CN113615421A - 一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，其包括以下步骤：1)种子萌发及盐处理，盐处理组中加入NaCl浓度为200‑400mM的盐处理液，置于培养箱中开始培养，先暗培养3天，暗培养3天后再转移到光照条件下发芽；2)统计发芽率，每培养一个光照周期后，查看发芽情况，胚根从元麦种子表面表面的胚根鞘中露出来即为发芽，计入发芽种子数，计算发芽率，统计1‑2个光照周期的发芽率，根据发芽率计算相应的盐敏感度；3)根据基于发芽率的盐敏感度判断元麦萌发期的耐盐性。本发明中，胚根从元麦种子表面的胚根鞘中露出来即为发芽，统计发芽率的时间大幅提前并缩短，区分不同材料的耐盐性差异，提高元麦耐盐材料筛选的准确性。

Description

一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法

技术领域

本发明属于农作物育种领域，具体涉及一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法。

背景技术

元麦，即裸大麦，在我国南方地区也称为米麦，上海地区习惯叫元麦，在北方地区一般称为米大麦、仁大麦，而在青藏高原则称为青稞，青稞是藏民的主粮，也是重要的饲料，是粮饲两用的作物。近年来，随着经济的发展，人们在解决了吃得饱的问题后，对于饮食的营养、健康、保健问题越来越关注，而裸大麦在这些方面具有独特的优势。

上海地区拥有悠久的大麦种植历史，长期以来，经过人工、自然选择，形成了多种类型的大麦品种资源，包括元麦品种资源，这些品种资源对当地生态环境具有独特的、长期的适应性，为上海及周边地区的大麦生产、粮饲供给做出了巨大贡献。因此，保护这些元麦资源，并加以利用，不仅对于青藏高原青稞的品种改良，而且对于上海地区开发适合人们食用的高值元麦农产品，都将具有重要的意义。

另外，上海地区人多地少，耕地资源极其宝贵，但是其地处沿海，拥有大片的盐渍化滩涂地，据估计，约有90万亩，并且属于以NaCl为主的滨海盐土，因此，筛选或选育适合盐渍化滩涂地的元麦品种，不仅可以满足人们对于相关农产品的需求，也可以拓展耕地面积，同时解决“种子和耕地”的问题。

众所周知，种子萌发在作物的整个生育期里面处于起始阶段，其在该阶段的耐盐性对于作物的生长发育具有极其重要的地位，研究人员对大麦在种子萌发阶段的耐盐性做了很多研究工作。

发芽阶段是作物生长的重要阶段，种子能否发芽决定着作物群体的规模，而这个阶段对盐胁迫又是比较敏感的。因此，发芽率是大麦耐盐性评价筛选的一个重要指标。然而，尽管很多研究人员都以该指标来评价耐盐性，但所采用的具体标准却不完全相同，有的认为，有胚根有胚芽，并且胚芽长等于种子长度的1/2为发芽；有人认为，有胚根有胚芽，胚芽长超过种子长度的1/3或者胚根长超过种子长度的1/2为发芽；Lai Y等(Integrativetranscriptomic and proteomic analyses of molecular mechanism responding tosalt stress during seed germination in hulless barley.Int J Mol Sci.2020,21(1):359)认为胚根露出种子超过3毫米即为发芽；还有的认为胚根鞘突出即为发芽。

尽管现有技术对发芽的定义不同，但对元麦萌发期耐盐性的筛选时，一般是考虑7天发芽率，时间较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，针对元麦的发育特点，设置合适的盐浓度范围，统计1-2个光照周期的发芽率，根据盐敏感度判断元麦的耐盐性，区分不同材料的耐盐性差异，提高元麦耐盐材料筛选的准确性。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，包括以下步骤：

1)种子萌发及盐处理

挑选饱满无病害、整齐一致的种子烘干，消毒后清洗，将种子分为对照组及盐处理组，对照组中加入清水，盐处理组中加入NaCl浓度为200-400mM的盐处理液，置于培养箱中开始培养，暗培养3天；

暗培养3天后转移到光照条件下发芽，所述光照条件为：一个光照周期内白天16小时，晚上8小时；光照强度：2000-5000lx，温度：白天20-24℃，晚上为16-20℃；

2)统计发芽率

每培养一个光照周期后，查看发芽情况，胚根从元麦种子表面露出来即为发芽，计入发芽种子数，计算发芽率，统计1-2个光照周期的发芽率，根据发芽率计算相应的盐敏感度；

发芽率＝(每皿已发芽种子数/每皿种子总数)×100％；

基于发芽率的盐敏感度＝[(对照发芽率-盐处理发芽率)/对照发芽率]×100％；

3)盐敏感度判断

比较每种盐处理浓度下、不同处理时间下基于发芽率的盐敏感度，当盐敏感度≤20％即为高耐盐材料，20％<盐敏感度≤40％为耐盐材料，40％<盐敏感度≤60％为中耐盐材料，60％<盐敏感度≤80％为不耐盐材料，盐敏感度>80％为极不耐盐材料。

优选地，步骤1)中，设置三个盐处理组，盐处理液分别为：200mM NaCl、300mM NaCl和400mM NaCl。

优选地，步骤1)中，盐处理浓度为200mM NaCl时，统计一个光照周期的发芽率。

又，步骤1)中，盐处理浓度为300mM-400mM NaCl时，统计两个光照周期的发芽率。

优选地，步骤1)中烘干种子时，烘干温度为28-30℃，连续烘干3-7天。

本发明中，利用NaCl盐溶液对元麦开展萌发期耐盐性筛选和鉴定，明确了元麦发芽的定义，以看到胚根从元麦种子表面露出来即为发芽，计算发芽率，利用暗培养之后的1-2个光照周期的盐敏感度进行耐盐性判断，用时4-5天，与传统的7天发芽率相比，可以提前进行判断，节省了鉴定时间，提高了鉴定效率。

在本发明的盐浓度处理下，1-2个光照周期后，即从暗培养开始处理起算，4-5天后，发芽率变异系数都比较大，可对不同材料进行区分，基于元麦的耐盐性，如果以通常采用的7天发芽率作为评价指标的话，如果盐浓度太低，其发芽率和对照相比没有显著差异，很难对不同元麦材料进行区分，另一方面也说明，在相对较低浓度盐胁筛选时，使用7天发芽率是不恰当的。

发明人在实验中发现，在本发明发芽定义下，元麦种子的发芽率变异系数与盐处理浓度及萌发天数密切相关，比如，在200mM NaCl处理下，四天发芽率变异系数非常大，达到了57.66％；在300mM NaCl处理下，四天和五天发芽率变异系数都比较大，四天发芽率变异系数为104.1％、五天发芽变异系数为16.84％；而在400mM NaCl处理下，五天、六天和七天发芽率变异系数都比较大。这说明提前统计发芽率，不仅可以对不同元麦品种耐盐性进行有效区分，而且使得基于发芽率的耐盐性评价试验的盐浓度选择更宽了，并且缩短了筛选时间。综合盐敏感度的判定情况，本发明设定200mM NaCl处理的四天发芽率、300mM-400NaCl处理的五天发芽率用于元麦萌发期耐盐性评价都较适合，而且，从总体上来看，筛选评价结果也比较类似。

植物应对Na离子胁迫的分子机理中，主要包括Na离子的区隔化和外排，Na离子的区隔化可能是元麦耐盐性的主要调控分子机理，在NaCl处理下，元麦幼苗里的Na离子含量显著上升，元麦幼苗Na离子含量和干重指标呈显著正相关，若NaCl处理浓度继续提高，尽管幼苗里的Na离子含量提高的幅度并不大，但是其绝对含量已经非常高了，幼苗的生长可能会受到显著抑制。

作物的耐盐性是非常复杂的性状，有些元麦不同阶段的耐盐性不同，但又存在联系，有些元麦在不同盐胁迫反应有差异，因此，在耐盐性元麦育种的时候，可以根据需要来选择不同的耐盐元麦种质资源，并不是仅仅选择在所有阶段都耐盐的材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用利用NaCl开展元麦萌发期耐盐性筛选和鉴定，探索了在元麦种子萌发期，基于发芽率的耐盐性关联，设置合适的盐处理浓度及统计开始时间，使元麦耐盐材料的筛选时间提前，获得适用的耐盐元麦种质资源，节省了鉴定时间，提高鉴定效率。

附图说明

图1-2为本发明实施例中的发芽示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所用的6份元麦材料取自上海市农业生物基因中心，分别为本地元麦、本地光元麦、四柱头元麦1、慈姑白元麦和上海三月黄3。

实施例一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法

1.种子萌发和盐处理

挑选饱满无病害、整齐一致的种子置于准备好的小尼龙袋，并用铅笔写好标牌名称系挂在小尼龙袋中，扎紧小尼龙袋的袋口，然后放入电热恒温鼓风干燥箱(型号为DHG-9240A，中国)，30℃连续烘3天，烘干后的种子用1％的次氯酸钠消毒20分钟，然后倒去次氯酸钠溶液，用纯水反复清洗3次，每次清洗5分钟。

设置加入清水的空白对照组和加入不同浓度(100mM、200mM、300mM、400mM)的氯化钠溶液的盐处理实验组。在直径9cm的培养皿中放上两层滤纸，标注材料名称、氯化钠溶液浓度和试验开始日期，向相应的实验组加入5毫升清水或氯化钠溶液，分类摆好。用镊子将消毒好的种子放置于对应的培养皿中，每个培养皿中放入30粒种子，每个品种每个处理各3次重复。

将装有种子的培养皿用封口膜封好，并置于培养箱开始培养，先在4℃暗处理3天，然后转移到光照条件下发芽，其中，所述光照条件为，一个光照周期内白天16小时，晚上8小时，光照强度5000lx，温度为白天22℃，晚上为18℃。

每培养一个光照周期后，查看发芽情况，胚根从元麦种子表面的胚根鞘中露出来即为发芽(参见图1-2)，计入发芽种子数，计算发芽率，统计1-2个光照周期的发芽率，即开始培养后第4天和第5天的发芽率，根据发芽率计算相应的盐敏感度。

2.统计发芽率及计算

相关指标根据BewleyJ.D.(Seed Germination and Dormancy.The plant cell，1997，9(7)：1055–1066)对于谷类种子发芽的定义，当胚根从种子表面露出即为完成发芽，实验中当看到胚根从元麦种子表面露出来即为发芽，并计入发芽种子数，并计算发芽率及盐敏感指标。

本实施例中，暗培养的3天未统计到有发芽的种子，因此，发芽率及盐敏感度指标都是从培养开始后的第4天开始的。

发芽率＝(每皿已发芽种子数/每皿种子总数)×100％；

基于发芽率的盐敏感度＝[(对照发芽率-盐处理发芽率)/对照发芽率]×100％。

根据公式，盐敏感度越大，耐盐性越弱，反之，则耐盐性越强。

3.数据整理和分析

使用Microsoft Excel 2010进行数据整理和计算，使用IBM SPSS Statistics 26进行方差分析(采用双因素方法分析法)、均值比较(采用LSD法)和相关性分析(采用Pearson相关系数)。

3.1不同盐胁迫对元麦发芽率的影响

在对照组正常萌发条件下，除了本地光元麦四天发芽率为85.55％外，其余品种所有发芽率都在94.00％以上，说明种子保存的都较好，发芽也都正常(见表1)。

表1.不同盐胁迫处理下不同元麦品种发芽率的均值比较和变异系数

注：“均值±标准差”后面不同字母仅代表每个发芽率性状在不同盐胁迫处理下差异显著。

从表1中可以看出，盐胁迫对元麦种子的发芽有抑制作用，并且这种抑制不仅取决于盐胁迫的浓度，也取决于发芽率的统计时间。

在100mM NaCl胁迫下，除了四柱头元麦1的四天发芽率和慈姑白元麦的五天发芽率外，其余品种及天数的发芽率指标都没有显著的降低，区分度低；而200mM NaCl胁迫下，四天发芽率区分度明显，同时也说明元麦在发芽阶段的耐盐性较强。

而当盐胁迫浓度达到300mM NaCl时，除了本地光元麦的六与七天发芽率、四柱头元麦1的七天发芽率、四柱头本元麦和上海三月黄3的五、六、七天发芽率没有受到明显抑制外，其余发芽率指标都显著降低了；而当盐胁迫浓度达到400mM NaCl时，除慈姑白元麦的七天发芽率和上海三月黄3的六与七天发芽率没有受到显著抑制外，其余发芽率指标都显著降低了，说明300mM及以上NaCl处理时，元麦品种发芽率开始受到显著抑制了，并且不同品种的反应也明显有区别，用该条件进行耐盐性筛选时区分度明显。

另外，从表1变异系数中看，也得到进一步印证，100mM NaCl处理时，所有发芽率指标变异系数都非常小；200mM NaCl处理时，四天发芽率变异系数最大，达到57.66％，而其余都非常小；300mM NaCl处理时，四、五天发芽率变异系数比较大，分别为104.10％和16.84％，而其余则比较小；400mM NaCl处理时，变异系数大小按以下顺序排列，即五天发芽率>六天发芽率>七天发芽率>四天发芽率，分别为83.32％、59.83％、18.31％和0。

不同盐胁迫处理下不同元麦品种的发芽率情况见表2。

表2不同盐胁迫处理下不同元麦品种发芽率指标的方差分析

从表2的方差分析可以看出，不同盐胁迫处理间所有发芽率指标都存在极显著差异(P<0.01)，不同品种间所有发芽率指标也都存在极显著差异(P<0.01)，并且不同盐胁迫处理间和不同品种间所有发芽率指标还都存在极显著差异(P<0.01)。这说明本实施例选择的元麦品种和盐胁迫浓度是合理、有效的，并且可以区分出不同耐盐性的元麦品种。

3.2不同盐胁迫下发芽率间的相关性关系

元麦发芽率指标间的相关性分析参见表3。

表3.不同盐胁迫处理下发芽率指标间的相关性

注：“ND”代表没有数据；“**”代表相关性极显著。

可见，在正常情况下，所有发芽率指标间都呈极显著正相关关系；用100mM NaCl处理时，尽管所有发芽率指标间都呈正相关，但只有四、五、六天发芽率间呈极显著正相关关系，七天发芽率仅与六天发芽率间呈极显著正相关关系；200mM NaCl处理时，则比较复杂，仅六天发芽率和七天发芽率间呈极显著正相关关系，四天发芽率和五天发芽率间呈正相关关系，而和六、七天发芽率呈负相关关系，五天发芽率和六、七天发芽率间呈正相关关系；300mM NaCl处理时和200mM NaCl处理时类似，只不过四天发芽率和五天发芽率间呈显著正相关关系；400mM NaCl处理时，除了四天发芽率外，其余发芽率指标间都呈极显著正相关。

3.3基于发芽率的盐敏感度

基于发芽率的盐敏感度及耐盐性排序情况参见表4。

表4.基于发芽率的盐敏感度及耐盐性排序

注：400mM NaCl处理下，每个品种的四天发芽率都为0，因此不做耐盐性排序。

从表4中可以看出，100mM NaCl处理下，所有品种的所有发芽率指标盐敏感度都比较低；200mM NaCl处理下，根据四天发芽率的盐敏感度进行耐盐性排序，前三位的分别为上海三月黄3、本地光元麦和慈姑白元麦，而其余发芽率的盐敏感度都比较低；300mM NaCl处理下，根据四天发芽率的耐盐性前三位和200mM NaCl处理一样，根据五天发芽率的耐盐性前三位的分别为上海三月黄3、四柱头本元麦和慈姑白元麦，而本地元麦和慈姑白元麦盐敏感度相差不大，根据六天发芽率的耐盐性前三位的分别为四柱头本元麦、上海三月黄3和本地光元麦，根据七天发芽率的耐盐性前三位的分别为四柱头本元麦、本地光元麦和上海三月黄3；400mM NaCl处理下，根据五天发芽率的耐盐性前三位的分别为慈姑白元麦、上海三月黄3和本地光元麦，根据六天发芽率的耐盐性前三位的分别为上海三月黄3、四柱头本元麦和慈姑白元麦，根据七天发芽率的耐盐性前三位的和六天发芽率的一样。

综上所述，上海三月黄3在所有盐胁迫浓度下，根据所有发芽率的盐敏感度排序，其耐盐性都在前3，而且大部分都是排在第1，说明该材料在发芽期的耐盐性非常突出。

Claims (5)

1.一种元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，包括以下步骤：

1)种子萌发及盐处理

挑选饱满无病害、整齐一致的种子烘干，消毒后清洗，将种子分为对照组及至少两个盐处理组，对照组中加入清水，盐处理组中加入浓度为200-400mM NaCl的盐处理液，置于培养箱中开始培养，先暗培养3天；

暗培养3天后再转移到光照条件下发芽，所述光照条件为：一个光照周期内白天16小时，晚上8小时；光照强度：2000-5000lx，温度：白天20-24℃，晚上为16-20℃；

2)统计发芽率

每培养一个光照周期后，查看发芽情况，胚根从元麦种子表面露出来即为发芽，计入发芽种子数，计算发芽率，统计1-2个光照周期的发芽率，根据发芽率计算相应的盐敏感度；

发芽率＝(每皿已发芽种子数/每皿种子总数)×100％；

基于发芽率的盐敏感度＝[(对照发芽率-盐处理发芽率)/对照发芽率]×100％；

3)盐敏感度判断

比较在相应的盐处理浓度下、不同处理时间下基于发芽率的盐敏感度，当盐敏感度≤20％即为高耐盐材料，20％<盐敏感度≤40％为耐盐材料，40％<盐敏感度≤60％为中耐盐材料，60％<盐敏感度≤80％为不耐盐材料，盐敏感度>80％为极不耐盐材料。

2.根据权利要求1所述元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，设置三个盐处理组，盐处理液分别为：200mM NaCl、300mM NaCl和400mM NaCl。

3.根据权利要求1所述元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，盐处理浓度为200mM NaCl时，统计一个光照周期的发芽率。

4.根据权利要求1所述元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，盐处理浓度为300mM-400mM NaCl时，统计两个光照周期的发芽率。

5.根据权利要求1所述元麦萌发期耐盐材料的筛选方法，其特征在于，步骤1)中烘干种子时，烘干温度为28-30℃，连续烘干3-7天。

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