CN103755790B - 一种磷酸化修饰lea蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种磷酸化修饰lea蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种磷酸化修饰LEA蛋白及其制备方法和应用。该磷酸化修饰LEA蛋白在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团，其制备方法包括以下步骤：克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体，将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用酪蛋白激酶磷酸化修饰所述LEA蛋白。所制得磷酸化修饰LEA蛋白对蛋白类产品的保护作用显著增强，可广泛应用于制备蛋白质类产品的保护剂。

Description

一种磷酸化修饰LEA蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法及其用于制备蛋白质类产品的保护剂的应用。
背景技术
LEA（lateembryogenesisabundant，胚胎晚期富集）蛋白家族有800多个成员，存在于植物、细菌、酵母、线虫、真菌和摇蚊等200多个生物体中。在植物发育晚期种子中大量积累，与植物的抗逆能力密切相关。LEA家族基因的表达调控不同，有的LEA基因的表达是不受外界因素影响的，而有的LEA基因的表达受干旱、低温、高盐等逆境胁迫的诱导。
根据LEA蛋白的保守序列，可将其分为7组。其中，LEA3蛋白在生物界中的分布最广泛。LEA3蛋白不仅广泛分布在植物细胞内，而且在非植物物种中发现的LEA蛋白多为LEA3类似蛋白，如原核生物、摇蚊。尤其是在几乎可耐受完全干燥环境的脱水休眠生物（Anhydrobiotes，如卤虫、线虫和轮虫等）中均存在LEA3类似蛋白(HandSC,etal,2011;HinchaDK,etal,2012)。大量实验证据表明，LEA3蛋白可对脱水胁迫下的蛋白、植物、脱水休眠生物起到很好的保护效果，并可以用于人肝癌细胞的保存(LiSetal,2012)。此外，与其他组LEA蛋白不同的是，LEA3蛋白的表达受脱落酸（ABA）的诱导。因此，从LEA3蛋白的起源早、高保守性、分布的广泛性分析，LEA3蛋白是一类具有生物抗脱水保护功能的重要LEA蛋白。
现有研究表明，LEA3蛋白序列中存在多个丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，这些均为可发生磷酸化修饰的氨基酸。然而，目前还不清楚LEA3蛋白是否可被磷酸化修饰及磷酸化修饰后的LEA3蛋白具有哪些功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法及其应用。
本发明所采用的技术方案是提供一种磷酸化修饰LEA蛋白，在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团。
本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，包括以下步骤：克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体，将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用酪蛋白激酶（CaseinKinaseII,CKII）磷酸化修饰所述LEA蛋白。
本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的应用，将所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂。
本发明的有益效果在于：通过基因克隆原核表达LEA蛋白，再利用CKII进行磷酸化制备磷酸化修饰LEA蛋白，生产效率高，成本较低。所制得磷酸化修饰后LEA蛋白对蛋白质类产品的保护作用显著增强，可有效保护酶制剂的活性。磷酸化修饰LEA蛋白可广泛应用于制备蛋白质类产品的保护剂，利于产品的稳定及保存。
附图说明
图1是本发明实施例1大豆PM18B双向电泳图谱；
图2是本发明实施例PM18B基因PCR产物电泳图；
图3是PM18基因与本文克隆的PM18B基因的碱基序列比对图，其中，
NCBIPM18为NCBI公布的大豆PM18碱基序列；PM18B为本发明中克隆
的PM18B基因；
图4是BL21-pET-28a-PM18B菌液PCR鉴定电泳图；
图5是PM18B蛋白SDS-PAGE电泳图；
图6是本发明实施例1大豆PM18B蛋白对LDH酶的保护作用
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种磷酸化修饰LEA蛋白的制备方法，包括以下步骤：克隆LEA蛋白基因；构建原核表达载体：将所述LEA蛋白基因连接到原核表达载体上；表达获得所述LEA蛋白：将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导LEA基因在大肠杆菌中表达合成LEA蛋白，收集纯化所述LEA蛋白；利用蛋白激酶CKII磷酸化修饰所述LEA蛋白。
其中，所述LEA蛋白为大豆PM18B基因，所述PM18B基因经过磷酸化修饰后，可明显增强其对酶的保护效果。
本发明中还提供一种磷酸化LEA蛋白，所述磷酸化LEA蛋白为磷酸化PM18B蛋白。
本发明还提供一种磷酸化修饰LEA蛋白的应用，将所述磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂。
本发明方法生产效率高，成本较低，所制得磷酸化修饰LEA蛋白可应用于制备蛋白质类产品的保护剂，尤其可应用于作为酶制剂的保护剂，可有效保持酶的活性，延长保存期限。以下列举LEA3族的大豆PM18基因为例结合具体参数进一步说明。
实施例1大豆PM18蛋白存在磷酸化修饰
采用Hepes等缓冲液和热处理的方法提取了萌发后，胚根未突破种皮的大豆胚根的热稳定蛋白质，定量后运用双向电泳技术将热稳定蛋白质组进行双向电泳，电泳图谱如图1所示。实验结果表明，PM18共含有5个异构体，它们的分子量一致（Mr=35kDa），而等电点不一致（PI=6.2、6.0、5.8、5.6和5.4）。
运用MALDI-TOF/TOFMS进一步鉴定了PM18蛋白的准分子离子峰的理论值和测量值（m/z[M+H]+），结果显示，PM18Tyr-136的准分子离子峰的理论值和测量值（m/z[M+H]+）（500.3130Da与402.2715Da）之间相差98.04Da，为一个磷酸分子的分子量(98Da)。由此可见，PM18的Tyr-136发生了磷酸化修饰。
实施例2磷酸化修饰LEA蛋白的制备
(1)大豆PM18B基因的克隆
制备培养24小时的大豆种子（白农六号）胚根的总cDNA。以cDNA为模板，PM18AF和PM18AR为引物，PCR扩增得到约970bp的特异片段，与理论值一致，如图2所示。将基因片段与pMD18-T（simple）载体连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10。将阳性重组菌测序，结果表明所克隆到得大豆PM18B基因与NCBI上登录的pGmPM18基因（GenBank:AF009953.1）相比，结果如图3所示，在第712bp至第732bp（包括这两个碱基）处缺少21bp，我们暂时将克隆得到的该基因命名为PM18B基因。
引物序列如下所示：
PM18AF:5′-CCGTCATGAGGCATCATCATCATCATCACATGGCGTCAAGACAGCAAT-3’PM18AR:5′-CACGGAATTCTCACATTTTCTCCCTACGA-3′
(2)原核表达载体pET-28a-PM18B-His的构建及鉴定
利用pagⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆有PM18B基因的T载体，回收约1000bp的酶切产物，并与经过NcoⅠ（pagⅠ的同尾酶）和EcoRⅠ双酶切过的pET-28a连接，连接产物转化TOP10。提取菌液PCR鉴定为阳性的重组菌的质粒pET-28a-PM18B，转化大肠杆菌BL21。菌液PCR法鉴定重组菌BL21-PM18B，结果表明前者的PCR产物中有特异的条带，分子量约960bp，与理论值相符。
(3)大肠杆菌原核表达的PM18B蛋白的获得
挑取BL21-PM18B菌株的单克隆进行过夜培养。扩大培养至OD600值约为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导外源蛋白质在大肠杆菌中表达。8h后收集菌体，利用快速蛋白液相色谱***对这两个蛋白进行纯化，得到PM18B蛋白。
(4)大豆PM18B蛋白磷酸化处理
真核生物发生磷酸化修饰的位点为Ser，Thr和Tyr。而原核生物大肠杆菌表达的蛋白质在Ser位点发生磷酸化修饰，Thr和Tyr位点不发生磷酸化修饰。因此，我们利用CKII对原核表达的PM18B蛋白进行磷酸化修饰。取2支EP管，分别加入0.94μlTrisBuffer，0.1μl100mMATP，1μl浓度为100μM的PM18蛋白；然后一管加入0.1μlCKII，一管不加CKII，37℃水浴反应5h，加入26μlPBSbuffer，4℃保存过夜。
实施例3磷酸化修饰对大豆PM18B蛋白保护LDH酶活性的影响
将磷酸化前后的PM18B蛋白与LDH酶（50μg/ml），按照摩尔比（蛋白：LDH酶）为1:1、4:1和8:1的比例配制成40μl的酶溶液。将酶溶液放入液氮速冻1min。然后放置于25℃恒温器中复性5min。反复冻融3次。取5μl酶溶液加入到2ml底物中（10mmol/LKH2PO4-K2HPO4，PH7.5，7.5mmol/L丙酮酸，0.1mmol/LNADH），利用紫外分光光度计测定反应体系在起始2min内A340的减少值。每个反应重复2次。每次2个平行。综合4次实验结果，计算平均值和标准差。根据以下公式计算出残留酶活。LDH酶残留酶活（%）＝（待测样品冻融后⊿A340/冻融前⊿A340）×100%。以残留酶活为纵座标，蛋白与LDH酶的质量比为横坐标，绘制出LDH酶的残留酶活柱形图。以溶菌酶作为阴性对照组。
结果如图6所示，当加入溶菌酶即摩尔比为0:1的时候，LDH酶在冻融后残留活性为2.1%；当PM18B蛋白与LDH酶的摩尔比为1:1时，LDH酶冻融后的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为2.6%，磷酸化后为3.9%；在PM18B蛋白与LDH酶的摩尔比为4:1时，LDH酶的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为9.1%，磷酸化后为17.9%，二者达到极显著性差异（P<0.01）；当PM18B蛋白与LDH酶摩尔比为8:1时，LDH酶的残留活性在PM18B蛋白磷酸化前为15%，磷酸化后为21.1%，二者达到显著性差异（P<0.05）。
综上所述，磷酸化修饰后LEA蛋白对酶活性的保护作用显著增强，可应用于制备蛋白质类产品的保护剂，尤其是酶制剂存放及稳定的保护剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.磷酸化修饰LEA蛋白的应用，其特征在于，磷酸化修饰LEA蛋白用于制备蛋白质类产品的保护剂；所述蛋白质类产品为酶制剂；所述磷酸化修饰LEA蛋白在Ser、Thr和Tyr位点连接有磷酸基团；所述LEA蛋白为大豆PM18蛋白。
2.根据权利要求1所述的磷酸化修饰LEA蛋白的应用，其特征在于，所述蛋白质类产品为乳酸脱氢酶制剂。
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