CN1469705A - 通过过表达液泡膜焦磷酸酶来增强分生活力和感受态 - Google Patents

Abstract

具有增强的分生活性和感受态的转基因植物，其具有更大的叶片、茎、花、果实和根结构，包括引起液泡焦磷酸酶上调控表达的多核苷酸序列。

Description

通过过表达液泡膜焦磷酸酶来增强分生活力和感受态

相关申请

在有关国家法律(与本PCT申请有关)下，在可能的范围内，本申请受益于：1999年11月10日提交的Roberto Gaxiola的美国临时申请第60/164,808号，题目是“在植物中的质子转运蛋白和应用”(“Proton Transporters and Uses in Plants”)；2000年8月22日提交的Roberto Gaxiola的美国专利申请第09/644,039号，题目是“在植物中的质子转运蛋白和应用”(“ProtonTransporters and Uses in Plants”)；2000年8月18日提交的Roberto Gaxiola的美国临时申请第60/226223号，题目是“耐干旱/冻害转基因植物”(“Drought/Freeze Resistant TransgenicPlants”)；以及2000年11月10日提交的PCT申请第PCT/US00/30955号，题目是“能够在盐碱化土壤中生长的耐应激的特大型转基因植物”(“Stress-Resistant Oversized TransgenicPlant Capable of Growing in Salinized Soil”)，每个申请教导的内容，在适当外国法允许的范围内结合于此作为参考。政府支持

本申请描述的发明，整体或部分地，获得下述支持：来自国家健康研究院的资助GM52414、DK54214、DK43495、DK51509、DK34854和GM35010；来自国家科学基金的资助MCB9317175。政府对本发明有一定权利。与本发明相关的背景技术

1.本发明所属技术领域

本发明涉及基因改造的植物，相对于环境应激这些植物较强壮，如干旱和/或冻害；相对于营养器官和/或生殖器官的结构这些植物过大(与它们正常表型的对应物相比)；并且这些植物可以在高盐环境中生长。这类植物还表现出较高的分生活性和增加的细胞***活性。

2.与本发明相关的背景技术

当我们进入新千年的时候，人类获取食物的前景非常严峻。由于世界人口的日益增长，增加农作物产量依然是农业研究的一个主要目标。园艺学研究的一个主要目标也是培育更加健壮的非农作物植物，如观赏植物、花草、灌木、以及其它对人类有用或使人愉悦的植物。

迄今为止，农作物和园艺植物的改良依赖于选择性育种具有所希望性状的植物。然而这些选择性育种技术往往不尽如人意，因为许多植物携带杂合性遗传物质，不能完全具有同它们的亲代相同的令人满意的性状。

分子生物学的进展使得人类能够对动、植物的生殖质进行操作。植物基因工程需要分离和处理遗传物质(一般是以DNA或RNA的形式)，继而将该遗传物质导入植物。运用这类技术已经致使多种优良性状植物的产生，如耐害虫力增强的植物、可以表达药物性或其它化学成分的植物、以及其它表达有益品质的植物。这类植物的优点是不仅含有目的基因，而且是可育的。

近期培育具有高抗逆性的植物是植物科学的一个令人感兴趣的领域。总的来说，植物具有并保持适应机制，从而保证它们在不利的环境条件中生存。冻害和干旱是植物常常遇到的两类应激，这两种情况都与细胞脱水相关。已知某些植物具有某些基因，这些基因在处于寒冷或长时间的缺水情况下开启，其编码产物直接或间接相应用来提供与这类植物较其数目众多的同类更强的对干旱和/或寒冷的耐受性。很多与高温和水应激相关的基因已经被确定(参见，如：美国专利第5,837,545、5,071,962、4,707,359号)。很多人相信这些基因产生某些蛋白，例如“水应激蛋白”，这些蛋白被认为有助于植物生存。例如某些曝露于应激条件的植物产生一种称为脱落酸(ABA)的激素，它帮助植物关闭其子座，从而减轻应激的严酷性。然而不幸的是，已知脱落酸可以抑制新叶的生成，导致花和果实的脱落，因而导致减产。

据认为大多数热带植物没有进化出耐受长期干旱和/或寒冷的能力；相反，已知很多温带植物已至少进化出了耐受这类情况的某些能力。在干燥条件下和在冻害后，植物变体的产量会有很大的差异。例如烟草(Nicotiana spp.)产生的嫩叶对干旱非常敏感，并且不能在供水不足而且蒸发率高的地区进行商业化生产。与水应激相反，人们对参与冻害耐受的基因和蛋白知之甚少。然而，有理论假设冻害耐受的主要成分可能涉及对脱水的耐受性(参见，如G.C.Yelenosky，L.Guy(1989)植物生理学(PlantPhysiol.)89：444-451)。

培育在盐碱化土壤中具有改善的生长能力的植物是近期的另一个使人感兴趣的领域。当浇灌的水含有可溶性盐时，则会发生土壤的盐碱化。在水蒸发后，盐会逐渐在土壤中积累。灌溉土地的逐渐盐碱化使我们这个星球上的很多耕地的农业前景黯淡(R.Serrano等，植物科学评论(Crit.Rev.Plant Sci.)，13：121-138(1994))。例如，干旱地区能对大多数作物的生长提供理想的光照时间和温度条件，但降雨量不够理想。人工灌溉仅可在短期解决这个问题，因为已经发现这类环境中的土壤经常会迅速盐碱化。为在盐碱化的环境中生长，植物必需保持在其细胞质内的钠/钾离子比例比土壤中的钠/钾离子比例低得多，这阻止很多植物的生长，包括食用作物。

生理学研究提示根中盐的排除，和/或叶细胞将盐隔绝于液泡，是决定盐耐受性的关键因素(M.Kirsch等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，32：543-547(1996))。氯化钠的毒性浓度首先在完全展开的叶中达到，其中氯化钠分隔于液泡中。只有当超过液泡的承载能力时，才会使得细胞溶质和非原生质(apoplasmic)中的浓度达到有毒的水平，最终导致膨压的丧失，因此植物死亡。已有人提议，液泡腔内的过度酸化(通过V-ATP酶)，可以提供钠/氢离子交换活性所需要的额外的质子，该交换活性使细胞溶质解毒(M.S.Tsiantis，等，植物杂志(Plant J.)，9：729-736(1996))。已知盐应激可增加ATP依赖的和焦磷酸(PPi)依赖的在例如向日葵幼苗根中的液泡膜小泡中的氢离子转运。盐处理还诱发氨氯吡嗪脒(amiloride)敏感的钠氢离子交换活性(E.Ballesteros等，植物生理学(Physiologia Plantarum)，99：328-334(1997))。在盐生植物松叶菊(Mesembryanthemum crystallinum)中，高氯化钠可以刺激叶细胞中液泡H⁺-ATP酶(V-ATP酶)和液泡钠/氢离子反向转运载体的活性。

而提高农作物的产量和增加某些观赏植物的美观性是农学研究中的另一个兴趣点。通过种植比野生型植物具有更大的营养性和/或生殖性结构的植物以及通过增加植物的生长速度，可以提高农作物的产量和增强某些观赏植物的观赏性。

在现有技术中，许多化合物被过分夸奖为可以提高植物生长的速度和提高植物有用成分中的生物量的产量。例如，宣称应用于组织培养基中的环糊精，通过包括增加的细胞***的机制，能增强细胞组织培养生长的速度(参见，如美国专利第6,087,176号)。也已知某些植物生长激素，例如植物生长素(除了其许多部位，还促进根生长)、细胞***素、赤霉酸(除了其它许多部位之外，还促进茎生长)，当用于植物组织时会促进增加的细胞***。在本技术领域也已知，某些生长因子可以用来增加植物和/或植物花的尺寸。不幸的是，这些生长激素和因子的分离和应用既昂贵又费时。

美国专利第5,859,338号披露了：对拟南芥(Arabidopsisthaliana)的CLAVATA1基因的修饰导致根尖分生组织和花分生组织中的细胞***丧失正常的控制。据说上述任一情况***控制的丧失都可导致分生组织的增大。在花中，这种增大据说会导致花器官数目的增加，包括心皮(carpel)数目的增加，其会增加果实的大小和种子的数目。美国专利第5,859,338号提供了clavatal核酸和蛋白，以及修饰过的clavatal核酸和蛋白，以产生改变的分生组织表型。

美国专利第5,750,862号披露了一种控制植物细胞生长的方法，该方法包括调节植物中细胞周期调控蛋白的水平和/或催化活性。尤其是，该专利披露了，通过提高p34^cdc2蛋白的水平可以促进由单个细胞或成群细胞再生为植株。通过调控间接调节p34^cdc2蛋白活性的调节元件，也可实现对再生的调控。

因而，我们需要这样的植物：对干旱和/或冻害具有改善的抗应激性、具有更大的尺寸特性(相对于野生型对应变体)、以及更能耐受它们生长的土壤中的盐分、并能够生产更多的有用成分的生物量。

发明简述

本发明披露了具有上调液泡焦磷酸酶表达的转基因植物。研究发现，表现出这种上调活性的植物，通常较其野生型对应物更大、表现出更强的抵抗干旱和/或冻害应激的能力、对它们生长介质中的盐分更加耐受、以及表现出更强的分生活性(细胞***)，从而导致在某些植物部分的生物量较野生型植物更高。

根据本发明，任何可以改变植物中液泡焦磷酸酶表达的适当的外源核酸分子都可以用来转化转基因植物。该外源核酸可以包括编码液泡焦磷酸酶蛋白(外源液泡焦磷酸酶)的核酸，如AVP1、其功能部分(肽、多肽)、或其同源物，和/或改变植物(外源核酸导入其中)的内源液泡焦磷酸酶表达的核酸。“外源核酸”指的是来源于外源核酸导入其中的植物细胞之外的核酸，或者是导入植物或植物的某部分后用以制备转基因植物之外的核酸。用以转化的外源核酸可以是RNA(核糖核酸)或者DNA(脱氧核糖核酸)，(例如cDNA(即互补DNA)、基因组DNA)。此外，外源核酸可以是环状或直链、双链或单链分子。单链核酸可以是正义链或反义链。对液泡焦磷酸酶蛋白进行编码的核酸的“功能部分”指的是对蛋白或多肽(其保留液泡焦磷酸酶蛋白的功能特性)进行编码的部分核酸。在特定具体实施例中，该核酸编码AVP1，功能部分或其同源物。该AVP1核酸可以从如arabidopsis或任何其它植物、或人工合成而获得。

改变植物(外源核酸导入其中)内源液泡焦磷酸酶表达的核酸包括在植物中有功能的调控序列(例如诱导型的、组成型的调节序列)和反义核酸。调控序列的例子包括启动子、增强子。该核酸还可以包括，例如，聚腺苷酸化位点、报告基因、和/或内含子序列等等，这些序列的存在可能并不是该核酸的功能或表达所必需的，但可通过影响，例如，转录和/或稳定性(例如，mRNA的转录和/或稳定性)而使核酸更好地表达和/或增强其功能。这类元件可以包括在核酸分子内以获得核酸的最佳效用。

运用已知的方法，本发明中使用的核酸可以从各种来源获得。例如本发明中采用的编码液泡焦磷酸酶(如AVP1)的核酸可以从自然来源中获得，如烟草、细菌、西红柿、或者玉米。在一个具体实施例中，核酸编码与转基因植物的野生型相对应的液泡焦磷酸酶。在另一个具体实施例中，该核酸编码与该转基因植物的野生型不相对应的液泡焦磷酸酶。改变植物(外源核酸导入其中)的内源液泡焦磷酸酶表达的核酸(如调控序列)也可以化学合成、重组生成和/或从商业来源得到。

把本发明的核酸导入植物中的各种方法对本领域技术人员来说是熟知的。例如，可采用农杆菌(Agrobacterium)介导的植物转化、粒子轰击、微粒子轰击(例如美国专利第4,945,050号；美国专利第5,100,792号)、原生质体转化、花粉转基因、生殖器官注射、和未成熟胚胎注射。该外源核酸可以被引入到植物的任何合适的细胞(或多种细胞(群))中，例如植物的根细胞(群)、茎细胞(群)、和/或叶细胞(群)。

任何合适的植物，包括被子植物、单子叶植物和双子叶植物、裸子植物、以及藻类都可以用来产生本发明的转基因植物、组织培养物、或细胞培养物。例如，西红柿、玉米、烟草、稻谷、高粱、黄瓜、莴苣、草坪草、观赏(如更大的花、更大的叶)和豆类植物都可以如本文所述进行转化，以产生本发明的转基因植物。此外，本发明的转基因植物可以在任何支持植物生长的基质中生长，如土壤或水(水生培植)。

本发明的转基因植物最好耐受土壤中的高盐浓度。术语“盐”包括所有的盐，即指酸中的氢被金属或金属等价物所替代时而生成的化合物，并且包括但不限于：包含单价的和二价的有毒阳离子的盐、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化镉、氯化锌、和硫化盐。

可通过外源核酸转化植物细胞将盐耐受性引入本发明的植物中，该外源核酸可改变植物中液泡焦磷酸酶的表达，以使其表达上调。任何合适的液泡焦磷酸酶，其中有几种已被克隆，都可用于本发明的组合物和方法(例如，Z.Sarasian等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：1775-1779(1992)；Jenslerchl等，分子生物学(Molec.Biol.)，29：833-840(1995)；Y.Kim等，植物生理学(Plant Physiol.)，106：375-382(1994))。在特定的具体实施例中，本发明涉及耐盐的转基因植物，包括为过表达AVP1而设计的外源核酸组件(construct)(Z.Sarasian等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：1775-1779(1992))。植物细胞的转化可以在整株植物、种子、叶、根、或任何其他植物部分中进行。优选地，对这些转基因植物进行改变，以至于它们可以在抑制相应非转基因植物生长的盐浓度中生长。转基因植物的转基因后代、由转基因植物产生的种子、和由转基因种子生成的转基因植物后代(其也是本发明的主题)，都有利地携带这些盐耐受属性。植物可以从转化的细胞再生以产生转基因植物，对其可进行筛选以获得一定水平的盐耐受性。在优选具体实施例中，外源核酸编码AVP1、或其同源物。优选地，将植物中的液泡焦磷酸酶的表达提高到某一程度，从而当NaCl浓度是从约0.2M到约0.3M时，转基因植物对氯化钠(NaCl)具有耐受性。可以生长在盐水中的转基因植物也可以由下面的方法获得：将在植物中上调表达液泡焦磷酸酶的核酸导入一个或多个植物细胞，以产生转化细胞。如本文所使用的，“盐水”包括以含有盐为特征的水，并且优选地其中盐在水中的浓度是从约0.2M到约0.4M。在一个具体实施例中，盐水指海水。

本发明的转基因植物也可用来产生耐盐(大约0.2M到约0.4M的盐浓度)的双重转基因植物。在一个具体实施例中，本发明涉及耐盐的双重转基因植物，包括一个或多个用外源核酸转化的植物细胞，该外源核酸可以改变植物中液泡焦磷酸酶和Na⁺/H⁺反向转运载体的表达。在一个有利组件中的液泡焦磷酸酶是AVP1、或其同源物，而Na⁺/H⁺反向转运载体是AtNHX1、或其同源物。本发明也包括双重转基因植物的转基因后代、以及由转基因植物产生的种子、和由该种子生成的转基因植物后代。

通过用外源核酸转化植物细胞也可将干旱和/或冻害耐受性引入植物，其中外源核酸会改变植物中液泡焦磷酸酶的表达，从而上调这种表达。在优选具体实施例中，提供了相当程度上耐干旱和/或冻害的转基因植物，其包括基因组，该基因组含有一个或多个外源引入的液泡H⁺易位性泵基因。特别优选的可育转基因植物(诱发干旱和/或冻害耐受性，以及在盐渍土中生长的能力)包括分离的外源嵌合DNA组件，该组件编码液泡H⁺易位性泵，并最好可操作连接于启动子，如35-S启动子或任何其他强启动子，包括但不限于组织特异性启动子。该转基因植物可包括多核苷酸序列，而该序列包括可操作连接于启动子的外源液泡膜焦磷酸氢离子泵基因。在又一个特别优选的耐干旱和/或冻害的转基因植物(能在盐渍土中生长)中，该多核苷酸序列包括可操作连接于35S启动子的双串联增强子(double tandem enhancer)的外源液泡膜焦磷酸氢离子泵基因。特别优选的液泡膜焦磷酸氢离子泵基因是AVP1基因。

用上述方法进行的液泡焦磷酸酶上调表达也可用来提供较其野生型对应植物具有更大的营养和/或生殖性器官的植物。也就是说，本发明提供增加植物产量的方法，包括将可以改变植物中液泡焦磷酸酶表达的核酸引入一个或多个植物细胞，从而产生转化细胞，由此增加植物的产量。本方法可进一步包括从转化细胞再生植株，以产生转基因植株，并选择比其相应野生型植物更大的转基因植株，进而产生较其相应野生型植物更大的转基因植物。本发明还包括获得比其相应野生型植物具有增加的花尺寸的转基因植物(如，观赏植物)的方法，包括将可以改变植物中液泡焦磷酸酶表达的核酸引入一个或多个植物细胞，从而产生转化细胞。

用上述方法进行的液泡焦磷酸酶上调表达也可用来产生较其野生型对应植物具有更强分生活力/细胞***速率的植物。正如本领域技术人员所明了的，分生组织是高等植物发育的中心，因为几乎所有的后胚胎(post-embryonic)器官，包括根、叶、花、腋分生组织、和形成层，都由芽或根分生组织所起动。增加的分生活性在植物结构的一个或多个方面导致更高的生物量，如由植物结构、根结构、以及茎结构的干重所证明的。增加的分生活性被设想为在根、叶、下胚轴、和子叶外植体中导致再生出芽的速率增加，以及导致整个植株生长速率的增加。

本发明人已发现，焦磷酸驱动的质子(氢离子)泵在液泡中的过表达导致更大的质子泵性能力，而更大的质子泵性能力则导致更强将离子摄入液泡的能力，这降低了细胞的渗透势；焦磷酸驱动的质子(氢离子)泵在液泡中的过表达还导致植物细胞***和增殖能力的增加。正如本领域技术人员所明了的，该发现可具有巨大的商业价值，例如，通过对细胞进行转化，以过表达此类泵，由此减少木材、谷物等的生产时间；增加具有不良或低再生能力植物的芽的再生能力，如木本植物、作物(如玉米)、以及观赏植物(如兰花)。导致这类增加的细胞***和增殖的过表达可用本文所描述的任一组件来实现。虽然许多诱导型启动子和组织特异性启动子都可以用来触发该基因和/或其同源物的过表达，但优选的组件包括可操作连接于嵌合启动子(如35S启动子的双串联增强子)的液泡膜焦磷酸驱动的氢离子泵基因(AVP-1)，其中嵌合启动子是设计用来过表达AVP-1。

本发明还披露了新颖的基因盒，包括含有可操作连接于嵌合启动子的液泡膜焦磷酸驱动的氢离子泵基因的盒。新颖基因盒包括可操作连接于启动子的外源液泡膜焦磷酸驱动的氢离子泵基因，以及新颖的编码序列包括可操作连接于35S启动子的双串联增强子的外源液泡膜焦磷酸驱动的氢离子泵基因。优选地，该编码序列是设计用来过表达AVP1。

本发明还披露了新颖的表达载体，包括：含有多核苷酸序列的表达载体，其包括可操作连接于35S启动子的双串联增强子和进一步操作连接于多克隆位点的外源液泡膜焦磷酸驱动的氢离子泵基因；以及含有多核苷酸序列的表达载体，其包括可操作连接于35S启动子的双串联增强子和进一步操作连接于异源性编码序列的外源液泡膜焦磷酸驱动的氢离子泵基因。

本发明人认为，此披露的发明可应用于任何植物，包括但不限于：作物性植物、观赏植物、草、灌木、或任何其他对人类有用或使人愉悦的植物，包括应用于单子叶植物、双子叶植物、被子植物、裸子植物、和藻类。

附图简述

参照下述发明详述和附图，可更完全地理解以上的描述以及本发明的进一步的目的、特点、和优点，其中：

图1A是典型的(每种出自10株植物)野生型(WT)和两个独立的转基因系(1’和2’)的俯视图，它们在10小时的明暗周期中水培生长了7周；

图1B(1)、图1B(2)和图1B(3)是典型的5天苗(old seedling)的根和根毛的显微镜照片，这些苗来自图1A中的典型的野生型、1’和2’，其平行生长于垂直植物营养琼脂平板的表面；

图1C是从野生型(WT)和两个独立的过表达AVP-1的转基因系(1’和2’)分离出来的膜部分的免疫印迹图；

图2是暴露于缺水应激7天后，典型的野生型(WT)植物对典型的过表达AVP-1(1’和2’)的转基因植物的俯视图；

图3是生长在含盐分高的土壤中的野生型(WT)植物对代表性的过度表达AVP-1(1’和2’)的转基因植物的透视图；

图4A是在将钠隔离于酵母前液泡腔所涉及的转运蛋白的工作模型简图；Nhx1(Na⁺/H⁺反向转运载体)，Vma1(液泡膜H⁺-ATP酶)，Gef1(酵母CLC氯离子通道)，Ena1(细胞膜Na⁺-ATP酶)；

图4B是示于图4A中的在将钠隔离于酵母前液泡腔所涉及的转运蛋白的工作模型简图，其还包括Avp1(A.thaliana液泡焦磷酸驱动的质子泵)；

图5A和图5B是表示野生型酵母系和突变酵母系细胞内Na⁺和K⁺含量的柱形图，其中的突变酵母系携带多种影响钠耐受性的突变，图中的值是两次测定数据的平均值、而短棒线代表标准差；

图6是来自野生型和AVP-1过表达(1’和2’)Arabidopsis(拟南芥)植物的根和子叶外植体再生的芽的俯视图，这些植物培养于图13的SIM培养基中；

图7是野生型植物(WT)对典型的过表达AVP-1的转基因植物(1’和2’)的Na⁺和K⁺含量的柱形图，这些植物种植于含盐分高的土壤中；

图8是钙摄入图3中2’的35SAVP-1转基因液泡膜小泡(方块)对钙摄入图3中野生型(WT)的小泡的曲线图；

图9A和图9B图解说明35SAVP-1假设机理，通过质子驱动功能，相对于野生型液泡可使更高的固体积累进入液泡；

图10是野生型对比转基因(1’和2’)AVP-1过表达Arabidopsis(拟南芥)植物的叶子的俯视图，叶子是按龄期放置；

图11A和11B是以水(蒸馏水)浇灌的野生型和过表达AVP-1的转基因(1’和2’)Arabidopsis(拟南芥)植物的叶子的俯视图，说明根结构的生长；

图12是典型的野生型矮牵牛叶插枝(petunia leave cuttings)(WT)对比典型的过表达AVP-1(35-S AVP-1)的转基因矮牵牛植物叶插枝的芽再生的俯视图；

图13是从野生型(WT)和AVP-1过表达(1’和2’)Arabidopsis(拟南芥)植物获得的并放置在SIM诱导培养基中的5天龄子叶的芽再生的俯视图。

图14是来自野生型和Arabidopsis(拟南芥)植物的两种AVP-1过表达系(1’和2’)的充足给水的叶中的渗透势的柱形图。

图15是培养于MS培养基中的矮牵牛外植体的俯视图，表示在6周的培养后来自该外植体的愈伤组织的诱导。

发明详述

由于植物液泡占据成熟植物细胞胞内总体积的40-99％，因而液泡大小的改变对细胞大小有巨大的影响(R.G.Zhen、E.J.Kim、P.A.Rea，在《植物液泡》(The Plant Vacuole)一书中，(学术出版有限公司，1997)，第25卷，298-337页)。液泡的体积是由离子和水的通量所控制，而后二者由各种泵和转运蛋白所介导。在植物中，触发离子、溶质、和水跨膜转运的推动力是质子梯度。液泡氢离子泵的活性导致腔内酸化，并建立跨越该液泡膜的氢离子电化学电位梯度，该梯度为无机离子、糖、和有机酸的次级主动转运蛋白提供能量。这些转运蛋白的活性可以调节胞内酸碱度和离子体内稳态，并导致产生渗透势所需的溶质的积累，该渗透势促进液泡膨胀(H.Sze、X.Li、M.G.Palmgren，植物细胞(The Plant Cell)11，677-689(1999))。

有3种不同的可产生质子电化学梯度的泵。一种位于细胞膜，其将氢离子从细胞内排出(PM H⁺-ATP酶)，两种位于液泡膜或其它内膜腔，其可以使它们所在的腔内酸化(液泡型H⁺-ATP酶和H⁺-PP酶)(R.A.Leigh，在L.a.Sanders编辑的《植物液泡》(The Plant Vacuole)一书中，(学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚，1997)，第25卷，171-194页)。

以前的工作表明，利用反义组件降低胡萝卜液泡H⁺-ATP酶的A亚基(A subunit)水平会导致植物的伸展降低和叶形态的改变(J.P.Gogarten等，植物细胞(The Plant Cell)4，851-864(1992))。本发明者已假设，增加供给进入液泡中的氢离子可加速细胞伸展。最近，基于液泡质子利于离子积累的相关理论，同一发明人假设液泡中固体物的积累可能有利于保护植物耐受干旱并提供更耐冻害的植物。

本发明者认识到，植物具有很多液泡氢离子转运泵，通过上调它们的活性、增加它们的表达、上调它们的转录和/或翻译、或增加它们的拷贝数，则可以增加液泡中固体物的积累，这是由于液泡中可获得的质子增多。本发明者通过增加液泡氢离子转运泵、无机焦磷酸酶、或V-PP酶(焦磷酸酶)(其由单多肽组成)的拷贝数来验证此假设(R.G.Zhen、E.J.Kim、P.A.Rea，在《植物液泡》(The Plant Vacuole)一书中，(学术出版有限公司，1997)，第25卷，298-337页)。在拟南芥中，由AVP-1基因编码的V-PP酶能产生通过液泡膜的氢离子梯度，其与液泡H⁺-ATP酶产生的氢离子梯度量级相近(similar in magnitude)(V.Sarafian、Y.Kim、R.J.Poole、P.A.Rea，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89，1775-1779(1992))。如本领域技术人员所明了的，在其它植物中的相似基因将以类似的方式起作用。

已知在生长的组织中H⁺-PP酶(氢离子焦磷酸酶)是液泡膜的主要质子泵。这可能是由于下述事实：生长的组织中，为了构建新的细胞，核酸、DNA、各种RNA、蛋白质、以及纤维素等被积极合成，因此，焦磷酸作为这些代谢过程的副产物会大量生成。储存在焦磷酸分子中的能量可以转化成不同的能源，即跨液泡膜的氢离子梯度。这种氢离子梯度构成液泡积聚溶质的推动力，从而产生足够的使植物细胞开始生长的渗透差。对于已看到的增加的生长效应，虽然本发明并不以任何方式限制于任何特定的假设，但本发明者假设：在过表达AVP-1的转基因植物中，更大数目的氢离子焦磷酸酶对产生氢离子梯度的速度具有正效应，这导致更加活跃的分生活性。

在一个具体实施例中，使用组件来产生本发明的转基因植物，该组件包括可操作连接于启动子的液泡焦磷酸酶基因，其中启动子是设计用来过表达液泡焦磷酸酶(例如，表达盒)。如在本文中所使用的，术语“过表达”是指比在无此组件的情况下所发生的表达具有更大的表达/活性。在一个特定的具体实施例中，使用组件来产生本发明的转基因植物，该组件包括可操作连接于嵌合启动子的AVP1基因，其中嵌合启动子是设计用来过表达AVP1。更具体地说，本发明涉及组件，其中AVP1基因是可操作连接于35S启动子的双串联增强子。

本发明的转基因植物，除食用价值或观赏价值、工业价值(如木材生产)之外，可具有其他用途。例如，本发明的转基因植物可以较其野生型对应物摄入不同的或更多的离子。如下面所讨论的，对突变酵母系(enal)的研究证实在高等生物中液泡中的质子转运泵在阳离子解毒作用中起非常重要的作用(在细胞内阳离子解毒***中涉及的植物成分是通过补充芽殖酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的对盐敏感的突变体而加以鉴定)。转基因植物和/或其后代可用来生物法恢复补救土壤和生长培养基，该转基因植物和/或其后代包括外源核酸，而外源核酸(依照此类研究)会改变液泡焦磷酸酶在植物中的表达。这样的植物可用来从可支持植物生长的培养介质(例如土壤，水)中除去阳离子(如，单价和/或二价阳离子)。例如，本发明的转化植物可以用来从支持植物生长的培养介质中除去钠(Na)、铅(Pb)、锰(Mn)、和/或钙(Ca)离子。

为了证明增加液泡中的氢离子供给对植物的干旱和/或冻害耐受性、盐生长的耐受性、以及植物体积的影响，本发明人制成了含有额外拷贝的液泡质子泵AVP-1的转基因植物。

以含有AVP-1基因的组件转化拟南芥(Arabidopsis thaliana(ecotype columbia))植株。然后分离含有该基因额外拷贝的转基因株系。AVP-1，可译框架被克隆到经修饰的pTR103的Xma1部位[R.Toper、V.Matzeit、B.Gronenbom、J.Shell和H.H.Steinbiss，核酸研究(Nucleic acid Research)，15，5890(1987)]。该载体包括35-S启动子的串联重复。包括35-S串联启动子、AVP-1可译框架(ORF)、和聚腺苷酸化信号的Hind III片段被亚克隆到pPZP212载体的Hind III位点(P.Hajdukiewicz、Z.Svab和P.Maliga，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，25，989-994(1994))。通过正在开花的拟南芥(Arabidopsis thaliana(ecotype columbia))真空渗入进行土壤杆菌介导的转化。通过把经转化的植株的种子种植于植物营养琼脂板上来筛选转基因植株，其中植物营养琼脂板补充以25毫克/升的卡那霉素。植物继续选择培养两代，以鉴定与该基因纯合的转基因植物。

图1A是典型的(每种出自10株植物)野生型(WT)和两个独立的转基因系(1’和2’)的俯视图，它们在10小时的明暗周期中水培生长了7周。如从图1A中可以看到的，转基因系2’(其在较高的水平表达AVP-1蛋白)、转基因系1’和野生型(WT)的目视比较说明AVP-1的数量与植物的大小有关。研究发现，转基因植物的质量大于野生型植物的质量。转基因系1’和2’的整个转基因植物的干重(样品数为4)(在75℃处理24小时后测量)分别比野生型(WT)的干重大1.5和3倍。

图1B(1)、图1B(2)和图1B(3)是典型的5天苗的根和根毛的显微镜照片(放大率是40倍，照片上小棒长度是2毫米)，这些苗来自图1A中的典型的野生型、1’转基因系和2’转基因系，其平行生长于垂直植物营养琼脂平板的表面。转基因系1’和2’的苗根毛的平均长度较野生型(WT)根毛长40％和70％(图1B)(沿整个根部测量根毛长度，每组选取5个苗。每株测量平均80个根毛)。根毛的长度与液泡的大小有关，因此根毛大小的增加可能起因于液泡体积的增加。将这种情况与拟南芥突变体rdh3进行比较，据报道该突变体具有减小的液泡体积，是一种矮小的具有异常短小根毛的植物(M.E.Galway、J.W.J.Heckman、J.W.Schiefelbein，植物(Planta)201，209-218(1997))。已认识到增加的根结构对土壤受侵蚀、豆类植物的固氮都有积极的影响，并且有助于植物对水和养分的吸收。

图1C是从野生型(WT)和两个独立的过表达AVP-1的转基因系(1’和2’)分离出来的膜部分的免疫印迹图。在水载培养基中生长8周以后，从8周老的野生型(WT)和AVP-1转基因植物(1’和2’)的芽(shoots)分离总的膜部分。植物芽的匀浆分别在8000转/分钟和100,000转/分钟条件下顺序地离心15和30分钟。将100毫克的膜沉淀物重悬浮于10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、pH7.5、150mM NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10％甘油，然后1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白(10微克)在10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上分离，用抗体进行电印迹和免疫染色，所采用的抗体来自(raisedagainst)KLH-共轭(conjugated)的合成肽，该肽对应于AVP-1蛋白的推测的第4亲水环(V.Sarafian、Y.Kim、R.J.Poole、P.A.Rea，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，1778-1779(1992))。焦磷酸酶通过化学发光进行检测。图1C说明转基因系(1’和2’)在比野生型(WT)更高的水平表达AVP-1蛋白(即，相对于WT，1’增加1.6倍，2’增加2.4倍)。

因为增加细胞内钾离子浓度(100mM至300mM)，缺水的小麦具有更高的耐旱性(S.Gupta、G.Berkowitz、P.Pier，植物生理学(Plant Physiol.)89，1358-1365(1989))，因此假设(但本发明不限于此理论)AVP-1转基因植物的耐旱性增加可能是其更高的液泡内钾浓度的结果，而更高的液泡内钾浓度导致水保留能力的增加。实验室试验似乎支持此观点。

图2是曝露于缺水应激7天后，典型的野生型植物(WT)对典型的过表达AVP-1(1’和2’)的转基因植物的俯视图。对野生型和过表达AVP-1的转基因植物(图3A)进行了耐旱测试(24℃)。在7天缺水应激后，野生型植物枯萎，而来自35S AVP-1转基因系(1’和2’)的植物则肿胀且活着。此外，当把水给予经受干旱应激的植物时，转基因植物继续进行正常的生长、抽苔(bolted)并且结籽，而野生型植物则死亡。野生型和35S AVP-1转基因植物叶子中的相对水含量在缺水应激期间的测试表明，转基因系较野生型植物具有更强的保留水分的能力。

图14是来自野生型和拟南芥植物的两种AVP-1过表达系(1’和2’)的充足给水的叶中的渗透势的柱形图。在恒定水含量下测得的转基因植物的叶中的降低的渗透势与AVP-1过表达导致增加的溶质积累的论点相一致，从而增加了保留水的能力。

虽然在附图中没有说明，对许多植物种来说，在经受24小时或更长时间的冻害压力(challenge)(＜0℃)后，也得到了相似的结果。虽然不限制于这样的假说，但相信过表达AVP-1(1’和2’)的转基因植物比野生型植物提供更强的防冻害能力，这是由于在液泡中具有更多数量的阳离子。更多数量的阳离子可以提供更高的渗透压，其导致更强的保留水的能力，而更强的保留水的能力不仅赋予植物耐受较低的土壤水势(Soil water potential)的能力，而且给予植物更强的抵抗冻害的能力，冻害可导致植物严重脱水。

图3是生长在含盐分高的土壤中的的野生型植物(WT)对代表性的过表达AVP-1(1’和2’)的转基因植物的透视图。五株野生型植物(WT)和五株两个AVP-1过表达转基因系(1’和2’)种植在土壤中，并处于10小时的明暗周期。植物以稀释的营养液(1/8MS盐)灌溉6周，然后用补充以NaCl的稀释的营养液灌溉。起初NaCl的浓度为100mM，然后每4天增加50mM。图3中的图示相应于在第10天在存在300mM NaCl条件下的典型的植物。图3说明，两种AVP-1植物类型(type)(1’和2’)在含盐分高的土壤中明显较野生型植物更健壮。下述事实，即过表达AVP-1(焦磷酸驱动的液泡膜质子泵，本工作)或AtNHX1(钠离子/质子反向转运载体，(M.Apse等，科学(Science)，285：1256-1258(1999))和本工作)的基因工程改造的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物能够在高浓度NaCl存在下生长，强烈支持本文所阐述的策略。可预期双重转基因植物会表现出进一步增强的盐耐受表型。此些拟南芥(Arabidopsis thaliana).转运蛋白或者它们的对应物在重要的农业作物中可完成类似的功能。35S AVP-1拟南芥转基因植物的增大的体积也有助于基因工程改造的作物能潜在地增加产量。

植物细胞器中阳离子体内稳态的工作模型

虽然本发明不局限于任何特定的假说，但本发明者设计了在植物细胞器中阳离子体内稳态的工作模型，其可以解释本文所披露的转基因植物中所发现的未曾预料的结果。

在植物中，大多数的转运过程的能量来自于质子的初级转运。氢离子转运泵位于细胞膜和液泡膜，分别将氢离子从细胞溶质转到细胞外和液泡腔(P.A.Rea等，“液泡膜ATP和焦磷酸酶”(Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganicPyrophosphatase)。在《植物生化方法》(Methods Plant Biochem.)一书中，PP.385-405，学术出版有限公司，伦敦(1990))。该植物液泡膜包括两种氢离子转运泵：V-ATP酶和无机的焦磷酸酶或称V-PP酶。它们的作用使得腔内酸化并建立跨液泡膜的质子电化学电位梯度(J.M.Davies等，“液泡氢离子泵的生物能学”(The Bioenergetics of Vacular H⁺Pumps)，在R.A.Leigh、D.Saners所编辑的《植物液泡》(Plant Vacuole)一书中，pp.340-363，学术出版社，圣地亚哥(1997))。该液泡膜与很多生理过程相关，包括细胞溶质的pH静态平衡(cytosolic pH stasis)、调节性钙离子分区、有毒离子如钠离子的隔离、膨压调节、以及营养的储存和补偿(retrieval)。液泡占据成熟植物细胞的总胞内体积的40-99％。液泡质子泵性焦磷酸酶是植物液泡膜的普遍的并大量存在的成分，它可以产生稳态的跨液泡膜的质子电化学电位，其类似或大于V-ATP酶产生的质子电化学电位(P.A.Rea等，“液泡膜ATP和焦磷酸酶”(Tonoplast Adenosine Triphosphate andInorganic Pyrophosphatase)。在《植物生化方法》(Methods PlantBiochem.)一书中，pp.385-405，学术出版有限公司，伦敦(1990))。在各种生物合成途径中，焦磷酸(PPi)是活化或多聚化过程中的副产物，它还在植物中作为ATP的替代能量供体：通过蔗糖合成酶用于蔗糖转移；通过焦磷酸：果糖-6-磷酸磷酸转移酶用于糖酵解；以及通过液泡质子泵性焦磷酸酶为液泡膜提供能量(M.Stitt，植物学报(Bot.Acta)111：167-175(1998))。

大多数细胞内细胞器，包括网格蛋白被膜小泡、内体、高尔基体膜、和液泡，都具有酸性的内部(X.S.Xie等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，264：18870-18873(1989))。这种酸化是由质子转运产电ATP酶所介导，而在植物液泡中还通过焦磷酸驱动的质子泵V-PP酶(J.M.Davies等，“液泡氢离子泵的生物能学”(The Bioenergetics of Vacular H⁺Pumps)，在R.A.Leigh、D.Saners所编辑的《植物液泡》(Plant Vacuole)一书中，pp.340-363，学术出版社，圣地亚哥(1997)；R.G.Zhen等，《在液泡膜焦磷酸驱动的质子转运的分子和生化基础》(TheMolecular and Biochemical Basis of Pyrophosphate-EnergizedProton Translocation at the Vacuolar Membrane)，学术出版有限公司(1997))。需要阴离子转运以维持净电中性(A.al-Awquti，细胞生物学当代观点(Curr.Opin.Cell.Biol.)，7：504-508(1995))。

图4A是在将钠隔离于酵母前液泡腔所涉及的转运蛋白的工作模型简图；Nhx1(Na⁺/H⁺反向转运载体)，Vma1(液泡膜H⁺-ATP酶)，Gef1(酵母CLC氯离子通道)，Ena1(细胞膜Na⁺-ATP酶)。GLC电压门控氯离子通道超家族的酵母成员Gef1，是在酵母中将铜转入晚期高尔基体小泡和阳离子隔离于前液泡腔所必须的。(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95：4046-4050(1998)；R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：480-1485(1999)；实施例1)。而且，已经表明，gef1突变体的缺陷，可通过下述方法加以抑制：导入CLC超家庭的表型成员、Torpedo marmorata CLC-0、或导入拟南芥(Arabidobsis thaliana)CLC-c和CLC-d氯离子通道基因(M.Hechenberger等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271：33662-33638(1996)；R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050(1998))。图4B是示于图4A中的在将钠隔离于酵母前液泡腔所涉及的转运蛋白的工作模型简图，其还包括Avp1(A.thaliana液泡焦磷酸驱动的质子泵)。

虽然不希望被理论所限制，但图4a和4b展示的两个观察结果导致提出钠离子隔离于酵母中的模型。首先，gef1突变体对高盐浓度敏感。其次，钠离子/质子交换体Nhx1是定位于前液泡腔(R.Nass等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))。在图4A和4B中提出的模型假定，通过Nhx1的钠离子隔离依赖于液泡H⁺-ATP酶和氯离子通道Gef1。Gef1介导的阴离子内流允许通过液泡H⁺-ATP酶建立足够大小的质子梯度，以通过钠离子/质子交换驱动钠离子的上向积累(uphillaccumulation)。

基于此模型，假设：增加质子内流到假定的内体腔可以提高通过Nhx1交换体的钠离子隔离。为了增加氢离子的可获得性，表达了A.thaliana的功能获得型(gain-of-function)突变体基因AVP1-D，该突变体基因为液泡焦磷酸驱动的质子泵编码(图3B)(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997))。表达在酵母中的这种质子泵可以恢复测试株的钠离子耐受性，但前提是该测试株含有有功能的NHX1和GEF1基因。此外，Gef1p和Nhx1p共定位于同一细胞器内，即前液泡室内(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999))。这些结果有力地支持图4A和4B中的模型，并表明酵母前液泡室可用来鉴定参与细胞内钠解毒的不确定的植物转运蛋白。

图4A和4B所示模型与高等植物中液泡在阳离子解毒作用中所起作用的生理数据完全一致。酵母和植物细胞共享从高尔基网向液泡转运小泡的途径和信号(J.M.Neuhaus等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，38：127-144(1998)；(N.Paris等，植物生理学(Plant Physiol.)，115：29-39(1997)；M.H.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：24530-24535(1997)；A.V.Vitale等，植物科学趋势(Trends Plant Sci.)，4：148-154(1999))。因此，在酵母中进行研究，以鉴定在高等植物中，液泡在阳离子解毒中的作用。

在酵母中阳离子隔离机制的研究

实施例1：在酵母系中AtNhx1和Avp1的功能

为了验证图4A和4B中提出的分隔模型，构建了缺失细胞膜钠外流泵的突变酵母系(ena1)，该突变酵母系因而必需依赖于内部的解毒***，以在高盐环境中生长。图4A和4B所示的隔离模型(R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998)，以及R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050(1998))预计：如果在假定的内体室可以增强质子的可获得性，那么ena1系可变成耐盐的，即随着增加的质子内流，细胞质钠离子会通过NHX交换体而被隔离。

酵母液泡ATP酶是多亚基蛋白，因此很难通过过表达其中的任一亚基来增加其活性。但是(instead)，通过在酵母中表达A.thaliana AVP1基因来增加质子内流，从而获得相同的效果。该基因编码单链多肽，当在酵母中表达时，其能够将质子泵入液泡的管腔(E.J.Kim等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91：6128-6132(1994))。为确保该质子泵的最高活性，表达了具有增强的氢离子泵性能力的AVP1基因(AVP1-D)的E229D功能获得突变体(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997))。检测了生长在含有高浓度NaCl的SD-尿嘧啶(SD-ura)培养基上之后的突变型和野生型细胞内的钠和钾含量。材料和方法

酵母品系和质粒

采用了与W303(ura3-1 can1-100 leu2-3，112trp1-1 his3-11，(R.A.Gaxiola等，EMBO杂志(EMBO J.)，11：3157-3164(1992))等基因的系。为了构建GEF1和NHX1基因缺失，采用了质粒pRG52(·gef1∷HIS3)(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050)(1998)和pRG197(·nhx1∷HIS3)，从而分别制备了RGY85和RGY296系。ena1∷HIS3突变体获自Fink实验室收集品(collection)(L5709)。

转化方法

通过利用乙酸锂法进行了酵母细胞的转化(D.Gietz等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，20：1425(1992))。双突变体RGY324(gef1∷HIS3 ena1∷HIS3)、RGY326(nhx1∷HIS3 ena1∷HIS3)、和RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)是经单突变系的杂交而获得。通过对与每个单突变体有关的表型打分来鉴定分生后代中的双突变体。出芽(sporulation)、四分体***(dissection)、和交配型的打分见下述文献所述(C.Guthrie和G.R.Fink，《酵母遗传学和分子生物学指南》(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，学术出版社，圣地亚哥，(1991))。细胞在YPD(1％酵母/2％蛋白胨/2％右旋糖，Difco公司)、YPGAL(1％酵母/2％蛋白胨/2％半乳糖，Difco公司)、SD(Difco公司，添加2％右旋糖的合成培养基)、或APG(APG是合成基本培养基，包括10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mM硫酸镁、1mM氯化钾、0.2mM氯化钙、以及微量矿物质和维生素)(A.Rodriguez-NavarroJ.Ramos，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，159：940-945(1984))中培养。按说明添加氯化锰(Sigma公司)、氯化四甲基铵(tetramethylammonium chloride)(Sigma公司)、氯化钠(Sigma公司)、或潮霉素-B(Sigma公司)。

野生型、L5709(ena1.∷HIS3)、RGY324(gef1∷HIS3ena1 ∷ HIS3)、和RGY326(nhx1∷HIS3 ena1∷HIS3)品系用pYES2载体(Invitrogen公司)和质粒pYES2-AVP1-E229D进行转化，其描述于R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997)。用于组织化学分析的RGY343(gef1∷HIS3nhx1∷HIS3)品系用pRG151(GEF1-GFP)(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050(1998))和用pRIN73[NHX1-(HA)₃](R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))进行转化。

野生型和RGY296(nhx1∷HIS3)品系用pAD4载体进行转化(R.Ballester等，细胞(Cell)，59：681-686(1989))。RGY296(nhx1∷HIS3)用pRG308(ADH1∷AtNHX1)进行转化(见，《AtNHX1的克隆》)。

细胞内钠和钾含量的检测

细胞过夜培养于SD-ura培养基(Difco公司；合成培养基，含有2％右旋糖，无尿嘧啶)。过夜培养物注入YPGAL(1％酵母抽提物/2％蛋白胨/2％半乳糖；Difco公司)培养基并培养至A₆₀₀(600纳米时的吸光度)为0.6。在该OD(光密度)下，加NaCl至终浓度为0.7M。培养细胞6小时，离心收集，用1.1M山梨醇和20mM氯化镁洗涤两次，然后在95℃下，以水抽提30分钟。

细胞内钠离子和钾离子数量是在Georgia大学化学分析实验室通过感应偶合等离子-质谱进行检测(参见网址：rserv/uga.edu/rsnew/chemicalanalysis/)。通过利用对生长在1M氯化钠中细胞计算的细胞内水值，估计了细胞内阳离子浓度(R.A.Gaxiola等，EMBO杂志(EMBO J.)，11：3157-3164(1992))。

免疫荧光

RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)系培养于SD-ura、SD-leu培养基(Difco公司；合成培养基，含有2％右旋糖，无尿嘧啶和亮氨酸)中至对数生长中期，加入0.1毫克/毫升潮霉素B，然后在30℃培育该培养物一小时。在室温及不搅拌条件下，用3.7％甲醛(Sigma公司)固定细胞45分钟。进行了原生质球形成(spheroplast formation)、可通透化(permeablization)、洗涤、和抗体培育(J.Pringle等，在C.Guthrie和G.F.Fink编辑的《酵母免疫荧光方法》(Immunofluorescence Methods for Yeast)(学术出版社，圣地亚哥)，Vol.194，pp.565-602(1991))。作用第一抗体的MAB HA11是来自Babco公司(Richmond，CA)。Cy3-交联的山羊抗小鼠IgG(免疫球蛋白G)是来源于JacksonImmunoresearch公司。把4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-Diamidino-2-phenylindole)(Sigma公司)加入固定培养基以对线粒体和核DNA进行染色。

亚细胞分级分离和Western分析

RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)系培养于APG培养基(pH7.0)，然后溶胞产物经10步蔗糖密度梯度进行分级分离(R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))。对各个级分的等分试样(100微克)进行SDS/PAGE(SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳)，然后转移至硝酸纤维素(R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))。用单克隆抗GFP(绿色荧光蛋白)抗体(1∶10,000稀释，CLONTECH公司)、抗血细胞凝集素抗体(1∶10,000稀释，Boehringer Mannheim公司)、和过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体(1∶5000)对蛋白质印迹(Werstern blots)进行了探针探测，并用电化发光(ECL)增强的化学发光***(Amersham Pharmacia公司)进行显色。

AtNHX1的克隆

AtNHX1是克隆A.thaliana的噬菌体cDNA文库(J.J.Kieber等，细胞(Cell)，72：427-441(1993))(自拟南芥生物资源中心获得)，通过用含有部分克隆的表达的序列标记片段(拟南芥生物资源中心，DNA储存中心)进行探针探测。把全长克隆(2.1kB)连接到载体pSK2(Stratagene公司)(在NotI部位)，从而产生质粒pRG293。用pRG293(作为模板)和GGCCCGGGATGGATTCTCTAGTGTCGAAACTGCCTTCG(5号序列)(斜体碱基与可译框架的1-30核苷酸对应)和T7寡核苷酸，并通过PCR(聚合酶链反应)对AtNHX1可译框架进行扩增。然后PCR产物用XbaI和SalI进行消化并酶切连接于pAD4载体，得到pRG308质粒。测定AtNHX1可译框架的序列以验证PCR产物的可靠性。全长序列较拟南芥基因组发起中心(ATM021B04.4)报道的可译框架长，并已存放在基因文库(GenBank)(索取号AF106324)。

AVP1-D的克隆

将载体pYES2(Invitrogen公司)导入野生型、ena1、ena1nhx1、和ena1 gef1突变体。将质粒pYes2-AVP1-D(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997))导入ena1、ena1 nhx1、和ena1 gef1突变体。每株的5倍连续稀释(从105细胞起)物培养于YPGAL(1％酵母抽提物/2％蛋白胨/2％半乳糖)(含有或不含0.5M氯化钠)平板，并于30℃培养2天。将指数生长的细胞(野生型和以pYES2载体转化的ena1，以及携带有pYes2-AVD1-D的ena1、ena1 nhx1、和ena1 gef1突变体)暴露于0.7M氯化钠6小时。制备了全细胞抽提物，并测得钠离子和钾离子浓度。

结果

上述构建的ena1突变体缺少细胞膜钠外流泵，因此必需依赖内部解毒***来消除钠的毒性。ena1株的生长对低钠浓度敏感(200mM)，此浓度不抑制野生型菌株的生长。过表达AVP1-D可以恢复盐敏感ena1突变体对盐的耐受性。AVP1-D对ena1株盐耐受性的恢复需要有功能的NHX1和GEF1基因：ena1 nhx1AVP1-D和ena1 gef1 AVP1-D株是盐敏感的。

图5A和图5B是柱型图，表示野生型酵母株和携带有多种影响钠耐受性的突变的酵母株的细胞内钠离子和钾离子含量，其中数值是两次测量的平均值，短棒线表示标准差。在暴露于补充以0.7M氯化钠的培养基6小时后，检测了野生型株和携带有多种影响钠耐受性的突变型菌株的细胞内钠离子和钾离子含量。可以看到在ena1突变株细胞内的钠离子含量比野生型株高8倍。可以看到在ena1 AVP1-D株中的总细胞钠离子的一致的(consistent)减少，这种减少的原因不明。研究发现，该ena1AVP1-D株是耐盐的，虽然其胞内钠离子含量较野生型的胞内钠离子含量高4倍。在缺少gef1或nhx1(即ena1 gef1或ena1 nhx1)的ena1 AVP1-D株中，钠离子含量没有降低到在GEF1 NHX1株中钠离子含量的程度。综和上面的结果，遗传和生理数据与Nhx1、Gef1和Avp-1协同作用以内部隔离钠的模型是一致的。如在图中可见看到的，拟南芥液泡氢离子-焦磷酸酶(Avp1)明显为酵母ena1突变株赋予了盐耐受性。

研究发现，细胞内钾离子含量与钠耐受性正相关，并与菌株的钠离子含量负相关(图4B)。野生型钾离子浓度为100mM，但在ena1突变株中则降低到20mm。有趣的是，在过表达AVP1-D基因的ena1株中，细胞内钾离子浓度几乎恢复到野生型水平(图4B)。然而，除非NHX1和GEF1都是有功能的，AVP1-D的过表达则不能恢复细胞内钾离子至野生型水平(见图4B中双突变体ena1 nhx1或ena1 gef1)。

如本文所述，酵母细胞内钠离子的解毒作用需要有功能的钠离子/氢离子交换体(Nhx1)和氯离子通道(Gef1)，并且它们共同位于前液泡室(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999))。当酵母NHX1基因(AtNHX1)的拟南芥(Araidopsis thaliana)同源物被克隆时，检测了其在nhx1酵母突变株中的功能，研究发现，该AtNHX1基因可以部分抑制nhx1突变株的阳离子敏感表型。图6是NhX1同源物的推测的氨基酸顺序的排列，其中NhX1同源物是来自拟南芥AtNHX1(1号序列)、人类HsNHE-6(2号序列)、和酵母ScNHX1(3号序列)；相同的残基以黑框表示，短线表示序列中的缺失(gaps)。上面排列的*号表示从人类NHE1(¹⁶³DVF-FLFLLPPI¹⁷³)(4号序列)推论出的氨氯咪嗪(amiloride)结合部位。

实施例2：Gef1p Nhx1p在酵母中的功能和共定位

NHX1和GEF1基因，其在钠解毒中有重要作用，同样也是其它阳离子解毒所需要的。在有毒阳离子存在下，进行了含有gef1和nhx1(ena1)酵母突变系生存能力的研究，研究是根据图4a和4b中提出的模型。

该隔离模型不仅推测在阴离子通道Gef1和钠交换体Nhx1之间存在功能连接，而且预测两种蛋白共同定位于共同的腔室。(校：原文中的“these two proteins”不好理解)因为以前的研究表明，Nhx1定位于前液泡室(R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))，所以也进行了实验以确定Gef1和Nhx1蛋白是否共定位于此腔室。

材料和方法

用pRG151；GEF1-GFP和pRIN73；NHX1-(HA)₃质粒转化RGY419(gef1 nhx1)系。转化体培养于SD(Difco公司；具有2％右旋糖的合成培养基)。为了检测这些转化体对毒性阳离子的敏感性，上述系的5倍连续稀释(从10⁵细胞开始)物在30℃培养于YDP(1％酵母抽提物/2％蛋白胨/2％右旋糖)2天，按照指示其中添加3mM氯化锰、0.45M四甲基铵(TMA)，或者添加0.05mg/ml潮霉素B(HYG)。

为证明Gef1p和Nhx1p的共定位，进行了两项研究。

测定了在gef1 nhx1细胞中亚细胞级分的荧光分布和免疫探测，其中gef1 nhx1细胞是用下述两个组件进行转化：GEF1-GFP融合和NHX1-(HA)₃标记的融合。当细胞生长至OD₆₀₀＝0.5时，添加潮霉素B(Sigma公司)至终浓度0.1mg/ml并于30℃培养40分钟。固定细胞并以抗HA抗原决定部位和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗体染色。以电荷偶联的显微镜来观察细胞并利用去旋算法(deconvolution algorithm)(Scanalytics公司，Billerica，MA)取光学截面(B.K.Kennedy等，细胞(Cell)，89：381-391(1997))；(短棒＝1m.)。

也测定了Gef1p和Nhx1p在蔗糖梯度中的迁移性能以提供Nhx1(HA)₃和GEF1-GFP的共定位证据。以质粒pRG151；GEF1-GFP和pRIN73；NHX1-(HA)₃转化RGY419系(gef1 nhx1)并培养于APG培养基(A.Rodriguez-Navarro和P.A.Rea，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，159：940-945(1984))。上述(such)被转化为原生质球，经细胞溶解(lysed)，然后以10步蔗糖梯度(18-54％)分级分离(A.Sorin等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：9895-9901(1997)和A.Antebi和G.R.Fink，细胞分子生物学(Mol.Biol.Cell)，3：633-654(1992))。蛋白质印迹显示了Gef1-GFP和Nhx1-HA的分布。

结果

研究发现，Gef1突变体对3mM氯化锰、0.45M氯化四甲基铵、和0.05微克/毫升潮霉素B敏感。Nhx1突变体也对氯化四甲基铵和潮霉素敏感。nhx1突变体对潮霉素的极度敏感可为分析nhx1功能提供重要的工具。

研究发现，血细胞凝集素(HA)标记的Nhx1和Gef1-GFP融合蛋白共定位，如通过外荧光去旋显微镜所示。图象旋转90度后的一致信号进一步支持这两种转运蛋白在这些细胞中的共定位。Nhx1(HA)₃和GEF1-GFP蛋白在膜制剂(membranepreparations)的蔗糖密度梯度中的共迁移也支持两者共定位，其中膜制剂是获自表达标记蛋白的细胞。含有两种蛋白的膜部分的沉降性能与前液泡室的沉降性能一致(R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))。Gef1-GFP(但不是Nhx1)也存在于高尔基体部分，这与先前的研究相一致(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050(1998)，B.Schwappach等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：15110-15118(1998))。

实施例3：NHX1的A.thaliana同系物抑制突变体酵母对潮霉素敏感性的能力

本文描述的的酵母系为鉴定在其它生物中介导盐耐受性的基因提供了重要的手段。为检验此***的实用性，鉴定了来自拟南芥(见材料和方法)的序列(与酿酒酵母NHX1可译框架具有非常高的同源性)，并使用表达的序列标记片段(见材料和方法)，以获得该拟南芥基因的全长克隆。拟南芥(AtNhx1)、人类(HsNhe6)、和酵母(ScNhx1)的Nhx1同系物的氨基酸序列的比较(alignment)，揭示了氨基酸相同的片断以及在预计的跨膜结构域内的相似性(图6A-C)。然而，需强调的是，虽然有这些关系，但AtNhx1和ScNhx1的羧基末端都没有显示出高度的同源性(图6A-C)。

哺乳类钠离子/氢离子反向转运载体的特征是其可被氨氯吡嗪脒抑制。通过在人类NHE1反向转运基因中的点突变体已确定了推测的氨氯吡嗪脒结合部位(¹⁶³天冬-缬-苯丙-苯丙-亮-苯丙-亮-亮-脯-脯-异亮¹⁷³(¹⁶³DVFFLFLLPPI¹⁷³)(4号序列)(L.Counillon等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：4508-4512(1993))。AtNhx1、HsNhe-6、和ScNhx1具有几乎相同的序列(图6)。然而，在酵母培养物中，以氨氯吡嗪脒抑制Nhx1或者AtNhx1的活性的尝试都不成功。

酵母nhx1突变体对潮霉素的极度敏感性使得可以试验：在酵母中，克隆的拟南芥AtNHX1ORF(可译框架)是否可以提供钠离子/氢离子交换功能。将载体pAD4(R.Ballester等，细胞(Cell)，59：681-686(1989))导入野生型和nhx1系。将质粒pRG308；ADH；AtNHX1导入nhx1突变体。所述菌株的5倍连续稀释物(105细胞开始)于30℃培养于YPD(-)或补充以0.05mg/ml潮霉素(+)的YPD培养基2天。相同菌系的连续稀释物生长于APG培养基(见材料于方法)(-)，或生长于补充以0.4M氯化钠的APG培养基(A.Rodriguez-Navarro和J.Ramos，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，159：940-945(1984))

该AtNHX1基因能够抑制nhx1突变体的潮霉素敏感性。该AtNHX1基因也抑制nhx1突变体的氯化钠敏感性，但前提是钾离子的可获得性下降。然而，AtNHX1基因不能挽救过表达AVP1-D基因的双突变体ena1 nhx1的Na^+-敏感生长表型。

实施例4：功能获得酵母AtNHX突变株的产生

         材料和方法

通过诱变处理克隆的基因来构建突变体文库，则可在ena1酵母中产生增强盐耐受性的AtNHX的功能获得突变体。该文库可用来转化盐敏感酵母突变体ena1并用增强的耐盐表型进行克隆。

其它显示出与AtNHX1基因具有相类似的基因，如由拟南芥基因组发起者(AGI)所报道的基因，也可以在突变酵母中表达以形成功能获得突变株。目前认为，一些AtNHX1的同源物是细胞膜转运蛋白，因此，它们在酵母中的功能常常是pH依赖性的，如欲成功筛选，则需要培养基有精确的组成和pH。细胞膜转运蛋白的鉴定有助于设计具有增强的盐耐受性的植物(由于减少的钠摄入)。此外，在酵母中植物cDNA表达文库可以用来鉴定其它参与氯化钠解毒的转运蛋白家族。

为了产生AtNHX的功能获得突变株，可以采用Stratgene(大肠杆菌(Epicurian Coli)XL1-Red感受态细胞，Cat#200129)建立的导入随机突变的方法。该方法涉及对克隆到在3种基本DNA修复途径上有缺陷的菌株上的基因进行扩增。在该株中的随机突变率大约较野生型高5000倍。突变的AtNHX基因文库可以转化到ena1酵母突变体中并针对盐耐受性进行筛选。酵母转化采用Schiestl与合作者报道的方法进行(D.Gietz等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，20：1425(1992)，其结合于此作为参考)。另一替代XL1-Red随机诱变策略的方法是Fink与合作者描述的PCR法(H.D.Madhani等，细胞(Cell)，91：673-684(1997))。

为测试AtNHX1同系物，可以采用在R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999)中描述的相同菌株和条件。然而，也可采用其它方法。当涉及到细胞膜AtNHX1同系物时，测定培养基的pH条件可能非常关键。

结果

A.Thaliana功能获得突变体基因AVP1-D的过表达增加了酵母细胞内解毒能力(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999))。据假设(虽然本发明者不局限于此假设)后者是由于氢离子增加流入液泡室，从而通过Nhx1交换体改善钠离子隔离。

从酵母阳离子隔离研究获得结论

上述酵母研究为前液泡pH值对酵母细胞内钠离子隔离的重要性提供了证据。植物H⁺-焦磷酸酶(Avp1)的过表达，仅在那些含有有功能的氯离子通道(Gef1)和钠离子/氢离子交换体(Nhx1)的系中，才赋予酵母盐耐受性。

这些资料支持Nhx1钠离子/氢离子交换体与液泡ATP酶和GEF1阴离子通道协同作用以将阳离子隔离于前液泡室的模型。一些研究提示前液泡室可来源于细胞膜和晚期高尔基体。这些小泡很可能参与液泡的组装或者运输负荷到细胞器。可以合理预期，这些前液泡小泡通过隔离来对阳离子进行解毒，由此降低其在细胞质和其它细胞器中的浓度。

本文描述的酵母体系允许对不同的异源蛋白的盐耐受性进行功能性评估∷氯离子通道、氢离子泵、钠离子/氢离子交换体、和其它阳离子/氢离子交换体、或者阳离子/碳酸氢盐同向转运蛋白(symporters)。该***既稳定又操作灵活。拟南芥氯离子通道(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050(1998)；M.Hechenberger等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271：33632-33638(1996))、氢离子泵、和钠离子/氢离子交换体的功能都可以在相应的酵母突变体中进行分析。虽然AtNHX1不能抑制所有的酵母nhx1突变体表型，但是它可以抑制某些表型以及与AtNHX1和酵母NHX1之间的DNA同源性偶联这一事实，表明此植物基因与酵母同系物具有类似的功能。AtNHX1基因可以抑制nhx1突变体对潮霉素的敏感性但仅提供微弱的钠离子解毒表型，这可能是该转运蛋白在两种生物中具有不同的调控、或者具有不同的阳离子转运选择性的结果。

盐对AtNHX1的调节以及植物基因抑制酵母nhx1突变体的能力表明，在酵母和植物中阳离子解毒的机制可能是类似的。实际上，以前的工作表明，细胞膜钠离子/氢离子反向转运载体可介导耐盐植物中液泡内钠的积累，该反向转运载体利用由液泡H⁺-ATP酶(V-ATP酶)和/或氢离子转运焦磷酸酶(V-焦磷酸酶；B.J.Barkla等，Symp.Soc.Exp.Biol.，48：141-153(1994)；R.G.Zhen等，《焦磷酸能驱动的在液泡膜的质子转运的分子和生化基础》(The Molecular and Biochemical Basis ofPyrophosphate-Energized Proton Translocation at the VacuolarMembrane)(学术出版社，圣地亚哥)；M.Kirsh等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，32：543-547(1996))产生的质子驱动力。

本文描述的发现，即gef1和nhx1突变体都对潮霉素超敏感，表明对潮霉素的抗性程度依赖于液泡和前液泡细胞器的功能。钾离子摄入受到损害的酵母突变体(rek1)对潮霉素超敏感(R.Madrid等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：14838-14844(1998))；降低的钾离子摄入超极化细胞膜位并驱动碱性阳离子如潮霉素的摄入。降低细胞膜H⁺-ATP酶(Pmal)的氢离子泵性活性的突变使得细胞膜电位去极化并赋予对潮霉素的抗性(J.H.McCusker等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，7：4082-4088(1987))。因此，可以预期影响液泡和前液泡室的pH或膜电位的突变体如gef1或者nhx1会影响潮霉素的区室化(compartmentation)。

具有上调液泡氢离子转运泵活性的转基因植物

拟南芥AtNHX1基因的表达在盐应激植物中被诱导这一观察结果进一步支持拟南芥AtNHX1基因在盐体内稳态中的作用(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999))。特别是，拟南芥(Arabidopsisthaliana)已用来作为宿主植物模型以说明这些基因的过表达导致植物中的盐耐受性。近期的一项研究报道表明，在转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物中AtNHX1基因的过表达促进了该植物在土壤中的持续生长，该土壤以200mM氯化钠加上1/8MS盐灌溉并采用短日照周期条件(M.Apse等，科学(Science)，285：1256-1258(1999))。值得注意的是，每加入1/8MS盐则提供2.5mM钾，这降低了氯化钠应激的严厉程度，并且短日照周期降低了氧化性应激。

实施例5：在盐应激植物中AtNHX1基因的增强的表达

材料和方法

在19℃和连续光照条件下，A.thaliana植物(ecotypeColumbia)无菌培养于无蔗糖的基本(unsupplemented)植物营养琼脂上(G.W.Haughn和C.Somerville，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)，204：430-434(1986))15天。添加氯化钠或氯化钾至终浓度250mM，然后培育植物6小时。从经盐处理的和未经盐处理的植物组织中分离总RNA(K.K.Niyogi和G.R.Fink，植物细胞(Plant Cell)，4：721-733(1992))，Hybond-N(Amersham公司)膜以来自质粒pRG308的³²P标记的DNA探针杂交。65℃杂交过夜。在65℃下用0.2％标准柠檬酸缓冲液(SSC)/0.1％SDS进行洗涤(F.Ausebel等，分子生物学最新方法(Curr.Protocols in Mol.Biol.)(Wiley，纽约)(1988))。以18S探针作为上样量对照(loading control)(I.Unfried等，核酸研究(NucleicAcids Res.)，17：7513(1989))。用MACBAS 2.4程序来确定RNA的相对含量。

结果

氯化钠应激增加AtNHX1 mRNA.水平4.2倍，而氯化钾仅促使增加2.8倍。此种由钠引起的mRNA水平升高与酵母NHX1基因的情况类似(R.Nass和R.Rao，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273：21054-21060(1998))。RNA组织印迹(tissue blot)以AtNHX1杂交。来自15天龄植物(暴露于250mM氯化钠或氯化钾6小时)和未经盐处理的对照植物的10微克总RNA，在变性甲醛凝胶上进行电泳。该印迹以AtNHX1 ORF(可译框架)内部探针进行杂交。以18S核糖体探针作为上样量对照。

实施例6：过表达AtNHX1的转基因植物的盐耐受性

过表达AtNHX1的转基因植物在用200mM氯化钠灌溉的土壤中表现出持续生长(M.Apsem等，科学(Science)，285：1256-1258(1999))。

实施例7：过表达35SAVP1的转基因植物的盐耐受性

材料和方法

用35S启动子的双串联增强子来设计转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物，以过表达AVP1野生型基因(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，15：5890(1987))。AVP1编码来自拟南芥的焦磷酸驱动的液泡膜质子泵(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997))。先前的研究表明，AVP1基因是以单拷贝存在于拟南芥的基因组中(Y.Kim等，植物生理学(Plant Physiol.)，106：375-382(1994))，然而，一个与染色体上AVP1同源但不相同的序列已被拟南芥基因组发起者(AGI)暂时称为在BAC F9K20上的可译框架F9K20.2。

利用农杆菌介导的植物转化产生了过表达AVP1的转基因植物。利用CaMV的35S启动子的双串联增强子来表达转基因AVP1(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，15：5890(1987))。将15株野生型和15株35SAVP1转基因株于24小时周期培养16天。在此期间，植物每4天以稀释的营养液(1/8M.S.盐)浇灌一次。在17天时，浇灌液中添加200mM氯化钠，并且在第27天时以含有250mM氯化钠的营养液浇灌。在最后的氯化钠处理10天后，对植物照像。采用实施例6所述的相同的条件和处理。

结果

在T2(第二代)阶段，与野生型植株相比较，5个不同系的35SAVP1植株表现出增强的盐耐受性。然而，最引人注目的表型在纯合的T3(第三代)植株中是明显的。这些转基因植物比野生型植物大。并且，纯合的35SAVP1植物，在24小时光照状态和存在250mM氯化钠加上1/8M.S.盐的条件下，表现出持续生长。当35SAVP1植物在短日周期条件(12小时/天/光照周期)下生长时，可观察到其在300mM氯化钠加上1/8M.S.盐存在下持续生长。

实施例8：野生型植株和35SAVP1转基因植株在水栽培养用溶液中的生长

标准农业用淡水来源的减少可能迫使采用其他的农业技术。可以设想，对于耐盐作物，要用海水水栽将在作物生产上创造新的时代。据报道，水培增加了植物的生长并提供无应激的根和芽材料(D.M.Gibeaut等，植物生理学(Plant Physiol.)，317-319(1997))。水培的另一个重要优点是它使得人们以比在土壤中更精确的方式改变离子成分。这些优点对盐应激(salt stress)的生理学研究可能是重要的。

建立了拟南芥植物的水培条件，并且测试了其在氯化钠浓度增加的培养基中的性能。

材料和方法

在一次试验中，野生型和35SAVP1转基因植物进行水培。野生型和35SAVP1转基因植物生长在溶液培养物中，在12小时光周期下培养65天。

在另一个试验中，野生型和35SAVP1转基因植物生长在溶液培养物中，在12小时光周期下培养20天。从第21天起，逐渐增加氯化钠浓度，采用每4天增加50mM的方式。在存在200mM氯化钠4天后，将植物拍照。

而且又一个水培试验中，给予(challenge)转基因植物商业用海水配方，其中包括海水中全部的离子成分。35SAVP1、35SAtNHX1单转基因和双转基因植物与野生型拟南芥thaliana植物一同在短日照周期和水培条件下生长4周(D.M.Gibeaut等，植物生理学(Plant Physiol.)，317-319(1997))。然后每4天添加等同于50mM氯化钠的热带海洋海盐(网址：thatpetplace.com)。这种人工海水混合物包括存在于真正海水中的所有其它主要和微量元素。监测生长并可监测生理参数，例如，钠含量和分布。

结果

当野生型和35SAVP1转基因植物进行水培时，两者的根、叶、和茎的尺寸存在显著的差异，其中35SAVP1转基因植物部分要大得多。

当逐渐增加氯化钠浓度、每4天增加50mM时(M.Apse等，科学(Science)，285：1256-1258(1999))，在200mM氯化钠存在下35SAVP1转基因植物表现得很健康，而野生型对照在它们的叶和茎则表现出严重的损害效果。

35SAVP1、35SAtNHX1单转基因和双转基因植物与野生型拟南芥thaliana植物一同在短日照周期和水培条件下生长4周(D.M.Gibeaut等，植物生理学(Plant Physiol.)，317-319(1997))，然后每4天添加等同于50mM氯化钠的热带海洋海盐。研究发现，35SAVP1、35SAtNHX1单转基因和双转基因植物在海盐溶液中的生长状况好于野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物。

实施例9：在西红柿植物中，过表达拟南芥(Arabidopsisthaliana)质子转运蛋白的效果

可以检测过表达这些拟南芥(Arabidopsis thaliana)质子转运蛋白(AVP1和AtNHX1)在农业上更重要的植物—西红柿植物中的作用。人们相信，增加西红柿植物的盐耐受性很可能会具有重要的经济影响。

可以分离AVP1和AtNHX1的西红柿同源物，并可以构建使它们高表达的相应嵌合体(S.Bidone等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，253：20-26(1998)；A.Burbidge等，实验植物学杂志(J.Exper.Botany)，48：2111-21112(1997))。这些基因可以通过农杆菌介导感染导入愈伤组织。可以运用组织培养技术来再生转化植物。可以检测植物的盐耐受性以及生理学参数，例如钠含量和分布。

可以用35S AVP1和用35S AtNHX1组件进行西红柿转化(S.McCormick，“用根癌土壤杆菌转化西红柿”(Transformation oftomato with Agrobacterium tumefaciens)，在K.Lindsey编辑的《植物组织培养手册》(Plant Tissue Culture Manual)一书中，PP.1-9，Kluwer学术出版社，Dordrecht，荷兰(1991))。可以通过聚合酶链反应和DNA凝胶印迹分析T0和T1转基因植物中AVP1和AtNHX1转基因的存在和拷贝数。在T1的种子中，经过每一个后代的分离分析，可以鉴定杂合子和纯合子植株。可以分析纯合子植株的盐耐受性以及生理学参数，例如钠含量和分布。可以设计基于存在于AVP1和AtNHX1同系源物中的保守序列的退化寡核甘酸(oligous)。这些退化引物可以用于与cDNAs的RT-PCR反应，其中cDNAs是从西红柿的含聚腺苷酸的核糖核酸(poly(A)+RNA)制成。产生的PCR片段可以用作探针来从商业文库中分离全长的cDNA克隆(即Stratagene产品号936004)。Caboche和合作者描述了类似的策略(A.Quesada等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，34：265-274(1997))。

结果

阳性试验结果可能表明，本文描述的隔离模型也可应用于重要的农作物。

图7是种植于含盐分高的土壤中的野生型植株(WT)对过表达AVP1(1’和2’)的代表性的转基因植株中的钠离子和钾离子含量图。五株野生型植物(WT)和两株AVP1过表达转基因系(1’和2’)植物在10小时明暗周期下种植于土壤。以稀释的营养液(1/8MS盐)浇灌植物6星期，然后以添加了氯化钠的稀释营养液浇灌。Nacl初始浓度为100mM，并每4天增加50mM。照片对应于在第10天的植物，其时存在300mM氯化钠。在存在200mM氯化钠24小时后，收获地面之上的植物部分并称量其新鲜重量(fresh weigh)。在75℃下48小时后，称量其干重。通过原子吸收测定钠离子和钾离子含量。图4中的数值是平均值+/-SE(标准误差)(n＝4)。如从图中可见看到的，转基因系(1’和2’)中的钠离子和钾离子含量显著高于野生型对应物中的钠离子和钾离子含量。

图8是钙摄入图4中2’的35SAVP-1转基因液泡膜小泡(方块)对钙摄入图4中野生型(WT)的小泡的曲线图。野生型植株(空心圆(open circles))和来自图4的2’系的转基因植物在10小时光周期下水培9周。液泡膜小泡加入缓冲液中，该缓冲液包括250mM山梨醇、25mM pH8.0的BTP-Hepes、50mM氯化钾、1.5nM硫酸镁、和10μM二价钙离子。在加入200μM焦磷酸前，该混合物在20℃下保温10分钟，以启动反应。加入钙离子载体A23187至终浓度5μg/ml，以消散钙离子梯度。在指定时间过滤等分试样(200μl)，并如(11)所述以冷缓冲液洗涤。如图可见，来自2′系的转基因植物比野生型植物具有更大的钙摄取。

上述数据与以下假说一致：过表达AVP-1的转基因植物在其细胞膜具有增强的氢离子泵性能力，并且通过氢离子驱动的离子转运蛋白的作用增强的氢离子供给导致液泡中更高的离子积累。为进一步支持该理论，测定了野生型和转基因液泡膜小泡的钙离子摄取能力。

有许多文件证明，钙离子通过钙离子/氢离子反向转运载体进入植物液泡(K.S.Schumaker、H.Sze，植物生理学(PlantPhysiol.)，79，1111-1117(1985))。此外，编码拟南芥(A.thaliana)钙离子/氢离子反向转运载体CAX1和CAX2的基因已被分离并表征(K.D.Hirschi、R.-G.Zhen、K.W.Cunningham、P.A.Rea、G.R.Fink，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93，8782-8786(1996))。图8表明，在35SAVP-1转基因液泡膜小泡中钙摄取较来自野生型的小泡高36％。运用钙离子载体A23可将45钙离子的计数降至本底水平，这表明该小泡的密闭性(图8)(K.S.Schumaker、H.Sze，植物生理学(PlantPhysiol.)，79，1111-1117(1985))。

虽然不局限于此理论，但在图9A和9B中描述了与过表达AVP-1基因的转基因植物的增强的干旱和冻害耐受性相一致的模型。该模型描述：在转基因植物的液泡中AVP-1泵数量的增加如何能够提供更多的氢离子，使得次级转运蛋白可以输入更多的阳离子进入液泡腔。更高数量的阳离子赋予更大的渗透压(见图14)，其导致植物更高的保留水的能力，这帮助植物抵抗土壤的低水势。

实施例10：具有35S AVP1和35S AtNHX1的双重转基因植物

焦磷酸驱动的液泡膜质子泵AVP1的过表达很可能会增加液泡腔内的氢离子可获得性，而AtNHX1钠离子/氢离子反向转运载体利用这些氢离子，以将钠离子隔离在液泡内。因此，这些转运蛋白的较高表达很可能将液泡的隔离能力最大化。

为产生过表达AVP1和AtNHX1两种基因的转基因拟南芥植物，可将T3 35S AVP1植物作为母本并将T3 35S AtNHX1植物作为父本。母本植株可经手工去雄，并收获来自供体植物的新鲜的花药。用这些花药，通过使花药与柱头接触，则可以给去雄的植物授粉。授粉的花可做标记，并将同一雌株上的任何留下的已开或未开的花去除，以避免收获时的任何混淆。收获的种子应使用50％的次氯酸钠液灭菌并剧烈混合5分钟，然后用水充分洗涤。经灭菌的种子可在4℃下保存在软琼脂中过夜。然后可将它们散种于凝固的卡那霉素-潮霉素选择培养基。该35S AVP1组件含有新霉素磷酸转移酶II基因，其赋予植物卡那霉素耐受性，而35S AtNHX1组件含有经修饰的潮霉素B磷酸转移酶，其赋予植物潮霉素耐受性。抗性的苗可以移植到土壤以及水载培养基中以检验它们的耐盐表型。

利用上述35A启动子的相同的双串联增强子(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，15：5890(1997))可以设计过表达A.thaliane功能获得突变体基因AVP1-D的转基因拟南芥(Arabdopsis thaliana)植物(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997))。过表达功能获得突变体基因的植物将可能表现出增强的表型。这些植物可以与35SAVP1、35S AtNHX单和双转基因植物同时进行表征。A.thaliana的功能获得突变体基因AVP1-D可以亚克隆进携带有35S启动子和CaMV的聚腺苷酸化信号的pRT103质粒(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，15：5890(1987))。含有嵌合35SAVP-D基因的HindIII片段可以亚克隆进pBIBhyg(D.Becker，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，18：203(1990))。生成的T-DNA(转化DNA)载体可以通过电穿孔转化进入根癌农杆菌GV3101株，并且可以用于后面的A.thaliana ecotype Columbia的真空渗入(infiltration)(N.Bechtold等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，316：1194-1199(1993))。可通过T3植物的DNA印迹和在阳性T3植物的RNA印迹上检测的表达来证实整合。

实施例11：野生型和35SAVP1转基因植物的根液泡的转运比较研究

可进行研究以确定35S AVP1转基因植物的液泡是否表现出依赖于焦磷酸的高更的质子转运活性。这些测定可用分别来自水培植物的根和芽组织进行。该转基因可表现出组织特异性调控，与35S启动子无关。

为比较野生型和35S AVP1转基因植物的焦磷酸依赖的氢离子转运活性，可以制备来自上述植物的根和叶的密封的富含液泡膜的小泡。可采用Rea和Turner所描述的均化和差速离心程序(P.A.Rea等，“液泡膜ATP和无机焦磷酸酶”(TonoplastAdenosine Triphosphate and Inorganic Pyrophosphatase)，在《植物生化方法》(Meth.Plant Biochem)一书中，pp.385-405，学术出版有限公司，伦敦(1990))。在含有液泡膜富集小泡的分析介质中，可用吖啶橙(2.5μM)作为跨膜pH差异指示剂来荧光分析氢离子转运(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，272：22340-22348(1997))。该分析介质含有300μM的三羟甲基氨基甲烷-焦磷酸(Tris-PPi)、50mM的氯化钾、2.5μM的吖啶橙、5mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)-Mes(2-(N-吗啉)-乙基磺酸？)(pH8.0)。可添加1.3mM硫酸镁来启动囊泡内的酸化，而用添加质子载体FCCP(羰基氰对三氟甲氧基苯腙)至2.5μM来终止反应。可分别在495和540nM的激发发射波长测量荧光，其中采用5nM的狭缝宽度(R.G.Zhen等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，269：23342-23350(1994))。可用添加特异性抑制剂氨基亚甲基二膦酸(aminomethylenediphosphonate)的进一步试验来支持氢离子转运是AVP1驱动的观点(R.G.Zhen等，植物生理学(Plant Physiol.)，104：153-159(1994))。

实施例12：检测转基因植物的叶和茎中的钠离子/钾离子比例

氯化钠的毒性浓度首先在充分展开的叶中积累，其中氯化钠被区室化于液泡中。暴露于氯化钠可干扰或减少钾离子摄取，这导致钾离子缺乏和生长抑制(S.J.Wu等，植物细胞(Plant Cell)，8：617-627(1996)。减少的钾离子含量和较高的钠离子含量的细胞溶质后果是抑制重要的酶。.这些酶的例子是酵母的3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶，当钾离子含量较低时，其活性对钠离子更加敏感(J.R.Murguia等，科学(Science)，267：232-234(1995))。

可进行测量来验证本文所述的转基因植物具有增强的将钠离子隔离在其叶细胞或其它地方的液泡能力。为检测叶和茎中钠离子/钾离子的比例，可水培野生型和35S AVP1/35S AtNHX1双和单转基因植物(D.M.Gibeaut等，植物生理学(Plant Physiol.)，317-319(1997))。可逐渐将氯化钠加入生长培养基(growthmedia)，从50mM开始，直至250mM(M.Apse等，科学(Science)，285：1256-1258(1999))。在每一时间点.可收集经处理植物的莲座叶丛和茎，并称重。样本应在80℃烘箱中干燥并称量其干重。该干燥样本应于确定体积的水中煮沸，并通过原子吸收分光光度法测定其钠离子和钾离子含量(M.Apse，等，科学(science)，285：1256-1258(1999)；R.Gaxiola等，EMBO杂志(EMBO J.)，11：3157-3164(1992))。

实施例13：确定35S AVP1转基因植物更大的原因是否是由于其细胞更大或由于其具有更多的细胞，亦或兼而有之

芽分生组织标记指数可与野生型植物的芽分生组织标记指数进行比较。可进行形态和解剖观察，即测量和计数叶、根、和茎的细胞。为确定35S AVP1转基因植物是否因为其具有更多的细胞而更大，可将它们的芽分生组织标记指数与野生型的芽分生组织标记指数相比较。

为测定DNA合成或细胞增值，可采用5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)，其可以代替胸苷掺入DNA。在DNA中掺入了5-溴-2’-脱氧尿苷的细胞可用抗5-溴-2’-脱氧尿苷单克隆抗体的单克隆抗体和抗小鼠Ig(免疫球蛋白)-碱性磷酸酶作为第二抗体来检测。结合的抗5-溴-2’-脱氧尿苷的单克隆抗体可用光学显微术目视观察，并建立二脒基苯基吲哚(DPAI)着色的和5-溴-2’-脱氧尿苷正片(positives)之间的比例。此方法是Chiatante和合作者所发表方法(M.Levi等，植物生理学(Physiol.Plant)，71：68-72(1987))和5-溴-2’-脱氧尿苷标记和检测试剂盒II(来自Boehringer Mannheim公司)的改进。该植物可暴露于5-溴-2’-脱氧尿苷标记的培养基不同的时间，然后可进行固定、石蜡包埋、和切片，如Meyerowitz和合作者所描述的(G.Drews等，植物分子生物学报道(Plant Mol.Biol.Rep.)，5：242-250(1998))。

为观察叶组织，新鲜组织可包埋于5％的琼脂糖中，并用显微切片刀对其切片。对初步根观察而言，苗可于室温在50％乙醇、5％乙酸、和3.7％甲醛中固定4小时，在分级乙醇系列中脱水，用二甲苯对其渗透，再浸以石蜡。.8微米的切片可用0.05％甲苯胺蓝染色，并可在显微镜下对细胞进行计数。作为目视观察和确定细胞大小的替换方法，可采用Greenberg和合作者所描述的方法(Rate等，植物细胞(The Plant Cell)，11：1695-1708(1999))。

结果

通过显微镜观察表明，转基因拟南芥植物的细胞并不更大，但其细胞数较野生型更多。肉眼观察发现，在AVP-12′系中，在莲座叶丛中比野生型平均多8片叶。F1植物是通过转基因植物株系1’和2’的杂交而产生，其莲座叶丛比野生型植物具有更大和数目更多的叶子。图10是野生型和过表达AVP1的转基因(1’和2’)拟南芥植物的叶子，这些植物在20℃并在16小时的全白荧光/8小时暗周期下生长。当植物开始抽苔时，用解剖刀小心地将描述的叶切下(sectored)，然后按大小排列以供比较。虽然转基因植物比野生型植物具有更大和更多数目的叶子，但未见转基因植物有更大的细胞。这些资料与下述假说相一致：在AVP-1过表达的转基因植物中分生活性更高。

水培转基因拟南芥植物的干重，当与相似生长情况下的野生型植物比较时，进一步表明细胞质量的增加与植物水摄取的任何增加无关。在根、莲座叶丛、和茎结构中可以看到质量干重(drymass weight)的增加，如下面的表1所示，其中数值为6株植物的平均值。

                        表1

           水培养的拟南芥植物部分的干重

植物部位	野生型(WT)	1’转基因株	2’转基因株
				相	0.03克	0.05克	0.14克
莲座叶丛	0.10克	0.20克	0.60克
				茎	0.40克	0.50克	0.80克

实施例14：AVP-1的过表达对激素活性的影响

可通过激素的增多与AVP-1过表达同时作用来产生增加的分生活性和/或芽的器官发生。

为判定过表达AVP-1对激素活性的影响，小心地用解剖刀从野生型和过表达AVP-1的转基因(1’，2’)拟南芥植物剪下真叶。平皿中将叶放置于蒸馏水饱和的5层滤纸上。该平皿于20℃在冷白荧光下并在16小时光照/8小时暗周期下培育。从图11A(在平皿中的叶子)和11B(来自图11A平皿中的叶子，进行放置从而更清楚地描绘发育自叶子的根结构)可以看到，转基因植物的叶子依然更绿并具有增强的生根能力。增强的生根能力表明，增加的植物生长素含量和延缓的衰老与增加的细胞***素水平相一致。

实施例15：AVP-1的过表达对矮牵牛外植体中愈伤组织诱导的影响

方法

矮牵牛外植体培养于MS培养基，其包括MS盐(Gibco BRL公司)、添加1mg/L的烟酸、1mg/L的盐酸吡哆酸(pyrodoxinHCl)、1mg/L的硫胺素、100mg/L的肌醇、3％蔗糖、1mg/L的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、和0.5mg/L的6-BA(6-苄氨基嘌呤)。该培养基在高压灭菌前用0.7％琼脂凝固，并调节pH值至5.8。该培养物在培养箱中于25℃并在黑暗中培养。

结果

如图15所示，转基因矮牵牛外植体(35-S AVP-1)在培育6周后，表现出明显增强的愈伤组织诱导。

实施例16：AVP-1的过表达对叶片段中芽再生的影响

已知生长于适当培养基中的叶片段可以产生芽的生长。进行了研究以确定35-S AVP-1的过表达对矮牵牛叶片中芽再生的影响。

来自再生转化(35-S AVP-1)和对照矮牵牛的叶片被用作芽再生的外植体。用锋利的手术刀片将叶切成约1厘米宽的片。该外植体培养于MS培养基中，该MS培养基包括MS盐(Gibco公司)、B5维生素(1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆酸、1mg/L硫胺素、和100mg/L肌醇)、3％蔗糖、2mg/L 6-苄氨基嘌呤、和0.01mg/L萘并吡咯酸(naptnaleneacitic acid)、0.7％琼脂，pH5.8。该培养的片段在冷白荧光、25℃下，并在16小时光照/8小时黑暗周期下培养。

如图12所示，在组成型启动子下用AVP-1基因(35S AVP-1平皿)转化的矮牵牛叶，表现出较野生型矮牵牛叶片段(WT)具有更强的芽再生能力，这与转基因拟南芥植物的结果类似。这些结果与下述观点一致：此液泡质子泵的过表达将改善任何植物的芽再生能力。

用AVP-1可译框架作为探针进行的同源性比较分析(blastearch)表明，此基因非常保守(稻谷＝86％同一性；烟草＝89％同一性；大麦＝86％同一性；葡萄＝82％同一性；大麦＝86％同一性(校：重复)；和玉米＝90％)。后者表明，AVP-1基因的过表达在其它植物类型中会类似地产生这样的结果。

实施例17：AVP-1的过表达对拟南芥子叶的芽和根再生的影响

已知用合适的培养基，芽和根可由子叶再生。针对野生型(WT)和AVP-1转基因拟南芥(1’和2’)，鉴定了来自子叶的芽和根再生。

5日龄的子叶用作再生的外植体。外植体培养于芽诱导培养基(SIM)，培养条件为20℃、16小时光照/8小时黑暗周期。该SIM包括MS盐(Gibco公司)、B5维生素(包括1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆酸、1mg/L硫胺素、和100mg/L肌醇)、3％蔗糖、1mg/L 6-(γ，γ-二甲烯丙基氨基)嘌呤核苷(6-(gama-gama-dimethylallylamino)purine riboside)(2-磷酸)、和0.1mg/L萘并吡咯酸，并用0.7％琼脂凝固。把培养基的pH调至5.8。在高压灭菌后，对2-磷酸(2-iP)过滤灭菌并加入该培养基中。

如在图13A和13B所见，来自转基因植物(1’和2’)的外植体再生芽和根的频率高于以及时间早于野生型(WT)，这与更高的分生组织感受态相一致。转化子叶和野生型子叶之间差异的证据在23天(图13A)非常明显，而在培养后37天更加明显(图13B)。

实施例18：AVP-1的过表达对来自拟南芥植物的根和子叶外植体的芽再生的影响

把来自野生型(WT)和转基因(1’和2’)AVP-1过表达 拟 南芥植物的根和子叶(5日龄)外植体置于芽诱导培养基中，如在实施例16中所述。如图6所示，来自转基因植物(1’和2’)的外植体早于野生型产生新结构，这与更高的分生组织感受态相一致。

实施例19：在转运蛋白中突变体的分离

在分析复杂生物性状方面，基因学方法非常有效(R.Serrano等，植物科学评论(Crit.Rev.Plant Sci.)，13：121-138(1994))。对于植物生物学家来说，反向遗传学是非常重要的新工具。由Sussman和合作者制备的一系列标记敲除系(P.Krysan等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93：8145-8150(1996))为分析拟南芥的遗传紊乱(gene disruption)打开了非常重要的途径。

威斯康星麦迪逊大学的拟南芥敲除设施(网址：biotech.wisc.edu/NewServicesAndResearch/Arabidopsis)可用来在60，480个拟南芥(ecotype WS)系(其已用T-DNA载体pD991进行转化)中搜寻在AtCLC-c、AtCLC-d、AVP1、AtNHX1及其同源物内的T-DNA***片断。上述基因敲除的植物的表型将为理解这些转运蛋白在正常和应激情况下的生理作用提供线索。基因敲除植物的初级表征包括检测其盐耐受性和其钠离子/钾离子比例。通过杂交产生的双重敲除植物有助于进一步了解转运蛋白之间的相互作用以及与35S AVP1和35S AtNHX1转基因植物的杂交。

为搜寻拟南芥基因敲除，可参照威斯康星大学网站详细说明的指导设计PCR(聚合酶链反应)引物。可将测试引物送到威斯康星大学麦迪逊分校，其中可以进行62个PCR反应，其是送给我们用于DNA印迹分析。将阳性PCR产物测序。如果该序列表明有T-DNA***该基因，则此基因特异性引物用另一组PCR反应以确定225个中的9个可能库的哪一个含有该基因敲除(knockout)。当鉴定了感兴趣的库后，将筛选扫描25管种子以寻找携带T-DNA敲除的植株。

实施例20：植物细胞中的阳离子解毒

本文描述的研究结合其它证据有利地说明，酵母和植物具有相同的从高尔基体网转运小泡到液泡的途径和信号(R.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999)；F.Marty，“液泡的生物发生：来自显微镜的观察”(“The Biogenesis of Vacuoles：Insights from Microscopy”)，发表于《植物液泡》(The Plant Vacuole)，1-42，R.A.Leigh和D.Sanders，学术出版社，圣地亚哥(1997)；D.C.Bassham等，植物生理学(Plant Physiol.)，117：407-415(1998))。

不希望为理论所局限，本发明者多半相信，在两个***中，前液泡室是动态的实体，它可以解毒细胞质中的阳离子，并将其负荷(cargo)运输至液泡或直接到细胞外。gef1氯离子通道和Nhx1钠离子/氢离子交换体都被定位于酵母前液泡室(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96：1480-1485(1999))。已监测gef1-GFP嵌合体在活体酵母细胞内的行为，表明其定位随环境条件而变化。此外，已表明4种A.thaliana CLC氯离子通道基因中的两种CLC-c和CLC-d可以抑制gef1突变表型，这暗示相似的定位(R.A.Gaxiola等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95：4046-4050(1998))。

为了探明在植物细胞中这种阳离子解毒作用如何及在何处发生，可在体内监测AVP1、AtNHX1、和AtCLC-c和-d的GFP(绿色荧光蛋白)嵌合体的细胞内定位(B.Hong等，植物生理学(Plant Physiol.)，119：1165-1175(1999))。也可用共焦显微镜来确定不同转运蛋白的共定位。为达到此目的，需要所研究转运蛋白的HA标记的变体(versions)或抗体(Guiltinan M.J.等，细胞生物学方法(Meth.Cell Biol.)，49：143-151(1995)；JauhG.-Y.等，植物细胞(Plant Cell)，11：1867-1882(1999)；MullenR.T.等，植物杂志(Plant J.)，12：313-322(1997))。

为构建GFP嵌合体，可采用Davis和Viestra报道的在拟南芥(A.thaliana)中具有改善荧光的可溶性GFP变体(versionsGFP)(S.J.Davies和R.D.Viestra，用于拟南芥(Arabidopsisthaliana)的绿色荧光蛋白(GFP)的可溶性衍生物，网址http：//brindabella.mrc-lmb.cam.ac.uk/IndexGFP.html(1998))。可得到两种类型的GFP嵌合体，即一种由天然启动子调控，另一种由35S启动子调控。通过电穿孔，将生成的含有GFP嵌合体的T-NDA载体转化入根癌农杆菌GV3101菌株，并用于随后的拟南芥(Arabidopsis thaliana)ecotype Columbia的真空渗入(Bechtold N.等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，316：1194-1199(1993))。为标记血细胞凝集素(HA)抗原表位，可采用PCR策略，该策略是为酵母而设计，但经改造可用于标记在酵母载体中表达的的植物基因。Futcher和合作者设计了含有URA3酵母基因的载体，该基因被抗原表位标记(HA)的同向重复单位翼侧包围(B.L.Schneider等，酵母(Yeast)，11：1265-1274(1995))。通过PCR，该标记-URA3-标记盒可以扩增，从而生成的PCR片段在每个末端与目的基因具有同源性。然后可利用酵母中的体内重组，来引导PCR-嵌合体整合入含有植物目的ORF(可译框架)的质粒，用URA⁺(鸟嘧啶野生型)表型选择转化体。当阳性转化体在5-氟乳清酸存在下培养时，URA3基因可被“剔除”。携带该植物基因的载体具有与URA3基因不同的选择标记。

总之，在经济上重要的作物中，对液泡焦磷酸酶的操作可为作物改善提供重要的途径。耐旱和耐冻害的植物可为由于干旱或极少降雨而荒废的地区提供新的耕作方法，以及为农民提供保护，使其免受未曾预期的冻害(冻雨等)的影响。这类作物还可能生长于对于野生型作物来说盐分过高的土壤中。

虽然本发明已经参考其优选的具体实施例而加以描述，但是对于本领域技术人员来说，可以做多种的改变和/或修改，而不偏离本发明的精神或范围。所有这些改动均在所附的本发明专利申请权利要求范围内。所有在本说明书中引用的参考文献结合于此作为参考文献。

Claims (74)

1.制造具有提高的分生活性的转基因植物的方法，包括将可以改变所述植物中液泡焦磷酸酶表达的外源核酸引入植物的一个或多个细胞，来增加液泡焦磷酸酶活性，并在所述植物中产生转化细胞，由此产生具有提高的分生活性的转基因植物。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择具有提高的分生活性的转基因植物，由此产生具有改善的分生活性的转基因植物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述外源核酸编码AVP1或其同源物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于为过表达AVP1而设计的组件中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组件包括所述AVP1基因或AVP1同源物，是可操作连接于嵌合启动子，所述启动子是为过表达AVP1或其同源物而设计。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作连接于嵌合启动子，所述嵌合启动子选自由组织特异性启动子、组成型启动子、诱导性启动子、和其组合组成的组。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作连接于35S启动子的双串联增强子。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于野生型植物。

9.根据权利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于转基因植物。

10.根据权利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于突变体植物。

11.根据权利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成获得。

12.根据权利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成获得。

13.通过根据权利要求1所述的方法产生的转基因植物。

14.制造具有提高的分生组织活力的转基因植物的方法，包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的外源核酸引入植物的一个或多个细胞，来增加在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，并在所述植物中产生转化细胞，由此产生具有提高的分生组织活力的转基因植物。

15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择具有提高的分生活性的转基因植物，由此产生具有改善的分生活性的转基因植物。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述外源核酸编码AVP1或其同源物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于为过表达AVP1而设计的组件中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组件包括所述AVP1基因或AVP1同源物，是可操作连接于嵌合启动子，所述启动子是为过表达AVP1或其同源物而设计。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作连接于嵌合启动子，所述嵌合启动子选自由组织特异性启动子、组成型启动子、诱导性启动子、和其组合组成的组。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作连接于35S启动子的双串联增强子。

21.根据权利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于野生型植物。

22.根据权利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于转基因植物。

23.根据权利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于突变体植物。

24.根据权利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成获得。

25.根据权利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成获得。

26.制造具有提高的生物量的转基因植物的方法，包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的核酸组件引入植物的一个或多个细胞，来增加在所述细胞中的液泡焦磷酸酶活性，从而产生转化细胞，由此产生具有提高的生物量的转基因植物。

27.根据权利要求26所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择具有提高的生物量的转基因植物。

28.通过根据权利要求26所述的方法产生的转基因植物。

29.制备较其相应的野生型植物具有提高的生物量的转基因植物的方法，其中所述提高的生物量涉及植物部分的所述生物量的增加，所述植物部分选自由叶、茎、根、种子、花、和果实组成的组，所述方法包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的外源核酸引入植物的一个或多个细胞，来增强在所述植物中的所述液泡焦磷酸酶的活性，从而产生转化细胞，由此产生具有提高的生物量的转基因植物。

30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择比其相应野生型植物更大的转基因植物，由此产生具有提高的生物量的转基因植物。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述外源核酸编码AVP1或其同源物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是存在于为过表达AVP1或其同源物而设计的组件中。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组件包括所述AVP1基因或其同源物，其可操作连接于嵌合启动子，所述启动子是为过表达AVP1而设计。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作连接于嵌合启动子，所述嵌合启动子选自由组织特异性启动子、组成型启动子、诱导性启动子、和其组合组成的组。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作连接于35S启动子的双串联增强子。

36.根据权利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于野生型植物。

37.根据权利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于转基因植物。

38.根据权利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于突变体植物。

39.根据权利要求29所述的方法，其中所述转基因植物是生长于土壤中。

40.根据权利要求29所述的方法，其中所述转基因植物是水生培植。

41.根据权利要求29所述的方法，其中来自所述转基因植物的细胞是生长于培养物中。

42.通过根据权利要求29所述的方法产生的转基因植物。

43.产生具有比野生型更粗的茎结构的转基因植物的方法，包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的外源核酸引入植物的一个或多个细胞，来增强在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，从而产生转化细胞，由此产生具有***茎结构的转基因植物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述茎结构是选自由木质层、树皮、和形成层组成的组。

45.根据权利要求43所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择具有***茎结构的转基因植物，由此产生具有***茎结构的转基因植物。

46.制备较其相应的野生型植物具有增加的根结构的转基因植物的方法，包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的外源核酸引入植物的一个或多个细胞，来增强在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，从而产生转化细胞，由此产生具有增加的根结构的转基因植物。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述外源核酸编码AVP1或其同源物。

48.通过根据权利要求46所述的方法产生的转基因植物。

49.制备较其相应的野生型植物具有增加的芽再生能力的转基因植物的方法，包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的核酸引入植物的一个或多个细胞，来增强在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，从而产生转化细胞，由此产生具有增加的芽再生能力的转基因植物。

50.根据权利要求49所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择具有增加的芽再生能力的转基因植物，由此产生具有改善的芽再生能力的转基因植物。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述外源核酸编码AVP1或其同源物。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于为过表达AVP1而设计的组件中。

53.根据权利要求52所述的方法，其中包括所述AVP1基因或AVP1同源物的所述组件是可操作连接于嵌合启动子，所述启动子是为过表达AVP1或其同源物而设计。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作连接于嵌合启动子，所述嵌合启动子选自由组织特异性启动子、组成型启动子、诱导性启动子、和其组合组成的组。

55.根据权利要求53所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作连接于35S启动子的双串联增强子。

56.根据权利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于野生型植物。

57.根据权利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于转基因植物。

58.根据权利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于突变体植物。

59.根据权利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成获得。

60.根据权利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成获得。

61.通过根据权利要求49所述的方法产生的转基因植物。

62.制备较其相应的野生型植物具有增加的根再生能力的转基因植物的方法，包括将可以改变液泡焦磷酸酶表达的核酸引入植物的一个或多个细胞，来增强在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，从而产生转化细胞，由此产生具有增加的根结构的转基因植物。

63.根据权利要求62所述的方法，进一步包括从所述转化细胞再生植物，以产生转基因植物并选择具有增加的根再生能力的转基因植物，由此产生具有改善的根再生能力的转基因植物。

64.根据权利要求62所述的方法，其中所述外源核酸编码AVP1或其同源物。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于为过表达AVP1而设计的组件中。

66.根据权利要求65所述的方法，其中包括所述AVP1基因或AVP1同源物的所述组件是可操作连接于嵌合启动子，所述启动子是为过表达AVP1或其同源物而设计。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作连接于嵌合启动子，所述嵌合启动子选自由组织特异性启动子、组成型启动子、诱导性启动子、和其组合组成的组。

68.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作连接于35S启动子的双串联增强子。

69.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于野生型植物。

70.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于转基因植物。

71.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是来源于突变体植物。

72.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成获得。

73.根据权利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成获得。

74.通过根据权利要求62所述的方法产生的转基因植物。

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