CN103755790B - 一种磷酸化修饰lea蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,公开了一种磷酸化修饰LEA蛋白及其制备方法和应用。该磷酸化修饰LEA蛋白在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团,其制备方法包括以下步骤:克隆LEA蛋白基因;构建原核表达载体,将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上;将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中,诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白,收集纯化所述LEA蛋白;利用酪蛋白激酶磷酸化修饰所述LEA蛋白。所制得磷酸化修饰LEA蛋白对蛋白类产品的保护作用显著增强,可广泛应用于制备蛋白质类产品的保护剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,尤其涉及一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法及其用于制备蛋白质类产品的保护剂的应用。
背景技术
LEA(lateembryogenesisabundant,胚胎晚期富集)蛋白家族有800多个成员,存在于植物、细菌、酵母、线虫、真菌和摇蚊等200多个生物体中。在植物发育晚期种子中大量积累,与植物的抗逆能力密切相关。LEA家族基因的表达调控不同,有的LEA基因的表达是不受外界因素影响的,而有的LEA基因的表达受干旱、低温、高盐等逆境胁迫的诱导。
根据LEA蛋白的保守序列,可将其分为7组。其中,LEA3蛋白在生物界中的分布最广泛。LEA3蛋白不仅广泛分布在植物细胞内,而且在非植物物种中发现的LEA蛋白多为LEA3类似蛋白,如原核生物、摇蚊。尤其是在几乎可耐受完全干燥环境的脱水休眠生物(Anhydrobiotes,如卤虫、线虫和轮虫等)中均存在LEA3类似蛋白(HandSC,etal,2011;HinchaDK,etal,2012)。大量实验证据表明,LEA3蛋白可对脱水胁迫下的蛋白、植物、脱水休眠生物起到很好的保护效果,并可以用于人肝癌细胞的保存(LiSetal,2012)。此外,与其他组LEA蛋白不同的是,LEA3蛋白的表达受脱落酸(ABA)的诱导。因此,从LEA3蛋白的起源早、高保守性、分布的广泛性分析,LEA3蛋白是一类具有生物抗脱水保护功能的重要LEA蛋白。
现有研究表明,LEA3蛋白序列中存在多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,这些均为可发生磷酸化修饰的氨基酸。然而,目前还不清楚LEA3蛋白是否可被磷酸化修饰及磷酸化修饰后的LEA3蛋白具有哪些功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法及其应用。
本发明所采用的技术方案是提供一种磷酸化修饰LEA蛋白,在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团。
本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法,包括以下步骤:克隆LEA蛋白基因;构建原核表达载体,将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上;将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中,诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白,收集纯化所述LEA蛋白;利用酪蛋白激酶(CaseinKinaseII,CKII)磷酸化修饰所述LEA蛋白。
本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的应用,将所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂。
本发明的有益效果在于:通过基因克隆原核表达LEA蛋白,再利用CKII进行磷酸化制备磷酸化修饰LEA蛋白,生产效率高,成本较低。所制得磷酸化修饰后LEA蛋白对蛋白质类产品的保护作用显著增强,可有效保护酶制剂的活性。磷酸化修饰LEA蛋白可广泛应用于制备蛋白质类产品的保护剂,利于产品的稳定及保存。
附图说明
图1是本发明实施例1大豆PM18B双向电泳图谱;
图2是本发明实施例PM18B基因PCR产物电泳图;
图3是PM18基因与本文克隆的PM18B基因的碱基序列比对图,其中,
NCBIPM18为NCBI公布的大豆PM18碱基序列;PM18B为本发明中克隆
的PM18B基因;
图4是BL21-pET-28a-PM18B菌液PCR鉴定电泳图;
图5是PM18B蛋白SDS-PAGE电泳图;
图6是本发明实施例1大豆PM18B蛋白对LDH酶的保护作用
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法,包括以下步骤:克隆LEA蛋白基因;构建原核表达载体:将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上;表达获得所述LEA蛋白:将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中,诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白,收集纯化所述LEA蛋白;利用蛋白激酶CKII磷酸化修饰所述LEA蛋白。
其中,所述LEA蛋白为大豆PM18B基因,所述PM18B基因经过磷酸化修饰后,可明显增强其对酶的保护效果。
本发明中还提供一种磷酸化LEA蛋白,所述磷酸化LEA蛋白为磷酸化PM18B蛋白。
本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的应用,将所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂。
本发明方法生产效率高,成本较低,所制得磷酸化修饰LEA蛋白可应用于制备蛋白质类产品的保护剂,尤其可应用于作为酶制剂的保护剂,可有效保持酶的活性,延长保存期限。以下列举LEA3族的大豆PM18基因为例结合具体参数进一步说明。
实施例1大豆PM18蛋白存在磷酸化修饰
采用Hepes等缓冲液和热处理的方法提取了萌发后,胚根未突破种皮的大豆胚根的热稳定蛋白质,定量后运用双向电泳技术将热稳定蛋白质组进行双向电泳,电泳图谱如图1所示。实验结果表明,PM18共含有5个异构体,它们的分子量一致(Mr=35kDa),而等电点不一致(PI=6.2、6.0、5.8、5.6和5.4)。
运用MALDI-TOF/TOFMS进一步鉴定了PM18蛋白的准分子离子峰的理论值和测量值(m/z[M+H]+),结果显示,PM18Tyr-136的准分子离子峰的理论值和测量值(m/z[M+H]+)(500.3130Da与402.2715Da)之间相差98.04Da,为一个磷酸分子的分子量(98Da)。由此可见,PM18的Tyr-136发生了磷酸化修饰。
实施例2磷酸化修饰LEA蛋白的制备
(1)大豆PM18B基因的克隆
制备培养24小时的大豆种子(白农六号)胚根的总cDNA。以cDNA为模板,PM18AF和PM18AR为引物,PCR扩增得到约970bp的特异片段,与理论值一致,如图2所示。将基因片段与pMD18-T(simple)载体连接,连接产物转化大肠杆菌TOP10。将阳性重组菌测序,结果表明所克隆到得大豆PM18B基因与NCBI上登录的pGmPM18基因(GenBank:AF009953.1)相比,结果如图3所示,在第712bp至第732bp(包括这两个碱基)处缺少21bp,我们暂时将克隆得到的该基因命名为PM18B基因。
引物序列如下所示:
PM18AF:5′-CCGTCATGAGGCATCATCATCATCATCACATGGCGTCAAGACAGCAAT-3’PM18AR:5′-CACGGAATTCTCACATTTTCTCCCTACGA-3′
(2)原核表达载体pET-28a-PM18B-His的构建及鉴定
利用pagⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆有PM18B基因的T载体,回收约1000bp的酶切产物,并与经过NcoⅠ(pagⅠ的同尾酶)和EcoRⅠ双酶切过的pET-28a连接,连接产物转化TOP10。提取菌液PCR鉴定为阳性的重组菌的质粒pET-28a-PM18B,转化大肠杆菌BL21。菌液PCR法鉴定重组菌BL21-PM18B,结果表明前者的PCR产物中有特异的条带,分子量约960bp,与理论值相符。
(3)大肠杆菌原核表达的PM18B蛋白的获得
挑取BL21-PM18B菌株的单克隆进行过夜培养。扩大培养至OD600值约为0.6~0.8,加入终浓度为0.1mM的IPTG,诱导外源蛋白质在大肠杆菌中表达。8h后收集菌体,利用快速蛋白液相色谱***对这两个蛋白进行纯化,得到PM18B蛋白。
(4)大豆PM18B蛋白磷酸化处理
真核生物发生磷酸化修饰的位点为Ser,Thr和Tyr。而原核生物大肠杆菌表达的蛋白质在Ser位点发生磷酸化修饰,Thr和Tyr位点不发生磷酸化修饰。因此,我们利用CKII对原核表达的PM18B蛋白进行磷酸化修饰。取2支EP管,分别加入0.94μlTrisBuffer,0.1μl100mMATP,1μl浓度为100μM的PM18蛋白;然后一管加入0.1μlCKII,一管不加CKII,37℃水浴反应5h,加入26μlPBSbuffer,4℃保存过夜。
实施例3磷酸化修饰对大豆PM18B蛋白保护LDH酶活性的影响
将磷酸化前后的PM18B蛋白与LDH酶(50μg/ml),按照摩尔比(蛋白:LDH酶)为1:1、4:1和8:1的比例配制成40μl的酶溶液。将酶溶液放入液氮速冻1min。然后放置于25℃恒温器中复性5min。反复冻融3次。取5μl酶溶液加入到2ml底物中(10mmol/LKH2PO4-K2HPO4,PH7.5,7.5mmol/L丙酮酸,0.1mmol/LNADH),利用紫外分光光度计测定反应体系在起始2min内A340的减少值。每个反应重复2次。每次2个平行。综合4次实验结果,计算平均值和标准差。根据以下公式计算出残留酶活。LDH酶残留酶活(%)=(待测样品冻融后⊿A340/冻融前⊿A340)×100%。以残留酶活为纵座标,蛋白与LDH酶的质量比为横坐标,绘制出LDH酶的残留酶活柱形图。以溶菌酶作为阴性对照组。
结果如图6所示,当加入溶菌酶即摩尔比为0:1的时候,LDH酶在冻融后残留活性为2.1%;当PM18B蛋白与LDH酶的摩尔比为1:1时,LDH酶冻融后的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为2.6%,磷酸化后为3.9%;在PM18B蛋白与LDH酶的摩尔比为4:1时,LDH酶的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为9.1%,磷酸化后为17.9%,二者达到极显著性差异(P<0.01);当PM18B蛋白与LDH酶摩尔比为8:1时,LDH酶的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为15%,磷酸化后为21.1%,二者达到显著性差异(P<0.05)。
综上所述,磷酸化修饰后LEA蛋白对酶活性的保护作用显著增强,可应用于制备蛋白质类产品的保护剂,尤其是酶制剂存放及稳定的保护剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.磷酸化修饰LEA蛋白的应用,其特征在于,磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂;所述蛋白质类产品为酶制剂;所述磷酸化修饰LEA蛋白在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团;所述LEA蛋白为大豆PM18蛋白。
2.根据权利要求1所述的磷酸化修饰LEA蛋白的应用,其特征在于,所述蛋白质类产品为乳酸脱氢酶制剂。
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