CN1145691C - 抗旱或抗盐胁迫转基因谷类植物的生产 - Google Patents

抗旱或抗盐胁迫转基因谷类植物的生产 Download PDF

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Abstract

本发明涉及经编码晚期胚胎发生丰富蛋白核酸转化用于再生对水胁迫或盐胁迫具有抗性的谷类植物的谷类植物细胞或原生质体的生产方法。也提供编码晚期胚胎发生丰富蛋白核酸转化的转基因谷类植物或谷类植物细胞或原生质体。将大麦的LEA蛋白基因HVAl(Hordeum vulgare L.)转入水稻(Oryza sativa L.)植物。所得转基因水稻植物的叶片和根中累积HVAl蛋白。转基因水稻表现出明显增强的对水胁迫(干旱)和盐胁迫的抗性。

Description

抗旱或抗盐胁迫转基因谷类植物的生产
本申请要求美国临时专利申请60/005,223号(1995年10月12日递交)的优先权。
发明领域
本发明一般涉及转基因谷类植物，更具体说涉及含有编码一种可使转基因谷类植物形成水或盐胁迫抗性的晚期胚胎发生丰富蛋白的核苷酸的转基因谷类植物。
发明背景
本申请全篇引用了各种参考文献，许多在圆括号内注明。将这些文献的完整引述提供于本详述之后。这些文献所公开的全部内容在本申请中引作参考。
环境胁迫，例如干旱，增高的土壤盐分，以及极端温度，是限制植物生长和产量的主要因素。估计全世界三种主要谷类作物，水稻、玉米和小麦每年由于水(干旱)胁迫造成的减产已超过一百亿美元。培育抗逆作物是解决这一难题的希望(Epstein等，1980)。但是，传统育种方法对于产生各种抗逆性增强的作物变种来说过程缓慢。有限的抗逆种质资源以及远源植物物种间的杂交不相容性是传统育种所面临的另外的问题。最近在植物遗传转化和从各种资源鉴定的具有潜在有用基因的可用性方面取得的进展使得用转基因的方法产生抗逆作物成为可能(Tarczynski等，1993；Pilon-Smits等，1995)。
鉴定和克隆抗逆基因面临着挑战。遗传学研究表明一些对干旱和盐度具有抗性的作物变种主要是基于额外的基因功效(Akbar等，1986a，1986b)。但是，关于所述抗性的分子学机制还未阐明。已在多种植物中进行了对高浓度离子或非离子溶质及降低水潜能的生理和生化反应的研究。在累积的实验观察和理论分析基础上，揭示出植物对于渗透胁迫的适应或抗性机理可能在于一些相容的，低分子量渗透质(osmolytes)如糖醇，特殊氨基酸，和甘氨酸甜菜碱(glycinebetaine)的积累(Greenway和Munns，1980；Yancey等，1982)。最近，一项转基因研究表明在转基因烟草中累积的糖醇甘露糖醇对于盐胁迫可形成保护(Tarczynski等，1993)。两项近期运用转基因方法的研究表明甘氨酸甜菜碱生物合成途径的代谢工程不仅有可能而且最终导致产生抗逆植物(Holmstrom等，1994；Rathinasabapathi等，1994)。
除了代谢变化和低分子量化合物的累积外，一大组基因被转录激活，因此导致在渗透胁迫条件下植物营养组织中新蛋白质的积累(Skriver和Mundy，1990；Chandler和Robertson，1994)。据报道一些基因的表达水平与同一种属植物不同变种的抗脱水，盐，或寒冷性有关。一般假定胁迫诱导的蛋白在抗性方面起重要作用，但仍缺乏直接证据，并且许多胁迫反应基因的功能还未知。阐明这些胁迫反应基因的功能不仅提高我们对于植物环境胁迫的适应和拮抗的理解，而且可为设计作物品质提高的新策略提供重要信息(Chandler和Robertson，1994)。
首先在棉花中鉴定晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA proteins)是一组在种子发育后期高度累积于胚胎中的蛋白质(Dure等，1981)。之后，从不同种植物中鉴定了许多LEA蛋白或其基因(Dure整理，1992)。基于它们拥有共同的氨基酸序列域(domains)，将LEA蛋白划分为三大组(Baker等，1988；Dure等，1989)。第2组LEA蛋白及其cDNA已从水稻中鉴定出来(Mundy和Chua，1988)。第2组LEA基因家族的四个成员串联排列在同一位点，并且在对ABA，干旱，和盐胁迫产生反应时在各种水稻组织中协同表达(Yamaguchi-Shinozaki等，1989)。但是，这些LEA蛋白的功能是未知的。最近，已将第2组和第3组LEA蛋白由印度水稻(Indica rice)变种中鉴定出来并且这些LEA蛋白在对盐胁迫反应中的累积与各品种对盐胁迫的抗性有关(Moons等，1995)。在许多植物(单子叶和双子叶植物)中可检测到含有的广泛的共有序列的第2组LEA蛋白(dehydrins)(Close等，1993)。最近的一项研究表明第2组LEA基因存在于许多植物物种中但在胁迫敏感和胁迫抗性物种中这些基因的表达受不同的调控(Danyluk等，1994)。
早已从大麦糊粉中鉴定了大麦的第3组LEA蛋白，HVA1。在种子发育后期在糊粉层和胚中特异性表达HVA1基因，与种子脱水干燥期有关(Hong等，1988)。在幼苗中ABA和几种胁迫条件包括脱水，盐和极端温度等快速诱导HVA1基因表达(Hong等，1992)。
HVA1蛋白属于第3组LEA蛋白，它包括其它一些成员如小麦pMA2005(Curry等，1991；Curry和Walker-Simmons，1993)，棉花D-7(Baker等，1988)，胡萝卜Dc3(Seffens等，1990)，以及油菜pLEA76(Harada等，1989)。这些蛋白以具有11个串联重复的氨基酸域，它可以形成一个具有疏水区亲水表面的双亲和性的α-螺旋结构为特征(Baker等，1988；Dure等，1988；Dure，1993)。大麦的HVA1基因和小麦的pMA2005基因(Curry等，1991；Curry和Walker-Simmons，1993)在核苷酸水平和所预示的氨基酸水平高度相似。这两种单子叶植物基因与棉花的D-7基因(Baker等，1988)和胡萝卜的Dc3基因(Seffens等，1990)紧密相关，它们有着相同的结构基因组成(Straub等，1994)。
在许多情况下，LEA mRNA和蛋白的积累时间与种子脱水过程有关并和体内脱落酸(ABA)水平的升高有关。LEA基因也可以在分离的幼胚中由ABA，以及在营养性组织中由ABA和多种环境胁迫，如干旱，盐，和极端温度所诱导表达(Skriver和Mundy，1990；Chandler和Robertson，1994)。
因此，在许多植物中LEA基因表达或LEA蛋白积累与抗胁迫有关。例如，在严重脱水的小麦幼苗中，高水平第3组LEA蛋白的积累与组织抗脱水有关(Ried和Walker-Simmons，1993)。关于印度水稻变种的研究表明耐盐变种根中的第2组LEA蛋白(亦称作dehydrins)和第3组LEA蛋白水平明显较敏感的变种中的高(Moon等，1995)。
另一方面，其它LEA蛋白的存在并非总与胁迫抗性有关。例如，对于野生(水)稻和脱粒未碾的稻子的比较研究表明在低温下野生稻种子对脱水的不耐受性并不能归咎于缺乏或不能够合成第2组LEA/dehydrin蛋白，ABA，或可溶性碳水化合物(Bradford和Chandler，1992；Still等，1994)。从烟草复活植株Craterostigma中产生的过量第2组LEA蛋白并未对渗透胁迫形成抗性(Iturriaga等，1992)。已发现在大豆种子中LEA蛋白不足以对脱水形成抗性，而是LEA蛋白和可溶性蔗糖共同有助于抗性(Blackman等，1991，1992)。
在这些有关抗旱或抗盐性提高的报道中，在受胁迫植物中激活了一大组基因(Skriver和Mundy，1990；Chandler和Robertson，1994)。LEA蛋白仅是这些基因产物中的一种，还有其它许多蛋白与抗旱或抗盐性的提高有关(即受到水或盐胁迫时这些其它蛋白的水平也相应增高)。因此，虽然LEA蛋白与增强的水或盐胁迫抗性有关，然而并无任何特异激活的基因(包括LEA基因)能够对植物形成水或盐胁迫抗性的证据。因此，还没有获得到用于植物遗传工程以增强其对水或盐胁迫的抗性的合适基因。
因此，有必要鉴定一种用于转化基因植物后可编码使植物形成水或盐胁迫抗性的蛋白基因。这样的水或盐胁迫抗性植物可以有许多用途，尤其是在农业上并具体在为主要农作物的谷类植物中。
发明概述
因此，本发明提供生产谷类植物细胞或原生质体的方法，通过转化经编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸的谷类植物细胞或原生质体可用于再生为抗旱或抗盐谷类植物。
另外本发明提供用编码晚期胚胎发生丰富蛋白(当由谷类植物细胞或原生质体在谷类植物上再生时可形成抗旱或抗盐性)核酸转化的谷类植物细胞或原生质体，以及用编码晚期胚胎发生丰富蛋白核酸转化谷类植物，所述蛋白使植物成为抗水或抗盐胁迫植物。
本发明还提供据此发明产生的转基因谷类植物的种子，当其萌发时便产生此发明的转基因谷类植物。
本发明另外提供提高谷类植物对水或盐胁迫条件抗性方法。所述方法包括提高谷类植类植物中晚期胚胎发生丰富蛋白的水平。这可通过转化谷类植物方法将启动子和编码晚期胚胎丰富蛋白(LEA)核酸导入的途径来实现。
更具体地说，将LEA蛋白基因(来自大麦(Hordeum vulgare L.)的HVA1)转进水稻(Oryza sativa L.)。得到的转基因水稻植株在其叶片和根中持续性积累HVA1蛋白。转基因水稻植株表现出明显增强的抗旱和抗盐性。这种增强的抗性可以通过在胁迫引致的受损性状延迟发生以及撤除胁迫条件后可较好恢复得到反应。抗性提高的程度与转基因水稻植株中HVA1蛋白积累的水平有关。因此，可将LEA基因用作通过形成胁迫抗性而改良作物的分子工具。
附图说明
联系所附图谱进行阅读时，本发明的各种特点和优势将会从以下的优选实施例的详述中得到明显体现。
图1.表明在转基因水稻中表达HVA1的质粒pBY520之结构。只标明了普遍的限制性内切酶位点并用实方框代表那些用于DNA印迹杂交的位点。也标明了在DNA印迹杂交中用作探针的DNA片段。
详细描述
本发明提供了一个通过用编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸转化用于再生为抗水或盐胁迫谷类植物的谷类植物细胞或原生质体的产生方法。一旦发生转化，所述谷类细胞或原生质体能够再生为转基因谷类植物。
本发明还涉及到提高谷类植物对水或盐胁迫条件抗性的方法。此方法包括提高谷类植物中晚期胚胎发生丰富蛋白的水平。这可通过在谷类植物中用一个强启动子调控异源晚期胚胎发生丰富蛋白基因的表达来完成。
可据此发明进行转化的谷类有木本科(Gramineae)(亦知为Poaceae)家族，并包括水稻(Oryza属)，小麦，玉米，大麦，燕麦，高粱和粟米。优选此谷类为水稻，小麦或玉米，最优选水稻。可转化许多种属的谷类，并且在同一种中可转化许多亚种和变种。例如，水稻种中的亚种印度水稻(Oryza sativa ssp.Indica)，它包括变种IR36，IR64，IR72，Pokkali，Nona Bokra，KDML105，Suponburi 60，Suponburi 90，Basmati 385和Pusa Basmati 1。另一个水稻亚种是Japonica，它包括Nipponbere，Kenfeng和Tainung 67。合适的玉米变种的例子包括A188，B73，VA22，L6，L9，K1，509，5922，482，HNP和IGES。合适的小麦变种的例子包括Pavon，Anza，Chris，Coker983，FLA301，FLA302，Fremont和Hunter。
鉴定了目标谷类植物，适合作转化的植物细胞包括未成熟胚，愈伤组织，悬浮细胞和原生质体。特别优选使用悬浮细胞和未成熟胚。
这些谷类植物细胞用核酸进行转化，核酸可以是RNA或DNA及更优选cDNA，核酸编码晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA蛋白)。核酸可用生物方法分离或合成。在以下实施例中，由大麦的HVA1基因编码LEA蛋白，该蛋白具有如Straub等(1994)所公开的核苷酸和氨基酸相同序列。但是，也可利用其它LEA基因，尤其是其它属于第3组的LEA基因。这些第3组的其它LEA基因包括棉花D-7和D-29(Baker等，1988；Dure等，1981)，Brassica pLEA76(Harada等，1989)，胡萝卜Dc8和Dc3(Franz等，1989；Seffens等，1990)，大豆pmGM2(Hsing等，1992)，及小麦pMA2005和pMA1949(Curry等，1991；Curry和Walker-Simmons，1991)。在此引入这些LEA蛋白已公开的核苷酸和氨基酸序列作参考。根据本发明可用每个公开的核苷酸和氨基酸序列编码LEA蛋白的核酸以转化适合的谷类植物。亦可应用其它的第2组或第1组LEA基因。Dure(1992)公开了各种LEA基因。
可通过质粒来完成对植物细胞的转化。可以用质粒将编码LEA蛋白的核酸引入植物细胞。因此，质粒优选包括***特定限制性酶切位点的编码LEA蛋白的DNA。异源DNA，如在此所用，是指在质粒所转化的特定宿主细胞中正常并不存在的DNA。DNA用本领域所熟知的标准克隆方法***载体。这通常包括使用限制性酶和DNA连接酶，如Sambrook等在Molecular Cloing：A Laboratory Manual，2dedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)中所述。用所得到的含有编码LEA蛋白的核酸质粒转化宿主细胞，如农杆菌(Agrobacterium)和/或植物细胞(参看Plant MolecularBiology Manual，2nd Edition，Gelvin，S.B.和Schilperoort，R.A.，Eds.，Kluwer Academic press，Dordrecht，Netherlands(1994))。
对于植物转化而言，优选质粒也包括一个植物转化的筛选标记。一般使用的植物筛选标记包括潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因，草丁膦乙酰转移酶基因(bar)，5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，新霉素-3’-O-磷酸转移酸酶(npt II)或乙酰乳酸盐合成酶(ALS)。
优选质粒也包括用于编码LEA蛋白核酸和标记基因表达的合适启动子。常用花椰菜花叶病毒的35s启动子以及水稻肌动蛋白1基因启动子进行植物转化。在以下实施例所使用的质粒pBY520中，编码LEA蛋白的核酸由水稻的组成型启动子肌动蛋白1基因调控同时筛选标记基因(bar)由花椰菜花叶病毒的35s启动子调控。以LEA基因转化植物的其它有用启动子包括那些编码泛肽和蛋白酶抑制剂II(PINII)的基因，以及胁迫诱导启动子(如大麦的HVA1基因启动子)。
被命名为pBY520的质粒已于1995年10月12日依据和满足《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约》的要求，在美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852)以保藏号ATCC NO.69930，保藏于大肠杆菌菌株pBY520/DH5α中。
对于植物转化，优选质粒也包含有比如从编码蛋白酶抑制剂、肌动蛋白、或胭脂碱合酶(nos)基因的3’非编码区得到的编码3’端终止子的核酸分子。
可以构建其它适合用于本发明的质粒。例如，与大麦的HVA1基因不同LEA基因可在用限制性酶去掉HVA1基因之后连接到质粒pBY520中。可以用其它启动子替代pBY520中的启动子肌动蛋白I基因。作为选择，其它通常含有适合启动子调控下的LEA基因及合适的筛选标记的质粒，可运用本领域熟知的技术轻易得以构建。
鉴定质粒之后，一种用编码LEA蛋白基因转化谷类植物细胞的方法是将植物细胞与经过含编码LEA蛋白基因的质粒转化的细菌接种物共接触。通常，此方法包括将植物细胞和转化的细菌悬浮液在一起接种并在不含抗生素的再生培养基上于25-28℃将细胞培养48到72小时。
可用土壤农杆菌属的细菌转化植物细胞。适合的种类包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。根癌农杆菌(如菌株LBA4404或EHA105)因其功能已知尤其适用于转化植物。
按此发明方法接种谷类植物细胞与农杆菌时，所述菌必须经含有编码LEA蛋白基因的载体转化。
适合掺入农杆菌中并具有编码LEA蛋白基因的质粒，含有在大肠杆菌中进行复制的复制原点，即在根癌农杆菌中进行复制的复制原点；将基因转入植物的T-DNA右边界序列，以及对转化的植物细胞进行筛选的标记基因。特别优选载体pBI121，它含有低拷贝RK2复制原点，新霉素磷酸转移酶(nptII)标记基因以及胭脂碱合成酶(NOS)启动子和一个NOS 3’加多聚腺苷酸化信号。T-DNA质粒载体pBI121得自于Clonetech Laboratories，Inc.，4030 Fabian Way，Palo Alto，California94303。编码LEA蛋白的一个基因***载体取代了β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。
一般而言用质粒转化农杆菌(Agrobacterium spp.)可通过化学和热处理后直接吸取质粒DNA如Holsters等(1978)所述；通过电穿孔法直接吸取质粒DNA，如S.Wen-jun和B.Forde(1989)所述；通过如Ditta等(1981)所述由链霉素抗性(Trat)辅助菌株介导通过三亲交配将大肠杆菌中的质粒转入农杆菌；或如Simon等(1982)所述通过直接接合由大肠杆菌转入农杆菌。
将含有编码LEA蛋白核酸的质粒转入植物细胞的另一种方法是通过转化植物细胞核，如用粒子轰击法。像本申请中所运用，对于宿主细胞的粒子轰击(又称为生物发射转化)可由几种途径之一来完成。第一种包括推动惰性或生物活性的细胞粒子。这种技术在Sanforal等人的美国专利4,945,050号，5,036,006号，和5,100,792号中被公开，在此引作参考。通常，这个过程包括在可有效穿透细胞外表面并可掺入细胞内部的条件下推动惰性或生物活性的细胞粒子。当使用惰性粒子时，可将含异源DNA的质粒包裹在粒子上使质粒导入细胞。或者，使质粒包围靶细胞这样一旦粒子被激活便可将质粒载入细胞。也可推动生物活性的粒子(如含有质粒和异源DNA的细菌干细胞)进入植物细胞。
将质粒导入植物细胞的另外的方法是转化植物细胞原生质体(稳定的或瞬间的)。植物原生质体仅包有一层原生质膜因而可吸收像异源DNA样的大分子。这些工程化原生质体能够再生完整植株。将异源DNA导入植物细胞原生质体的合适方法包括电穿孔法和聚乙二醇(PEG)转化法。如本申请中所使用，电穿孔法通常是一种将高浓度质粒DNA(含有异源DNA)加到宿主细胞原生质体悬浮液中，用200到600伏/厘米的电场轰击其混合液的方法。电穿孔之后，使转化细胞生长于含筛选剂的适合培养基中而得到鉴定。
如本申请所用，转化包括质粒整合进植物染色体的稳定转化。
在以下实施例中，用生物发射转化法对水稻进行转化。也用其它一些转化方法成功转化水稻，包括原生质体法(综述，见Cao等，1992)，和农杆菌法(Hiei等，1994)。也成功用生物发射转化转化玉米(综述，见Mackey等，1993)和小麦(见Vasil等的美国专利5,405,765号)。
谷类植物细胞或原生质体一旦按此发明进行转化，可以再生为转基因谷类植株。通常，再生是通过将转化细胞置于含有合适生长调节剂和营养物的培养基上进行培养以促使茎干分生组织启动生长来完成。再生培养基中加入合适的抗生素以抑制农杆菌或其它污染物的生长并对转化细胞或原生质体的生长进行筛选。茎开始生长后，组培使之继续生长并筛查标记基因活性。
在适合的转化方法中，谷类植物细胞的转化可在离体或者活体进行，即谷类细胞可定位于谷类植物上。
本发明还提供用此发明方法产生的转基因谷类植株及转基因谷类植物产生的种子。
本发明进一步提供经编码晚期胚胎发生丰富蛋白核酸转化的谷类植物细胞或原生质体或转基因谷类植株，由此谷类植物细胞或原生质体再生成的转基因谷类植株中还形成了抗旱或抗盐性。如前讨论，可利用各种谷类植物和LEA基因。
优选编码LEA蛋白的核酸由一个强启动子所调控以促进LEA蛋白最大程度表达，或有一个胁迫诱导启动子以促使在胁迫条件下启动子能够相当地得到诱导。在一项实施例中，通过提供编码LEA基因和启动子DNA的质粒，转基因谷类植物细胞或原生质体或植株用编码启动子的核酸，如水稻肌动蛋白1基因启动子的核酸，进行转化。
转基因谷类植物细胞或原生质体或植株亦可用编码筛选标记如bar基因的核酸进行转化，用以检测转化子，并用编码花椰菜花叶病毒的35s启动子来调控bar基因的表达。其它筛选标记包括编码EPSPS，nptII，或ALS的基因。其它启动子包括那些来自编码肌动蛋白1，泛肽和PINII的基因。也可由编码LEA基因及其启动子的质粒来提供这些额外的核酸序列。若合适，也可通过以多个质粒进行转化来提供各种核酸。
本发明还涉及从转基因谷类植物细胞或原生质体得到的再生的转基因植株，以及从转基因植株产生的种子。本发明也提供种子，它一旦萌发，可生成转基因谷类植株。
由于此处所指的核苷酸序列编码一个LEA蛋白，因此对它与以前已知序列LEA蛋白的核苷酸一致性不作要求。本领域的技术人员可明显看出，可能有许多沉默突变(即经特殊密码子编码的氨基酸不改变)的核苷酸作为替代。也可能由使特殊密码子编码的氨基酸改变的核苷酸来替代，这里被替代的氨基酸是指保守序列替代(即保守“同源”氨基酸)。在对所编码LEA蛋白的特性，二级结构，和疏/亲水性仅有微小影响的LEA蛋白核苷酸和/或氨基酸序列中，也可以允许有少许核苷酸和/或氨基酸的增加，缺失，和/或替换。据此发明编码LEA蛋白的核酸中也包括这些变异体。
包括在此发明中的还有用此发明中编码LEA蛋白的核酸片段进行转化的转基因谷类植株。可在适当的限制性位点构建能对谷类植物形成水或盐抗性的适宜片段。片段是指较LEA编码全长分子短的一段连续部分。
可将非必需核苷酸置于片段(或LEA分子全长)5’和/或3’端而不会影响片段或分子的功能特征(即对于提高水或盐抗性)。例如，可将编码蛋白的核苷酸连接到蛋白N一末端(举例)的可进行共翻译或翻译后引导蛋白转移的信号(或引导)序列上。也可以改变核苷酸序列以使被编码的蛋白能够连接到一个易于蛋白合成，纯化，或鉴别的接头或其它序列上。
材料和方法
水稻转化质粒ActI-HVA1的构建
从cDNA克隆pHVA1中分离包含生长HVA1 cDNA的1.0-kbEcoRI片段(Hong等，1988)，此片段用Klenow DNA聚合酶切成钝端并亚克隆至来自于质粒表达载体pBY 505的SmaI位点，pBY 505为pBluescript II KS(+)(Stratagene，CA)的衍生物，产生pBY 520。在pBY520上，HVA1结构基因由水稻肌动蛋白1基因(Act1)的启动子调控(McElroy等，1990；Zhang等，1991)并位于Act1启动子和番茄蛋白抑制剂II基因(Pin2)的3’区域之间(Thornburg等，1987)。质粒pBY 520还含有细菌草丁膦乙酰转移酶(PAT)的结构基因(通常所知的bar基因)(White等，1990)，在水稻转化中它通过对以磷酸转移酶为基础的杀虫剂形成抗性而被作为筛选标记。所述bar基因由花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子调控并随后有胭脂碱合成酶基因(nos)的终止信号。质粒pBY 520已经以69930号登记保藏于ATCC。转基因水稻植株的产生
愈伤组织由水稻(Oryza satiVa L c.v.Nipponbare；得自InternationalRice Research Institute，Los Banos，Philippines)的未成熟胚诱导而成，悬浮培养建立自在液体培养基中亚培养三个月后挑选的胚性再生愈伤组织。将好的悬浮培养细胞用作转化材料并如Cao等(1992)所述用包裹有pBY 520质粒的钨粒进行轰击。在含6mg/升glufosinate铵(CrescentChemical Co.，Hauppauge，NY)作为筛选剂的选择性培养基上筛选抗性愈伤组织5-7周。将抗性愈伤组织转移到含3mg/L ammoniumglufosinate的MS(Murashige和Skoog，1962)再生培养基上再生为植株。认为从相同抗性愈伤组织再生的植株是同系的克隆。将再生植株转移至土壤并在温室生长(白天32℃/晚上22℃，并补加10小时光照周期)。
转基因水稻植株的抗杀虫剂测试
首先通过植株对杀虫剂的抗性表现再生水稻植株中的转化基因存在。在杀虫剂抗性试验中，将含0.5％(V/V)商品杀虫剂BASTATM(含有162g/L glufosinate ammonium，Hoechst-Roussel Agri-Vet Company，Somerville，NJ)和0.1％(V/V)Tween-20的水溶液涂在叶片的两侧。一周后，记录对抗性/敏感表现型。经处理的非转化(NT)植株损伤严重或死亡，而经处理的转化植株的叶片未受影响或仅在试验部位有轻度损伤。
转基因水稻植株的DNA印迹杂交分析
用以HVA1编码区作为探针的DNA印迹杂交分析证实转化基因(包括HVA1)在第一代(R0)转基因水稻植株基因组中的整合。按Zhao等(1989)所述方法进行分离基因组DNA。在DNA印迹杂交分析中，用限制性内切酶Hind III，或EcoRI和Bam HI共同对每个样品的10到15μg DNA进行消化，在1.0％琼脂糖凝胶上分离，转至尼龙膜上，与如图1所示与经32P标记的HVA1探针进行杂交。质粒上有单一HindIII位点，因此用Hind III消化基因组DNA释放出含有HVA1序列的融合片段以及水稻基因组序列。用EcoRI和BamHI消化释放出含有HVA1 cDNA的1.0kb片段。
转基因水稻植株中HVA1蛋白产生的免疫印迹分析
在液氮中研磨植物组织并在含有50mM磷酸钠(pH7.0)，10mMEDTA，0.1％(V/V)Triton X-100，0.1％(W/V)Sarkosyl，10mM β-巯基乙醇，和25mg/ml苯甲基磺酰氟的抽提液中进行匀浆制备蛋白提取物。将成熟种子切成两半，将含有胚的那一半种子直接研磨成粉末并在相同抽提液中匀浆化。所述匀浆在室温5,000xg离心5分钟。上清液进一步于4℃ 12,000xg离心15min纯化。据Bradford法(1976)用BioRad，(Hercules，CA)染色浓缩物测定蛋白浓度。在SDS-PAGE微凝胶上分离蛋白，用Mini Trans-Blot Cell(BioRad)电转移至PVDF膜上，在含0.05％(V/V)Triton X-100的TBS中用3％(W/V)BSA封闭，与兔抗-HVA1抗体共培育，之后与山羊抗-兔IgG碱性磷酸酶偶联剂(BioRad)共培育。二抗用BioRad公司提供的碱性磷酸酶免疫试剂盒中的4-氮蓝四唑氯化物(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯(BCIP)进行检测。印迹滤膜上的免疫反应信号用光密度计(Helena Laboratoried，Beaumont，TX)进行扫描以定量测定HVA1蛋白的相对含量。用部分纯化的HVA1蛋白作估算转基因水稻组织中HVA1蛋白水平的标准。
干旱和盐胁迫条件下转基因植物生长行为的分析
用第二代(R1)转化植株对干旱和盐胁迫条件下植株的生长行为进行评价。这些R1植株代表包括同源和异源转基因植株以及分离的非转化植株在内的群体。可将野生型水稻植株或者经转化程序得到的非转化植株(NT)作为对照材料。在本说明书中它们均特指非转化的对照植株。
培养基中的种子萌发和幼苗生长
将30粒分别来自三个转基因水稻系和两个非转化对照植株的R1种子经表面消毒后在25℃黑暗条件下置于三种琼脂培养基上进行萌发：MS，MS+100mM NaCl，和MS+200mM甘露醇。MS培养基仅含矿质盐，使种子在MS+100mM NaCl或MS+200mM甘露醇培养基上萌发5天随后转至MS培养基。为测试幼苗对胁迫条件的反应，使种子在MS培养基上萌发5天。然后将5天龄的幼苗分开，转至深平皿中的双层Whatman纸上并分别加入液体MS，MS+100mMNaCl，和MS+200mM甘露醇。幼苗置25℃光照生长并监控它们对胁迫条件的反应5天。
土壤中植株生长和胁迫处理
用补充有肥料的精细并灭菌的田间土壤来使水稻植株在温室中生长(白天32℃/夜间22℃，补充光照周期10小时)。常规用这样的生长条件支持多种水稻变种的正常生长。使种子在MS培养基萌发7天，接着将7天龄幼苗转至底部开洞的小盆土壤中(8cm×8cm，每盆一株)。小盆置于盛水的扁平托盘中。幼苗接受胁迫处理前要再生长两周。在此阶段，多数3周龄的幼苗长有三片叶子，一些幼苗正长出第四片叶。用来自相同R0转基因系的不同套R1植株进行了两次胁迫试验。在每次试验中，每次处理采用10株转基因植株和至少10株非转化对照植株。
(i)无胁迫：不断从托盘给植物供水。当测量胁迫处理的植株时也测量未处理植株。在此条件下，整个试验期间转基因植株和非转化对照植株均生长良好且未显示显著差异。
(ii)水胁迫：为开始干旱胁迫，从托盘撤走水。土壤中逐渐而迅速减少的水含量造成一种干旱状态。经过5天干旱胁迫，向植物提供2天水以便萎蔫植株恢复。接着，进行第二轮水胁迫。
(iii)盐胁迫：将小盆转至盛有200mM NaCl溶液的托盘中10天以造成短期严重的盐胁迫。接着，将小盆重又转回含水龙头托盘10天以使植株恢复。最初两天通过从小盆顶端浇水并多次更换托盘中的水使盐浓度迅速降低。恢复10天之后开始进行供给植物50mM NaCl溶液30天的第二轮盐胁迫。
生长行为的数据收集和统计学分析
在开始胁迫处理之前，对每株非转化对照植株和转基因植株的起始高度，叶片数目和长度进行测量。在胁迫处理期间和之后，对每株也进行测量。为进行统计分析，每项处理中计算10株被测植株的平均值用以比较转基因植株和非转化对照植株。
                        实施例1
转基因水稻植株的产生和分子分析
质粒pBY520的结构如图1所示。大麦LEA基因的cDNA，HVA1，位于水稻肌动胚1基因(AGI)启动子的下游。细菌草丁膦乙酰转移酶基因(bar)的编码区位于花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子下游。用包裹有pBY520质粒DNA的钨粒进行轰击水稻悬浮细胞，它们由滤纸支持并在固体培养基上预培养。三次转化实验的结果总结于表I。在这些实验中轰击33板悬浮细胞。筛选出200个ammoniumglufosinate抗性愈伤组织并将其转至再生培养基。使63个独立系植株(120株)再生并生长于温室。如表I所示，85％以上转基因植株可育，产生了各种数目的种子。一些转基因系的不育性似与外源基因的存在无关，因为相同比例的不育植株也出现于以不含质粒DNA或以几种其它基因结构进行轰击的悬浮细胞所作的平行试验中。
bar基因编码的草甘膦乙酰转移酶能够解毒以草甘膦为基础的杀虫剂。首先测试29系植株的杀虫剂抗性。当涂有0.5％商业杀虫剂BASTATM时，转基因植株的叶片表现出完全抗性，而非转化植株的叶片变黄并死亡。在测杀虫剂抗性的29系植株中，90％有抗性。用以HVA1 cDNA片段作探针的DNA印迹杂交对相同的29系进一步分析，80％显示预期的杂交带型。
消化转基因水稻植株中质粒pBY520或基因组DNA产生含HVA1编码区的1.0kb片段。在分析的29系中，23系含有预期的1.0kb的杂交带。除预期的1.0-kb杂交带外所有转基因植株的杂交带型独一无二，说明这些转基因系来自独立的转化。DNA印迹杂交的结果与那些杀虫剂抗性测试的结果相一致，因此将在同一质粒上的筛选标记基因和HVA1基因均有效地共聚合进了水稻基因组。采用同时含筛选标记基因和HVA1基因的质粒并配合严密的筛选程序有助于高频率再生转基因植株。
                      实施例2
R0转基因水稻植株中HVA1蛋白的累积分析
在DNA印迹杂交数据的基础上挑选一些第一代再生(R0)转基因系，分析其中HVA1蛋白的累积。从叶片和根组织制备蛋白提取物。用抗纯化的大麦HVA1蛋白的多克隆抗体检测HVA1蛋白。在不同转基因系的叶片组织中，检测到SDS-PAGE凝胶上对应于HVA1蛋白的27KD的单条带。也在根中轻易检测到HVA1蛋白的累积，虽然较之叶片组织水平相对要低。在不同转基因系中根中HVA1蛋白累积的相对水平与叶片组织中的相对应。非转化植株的蛋白提取物未显示27-KD蛋白条带，从转基因植株或从非转化植株的蛋白提取物中也未检测到另外的其它大小的条带。用部分纯化的HVA1蛋白备份作标准，估测累积于不同转基因系叶片和根组织中的HVA1蛋白水平在可溶性总蛋白量的0.3％～2.5％之间(表II)。
为检测成熟转基因水稻种子中，尤其是胚中HVA1蛋白的累积，从含胚的那一半种子制备蛋白提取物并用免疫印迹法分析。在成熟转基因种子的蛋白提纯物中未检测到相应于HVA1蛋白的27-KD条带。但是，分别检测到两条低分子量条带，20KD和13KD。因为早在先前的研究中从成熟水稻种子中检测到一个与大麦HVA1基因高度同源的高水平mRNA转录物(Hong等，1992)，这两种蛋白可能代表在种子晚期发育阶段累积的内源水稻LEA或似-LEA蛋白。在成熟水稻种子中由于缺乏HVA1蛋白的累积可能由于种子开始脱水后Act1启动子的活性变低(或缺乏)。
                     实施例3
转基因水稻植株对干旱和盐胁迫抗性增强
以上叙述结果显示由水稻Act1强启动子调控的大麦HVA1基因导致转基因水稻植株营养性组织中HVA1蛋白的高水平累积。大多数首代转基因水稻植株较之通过转化程序得到的非转化植株或野生型植株形态发生正常。如前所述，大多数植株可育。这些结果相加显示HVA1蛋白的累积对于水稻植株的生长和发育未千万不利影响。
为了解HVA1蛋白的高水平累积是否会对胁迫条件下转基因水稻植株的生长行为有任何益处，用第二代植株(R1)对处于水和盐胁迫条件下的生长行为作了评估。用野生型水稻植株的种子或通过转化程序得到的非转化植株的种子作为对照。
渗透和盐胁迫条件下培养基中的种子萌发及幼苗生长
在MS培养基中，转基因和对照株的种子均萌发良好，也未见它们的幼苗生长有差异。在MS+100mM NaCl或MS+200mM甘露醇中，转基因种子和对照种子均缓慢萌发(根和茎的发生延迟2天)，但未观察到转基因和对照种子间有差异。在两种胁迫培养基中5天后，将萌发的种子(有0.2～0.5cm长的茎)转至MS培养基。转基因和对照幼苗均恢复并继续正常生长。但是，在此恢复阶段，转基因幼苗生长较快，一星期后转基因幼苗的茎也较那些对照幼苗的明显要长。转基因幼苗也较对照幼苗多生出1到3条根。当种子在MS培养基萌发并持续生长时未观察到非转化对照株与转基因株有明显差异(表III)。
用在MS培养基中种子萌发的5天龄幼苗测试它们对盐胁迫的反应。转基因和对照幼苗均对盐胁迫非常敏感。在MS+100mM NaCl中，幼苗渐渐在一周内萎蔫。但是，较之对照幼苗转基因幼苗延迟萎蔫。在MS+100mM NaCl中的最初三天，一半以上的对照幼苗变萎蔫，而仅有极少部分转基因幼苗变萎蔫。
水(干旱)胁迫条件下土壤中转基因植株的生长行为
以上实验表明转基因植株和对照植株对胁迫条件处理的反应不同。用在土壤中生长的3周龄植株做广泛的胁迫试验。土壤中持续无胁迫时，在整个试验期间未观察到转基因株和对照株生长行为之间有明显差异。
一旦从托盘撤除水，土壤中逐渐但迅速的水减少造成一个干旱状态。转基因株和对照株对此干旱条件的反应明显不同。处于相同发育阶段的转基因株的叶片较之对照株萎蔫发生晚1到2天。干旱胁迫4到5天后，对照和转基因株的叶片均已萎蔫，但转基因株的萎蔫程度轻得多。转基因和对照株之间对于水馈乏反应的不同也反应在干旱胁迫的头3天中它们幼叶的生长率(叶片长度的增加)。像转基因株一样，干旱胁迫抑制对照株幼叶的生长。但是，转基因株较之对照株维持较高的生长率(表IV)。将干旱胁迫植株重加水后，转基因株较之对照株表现也较好的恢复并继续较快生长。转基因株受到干旱胁迫较少伤害并且看起来更健康，而非转化株(NT)的旧叶片和幼叶顶端表现出恢复不好并逐渐死亡。
表IV中的数据表明受胁迫植株经过四个干旱胁迫5天接着用水恢复2天的循环后平均的株高和根鲜重。总之，转基因株较之对照株在干旱胁迫条件下它们的生长行为显示了明显的优势。生长优势尤其明显地表现在根的生长上。
盐胁迫条件下土壤中转基因植株的生长行为
严重的盐胁迫(200mM NaCl)明显抑制转基因和对照植株的生长，虽然植株不象干旱条件下萎蔫得那样快。但是，在盐胁迫早期(第0天到第5天)转化株较对照株维持高得多的生长率(表IV)。盐胁迫伤害的早期症状，如萎蔫，晒白和叶尖死亡，首先在老叶出现。植株底部的叶片首先萎蔫可死亡。在后期，幼叶发展为坏死症状并从叶尖开始萎蔫和变干。这些症状在转化株中又一次较在对照株中出现和发展得较慢。当大多数对照株底部的两片叶变萎蔫时，大多数转化株底部的第一片叶仅表现轻微萎蔫。转化株幼叶的萎蔫总是较对照株的轻度。撤走盐胁迫时，转化株较非转化对照株表现更好的恢复。表V中数据也表明了开始盐胁迫处理后30天受胁迫植株的平均茎高和根鲜重。转化株再次显示在扩展的胁迫条件下较对照株有明显较好的行为。在持续严重的盐胁迫下，大多数非转化株渐渐死亡，而大多数转化株可存活更长时间。
                      实施例4
R1转基因水稻植株中HVA1蛋白的累积分析
在胁迫试验最后对来自两个R0转基因系的R1植株进行HVA1蛋白累积分析。分析每个R0转基因系中的8株。在每一系中，8株R1中有2株的HVA1蛋白未检出，这要归于转化基因在这些第二代植株中的分离。胁迫处理严重抑制和伤害那些缺乏HVA1蛋白累积的R1植株。这些植株表现为第一阶段盐胁迫后恢复不好并在持续的胁迫条件下渐渐死亡。在表现胁迫抗性的所有存活R1转基因植株中均检测到HVA1蛋白的累积。
虽然已在此详细描述优选的实施例，但是很显然对相关领域的技术人士而言进行各种修饰，添加，取代等并不背离本发明宗旨，因而认为这些是在以下权利要求书中限定的本发明范畴之内。
表I.转化试验总结
  转化试验   轰击细胞枚数   抗性愈伤组织数   再生(植株)系数目     可育系数目(％)
    1     8     107     27(67) 54(86)
    2     15     69     15(27)
    3     10     24     21(26)
    总数     33     200     63(120)
  表II.不同转基因系中HVA1蛋白累积的估测水平
转基因系(R0)     HVA1蛋白累积水平(％可溶蛋白总量)
    叶片     根
    NT     0     0
    3     1.00     ND
    13     0.75     ND
    18     2.50     ND
    19     0.60     0.30
    30     0.50     0.30
    36     1.50     1.00
    38     0.80     0.60
    41     1.00     0.70
    61     0.75     ND
 ND.不定
    表III.渗透胁迫或盐胁迫下培养基中的种子萌发和幼苗生长
  转基因系                           茎长(cm)
    MS     MS+甘露醇       MS+NaCl
    NT     7.5±0.2     4.2±0.2(100)     2.7±0.2(100)
    30     7.3±0.2     5.2±0.2(124)     3.5±0.2(130)
    36     7.4±0.2     6.1±0.2(145)     4.9±0.2(181)
    41     7.7±0.2     5.9±0.2(140)     4.0±0.2(148)
    数据取自种子萌发后12天：5天在胁迫培养基(MS+200mM甘露醇或MS+100mM NaCl)7天在非胁迫培养基(MS)。每次数值±SE表示10株幼苗之平均值。对无胁迫对照，种子萌发并连续12天生长于MS培养基。括号中数字是转基因幼苗的茎长相对于引作100的对照幼苗的百分值。
   表IV.水(干旱)胁迫条件下土壤中转基因水稻植株的生长行为
  转基因系  叶片生长率(％长度增加)a      株高(cm)b     根鲜重(g)b
    NT     69   22±1.4(100)   0.9±0.1(100)
    30     90   29±1.2(132)   1.4±0.1(156)
    36     129   37±1.8(168)   2.1±0.1(233)
    41     113   33±1.8(150)   2.3±0.3(256)
    a两片顶端叶的长度在从托盘撤水前和3天后测量。生长率计算为3天干旱胁迫期间两片叶增长的百分比。b数据收集于开始水胁迫28天后(4个循环的5天干旱胁迫紧接2天用水恢复)。测量植株顶端最长两片叶的平均值作为株高。每次数值±SE代表10株之平均值其中根鲜重是指4株之平均值。括号中数字是转基因株相对于引作100的对照株的百分值。
        表V.盐胁迫条件下土壤中转基因水稻植株的生长行为
  转基因系  叶片生长率(％长度增加)a       株高(cm)b      根鲜重(g)b 植株存活数c
    NT     76   19±1.1(100)     1.2±0.1(100)     0
    30     90     23±0.9(121)     1.9±0.1(158)     6
    36     103   29±0.8(153)       ND     8
    41     115   26±0.8(137)     2.6±0.1(217)     8
    a.在盐胁迫前和施加胁迫条件5天后测量顶端两片叶的长度。生长率计算为5天盐胁迫期间两片叶长度增加的百分数。b.数据收集于开始盐胁迫后30天(在200mM NaCl中10天，加水恢复10天，在50mM NaCl中10天)。测量植株顶端最长两片叶的平均值作为株高。每项数值±SE代表10株之平均值其中根鲜重指4株之平均值。括号中数字是转基因植株相对于引作100的对照株的百分值。ND，未定。c.数据从开始盐胁迫后40天(在200mM NaCl中10天，加水恢复10天，在50mM NaCl中20天)的第二次胁迫试验中收集。采用每个转基因系的10株转基因株和10株非转化对照株。对于NT，10株均死亡。对于转基因系36和41，10株中8株存活。
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Claims (26)

1.用于再生抗水或抗盐胁迫谷类植物的谷类植物细胞或原生质体的产生方法，它包括：用编码第3组晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸转化谷类植物细胞或原生质体。
2.权利要求1的方法，其中所述谷类植物细胞或原生质体源于水稻。
3.权利要求1的方法，其中所述编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸是大麦的HVA1基因。
4.权利要求1的方法，其中所述转化包括：
在有利于粒子穿入细胞内部的条件下向所述谷类植物细胞发射粒子；且
将含有编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸的质粒导入细胞内部。
5.权利要求4的方法，其中所述质粒与粒子相结合，由此将质粒与粒子一起转入细胞或原生质体内部。
6.权利要求4的方法，其中所述质粒被命名为pBY520。
7.权利要求1的方法，它进一步包括将转化的谷类植物细胞或原生质体再生为转基因谷类植物。
8.增强谷类植物对水或盐胁迫条件抗性的方法，所述方法包括提高所述谷类植物中第3组晚期胚胎发生丰富蛋白的水平。
9.经编码第3组晚期胚胎发生丰富蛋白核酸转化的谷类植物细胞或原生质体，其中所述蛋白在由所述谷类植物细胞或原生质体再生的谷类植物上可形成对水或盐胁迫的抗性。
10.权利要求9的谷类植物细胞或原生质体，其中所述谷类植物细胞或原生质体来自水稻。
11.权利要求9的谷类植物细胞或原生质体，其中所述编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸是大麦的HVA1基因。
12.权利要求9的谷类植物细胞或原生质体，其中所述谷类植物细胞或原生质体包括编码启动子的核酸，编码所述晚期胚胎发生丰富蛋白的所述核酸的表达由所述启动子调控。
13.权利要求12的谷类植物细胞或原生质体，其中所述启动子是水稻肌动蛋白1基因启动子。
14.权利要求9的谷类植物细胞或原生质体，其中所述谷类植物细胞或原生质体包括编码筛选标记的核酸。
15.权利要求14的谷类植物细胞或原生质体，其中所述编码筛选标记的核酸是bar基因。
16.权利要求15的谷类植物细胞或原生质体，其中所述谷类植物细胞或原生质体包括编码花椰菜花叶病毒35S启动子的核酸，其中所述bar基因的表达由花椰菜花叶病毒35S启动子调控。
17.从转基因谷类植物生产种子的方法，其包括：
用编码第3组晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸转化谷类植物细胞或原生质体；
再生转化的谷类植物细胞或原生质体以生成转基因谷类植物；
从转基因谷类植物中分离种子。
18.权利要求17的方法，其中谷类植物是水稻。
19.权利要求17的方法，其中所述编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸是大麦的HVA1基因。
20.权利要求17的方法，其中所述转基因谷类植物包括编码启动子的核酸，其中所述编码晚期胚胎发生丰富蛋白的核酸的表达由所述启动子调控。
21.权利要求20的方法，其中所述启动子是水稻肌动蛋白1基因启动子。
22.权利要求17的方法，其中所述转基因谷类植物包括编码筛选标记的核酸。
23.权利要求22的方法，其中所述编码筛选标记的核酸是bar基因。
24.权利要求23的方法，其中所述转基因谷类植物包括编码花椰菜花叶病毒35S启动子的核酸，其中所述bar基因的表达由花椰菜花叶病毒35S启动子调控。
25.生产转基因谷类植物的方法，其包括用质粒转化谷类植物细胞或原生质体，所述质粒包含：
编码第3组晚期胚胎发生丰富蛋白的第一核酸；
编码启动子的第二核酸，所述第二核酸位于第一核酸的5’端并且所述第二核酸调控所述第一核酸的表达；
编码终止信号的第三核酸，所述第三核酸位于所述第一核酸的3’端；
编码筛选标记的第四核酸，所述第四核酸位于所述第三核酸的3’端；
编码启动子的第五核酸，所述第五核酸位于所述第四核酸的5’端和所述第三核酸的3’端，所述第五核酸调控所述第四核酸的表达；以及
编码终止信号的第六核酸，所述第六核酸位于所述第四核酸的3’端。
26.权利要求25的方法，其中所述质粒被命名为pBY520。
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