（参见例如Piron等，2010）。

本发明人测试了来自于亲本M82番茄株系的植物与卵菌寄生疫霉（Phytophthora parasitica）和根结线虫南方根结线虫（Meloidogyneincognita）的相互作用表型。亲本株系对两种病原体充分易感。选择SlPSKR1作为用于TILLING方法的靶基因，因为它不含内含子。本发明人确定了如图14中所示的待靶向的SlPSKR1的两个基因组区域。第一个靶对应于蛋白的细胞外LRR结构域的编码序列。第二个靶对应于蛋白的C-端区域的编码序列，所述C-端区域包括跨膜结构域和激酶结构域。各自使用2组引物产生靶1和2的扩增子，一组引物是靶特异性的，第二组嵌套在第一组上并允许产生接头。使用在5’末端用红外染料IRD700和IRD800标记的通用M13引物来产生最终扩增子，在用Endo1消化后分析所述最终扩增子的异源双链体。用于SlPSKR1TILLING的引物具有SEQ ID NO：76至85的序列，如下表所示：

对每个孔含有来自于8个个体的基因组DNA的7块96孔滴定板的筛选，揭示出靶1中的23个潜在突变以及靶2中的14个潜在突变（=37个潜在突变体）。反演步骤导致鉴定到前6个个体株系，其中4个在靶1中带有单核苷酸变化，2个在靶2中带有单核苷酸变化。

将来自于6个个体株系的种子播种，产生对植物病原体具有降低的易感性的纯合子植物。在图14中标出了结构域、靶、引物附着位点和获得的6个突变在SlPSKR1内的位点。

结论

综上所述，表达数据和表型数据表明，PSK和PSKR基因是对植物病原体的抗性的负调控物，并且，在PSK和PSKR敲除突变体中观察到的对病原体的提高的抗性和对感染的降低的易感性，是由PSK或PSKR基因中的“功能丧失”突变造成的。

pskr1突变体的抗性提高不是组成性激活的或病原体触发的防御响应的结果，因此所述突变体表现出易感性丧失表型而不是获得抗性。如图12中所示，拟南芥中水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（JA/乙烯）介导的防御信号转导途径的激活不依赖于PSKR1。SA、JA和JA/乙烯介导的信号转导途径的标志物基因分别为PR1a（At2g14610）、PDF1.2（At5g44420）和PR4（At3g04720）。在野生型（Ws）、突变体（pskr1-2）和转基因PSKR1过表达株（PSKR1-OE）植物中，在用水或H.arabidopsidis分离株Emwa1的分生孢子悬液（40,000个孢子/ml）对子叶进行喷雾处理后，通过定量实时RT-PCR分析了这些防御相关基因的表达。

此外，使用pskr1突变体获得的数据证实了PSKR1的抑制与病原体增殖的降低之间的关联性。

此外，使用过表达PSK或PSKR的植物获得的数据证实了PSK的表达与对感染的易感性之间的关联性，因为PSK或PSKR1的过表达提高了对病原体感染的易感性。

这是迄今为止发现的对病害抗性进行负调控的植物生长因子的第一个实例。

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Claims

1.用于保护植物抵抗病原体的方法，所述方法包括永久或暂时地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素（PSK）功能的步骤。

2.用于提高植物中的病原体抗性的方法，所述方法包括永久或暂时地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素（PSK）功能的步骤。

3.用于减少植物中的病原体增殖的方法，所述方法包括永久或暂时地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素（PSK）功能的步骤。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述植物具有有缺陷的PSK基因、有缺陷的PSK肽、有缺陷的PSK受体（PSKR）基因和/或有缺陷的PSKR受体。

5.权利要求4的方法，其中由于一个或多个核苷酸的缺失、***和/或取代、位点特异性诱变、甲磺酸乙酯（EMS）诱变、定向诱导基因组局部突变（TILLING）、EcoTILLING、敲除技术、用核酶或反义核酸失活、或由RNA干扰诱导的基因沉默，所述PSK基因或PSKR基因是有缺陷的。

6.权利要求5的方法，其中所述PSK基因和/或PSKR基因被完全或部分缺失。

7.权利要求4至6任一项的方法，其中当所述植物细胞中存在PSK基因的数个拷贝时，使PSK基因的每个拷贝变成有缺陷的。

8.权利要求4至6任一项的植物，其中在所述植物细胞中，使PSKR1基因和PSKR2基因变成有缺陷的。

9.权利要求4的方法，其中通过将所述植物暴露于针对PSK肽的抗体或可溶性PSKR受体或者通过在所述植物中表达针对PSK肽的抗体或可溶性PSKR受体，来失活所述PSK肽。

10.前述权利要求任一项的方法，其中所述植物病原体选自真菌、卵菌、线虫或细菌。

11.前述权利要求任一项的方法，其中所述植物是双子叶植物，优选自茄科（Solanaceae）植物（例如番茄）、百合科（Liliaceae）植物（例如芦笋）、伞形科（Apiaceae）植物（例如胡萝卜）、藜科（Chenopodiaceae）植物（例如甜菜）、葡萄科（Vitaceae）植物（例如葡萄）、豆科（Fabaceae）植物（例如大豆）、葫芦科（Cucurbitaceae）植物（例如黄瓜）或十字花科（Brassicacea）植物（例如油菜籽、拟南芥（Arabidopsis thaliana）），或者是单子叶植物，优选自禾本科（Poaceae）谷类植物（例如小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱或玉米）。

12.用于生产对植物病原体具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

（a）失活植物细胞中的PSK基因和/或PSKR基因；

（b）任选地，选择具有有缺陷的PSK基因和/或PSKR基因的步骤（a）的植物细胞；

（c）从步骤（a）或（b）的细胞再生成植物；以及

（d）任选地，选择对病原体具有提高的抗性的（c）的植物，所述植物具有有缺陷的PSK基因或PSKR基因。

13.权利要求12的方法，其中在步骤（a）中，通过一个或多个核苷酸的缺失、***和/或取代、位点特异性诱变、甲磺酸乙酯（EMS）诱变、定向诱导基因组局部突变（TILLING）、EcoTILLING、敲除技术或通过由RNA干扰诱导的基因沉默来失活所述PSK基因或PSKR基因。

14.权利要求12或13的方法，其中所述植物是双子叶植物，优选自茄科（Solanaceae）植物（例如番茄）、百合科（Liliaceae）植物（例如芦笋）、伞形科（Apiaceae）植物（例如胡萝卜）、藜科（Chenopodiaceae）植物（例如甜菜）、葡萄科（Vitaceae）植物（例如葡萄）、豆科（Fabaceae）植物（例如大豆）、葫芦科（Cucurbitaceae）植物（例如黄瓜）或十字花科（Brassicacea）植物（例如油菜籽、拟南芥（Arabidopsis thaliana）），或者是单子叶植物，优选自禾本科（Poaceae）谷类植物（例如小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱或玉米）。

15.权利要求12至14任一项的方法，其中所述植物病原体选自真菌、卵菌、线虫或细菌。

16.抑制PSK基因或PSKR基因的表达的RNAi分子的以下用途：用于提高植物或植物细胞对植物病原体的抗性，和/或用于减少植物或植物细胞中的植物病原体增殖，和/或用于保护植物或植物细胞抵抗植物病原体。

17.调节PSKR基因表达的分子的鉴定方法，所述方法包括：

（b）将所述细胞与候选分子相接触；

（d）选择调节所述标志物蛋白的表达的分子。

18.权利要求17的方法，其中所述分子抑制PSKR的表达。

19.按照权利要求17或18选择的分子的以下用途：用于提高植物对植物病原体的抗性，和/或用于减少植物或植物细胞中的植物病原体增殖，和/或用于保护植物或植物细胞抵抗植物病原体。

20.与PSK肽或PSK受体特异性结合的抗体，或这样的抗体的具有基本上相同的抗原特异性的片段或衍生物。