CN101701222A

CN101701222A - 一种编码产碱杆菌腈水解酶的基因及其用于制备扁桃酸单一对映体的方法

Info

Publication number: CN101701222A
Application number: CN200910049506A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 张志钧; 刘俊峰; 潘江
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2010-05-05
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: CN101701222B

Abstract

本发明涉及编码具有腈水解酶活性的多肽的碱基序列，涉及包含该碱基序列的载体，并涉及含有该碱基序列或载体的转化体，其中所述的载体包含该碱基序列或碱基序列与相应的信号序列相连接的组合体。本发明还涉及由该碱基序列编码的氨基酸序列。本发明另外还涉及利用该重组表达的腈水解酶作为催化剂，由相应的扁桃腈制备扁桃酸单一对映体及其类似物的技术方法。

Description

一种编码产碱杆菌腈水解酶的基因及其用于制备扁桃酸单一对映体的方法

技术领域

本发明涉及一种编码腈水解酶的碱基序列，一种含有这种碱基序列的质粒，以及由这种质粒转化而得到的转化体。本发明还涉及一种可以催化扁桃腈高效且对映选择性水解为(R)-(-)-扁桃酸的基因工程重组腈水解酶，以及使用这种酶由相应的扁桃腈制备(R)-(-)-扁桃酸及其类似物的技术方法。本发明还涉及利用这种转化体制备(R)-(-)-扁桃酸及其类似物的方法。本发明另外还涉及通过利用腈水解酶的转化体、其培养物或者其加工制品来催化扁桃腈的不对称水解制备相应的(R)-(-)-扁桃酸单一对映体及其类似物的方法。

技术背景

扁桃酸，或称α-羟基苯乙酸，是一种重要的手性合成中间体和大宗手性拆分剂，在制药行业具有广泛的用途。相对于扁桃酸的消旋体，其单一对映体(右旋或左旋的扁桃酸)的应用价值更高。因此，简洁高效、低成本的扁桃酸单一对映体的制备方法成为研究开发的热点。

(R)-(-)-扁桃酸及其类似物是一类重要的手性合成砌块，被广泛地应用于多种药物的合成。例如，作为头孢类半合成抗生素、抗肿瘤及抗衰老药物的重要中间体；也可以作为手性拆分试剂，用于拆分其他的手性药物或医药中间体。

(R)-(-)-扁桃酸的化学结构式为：

传统的化学拆分法，主要是利用手性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)-麻黄碱和辛可宁等，通过与外消旋的扁桃酸形成非对映异构体盐的方法，得到扁桃酸的单一对映体。还可利用色谱法、结晶法、膜法和超临界萃取法等物理化学方法来对扁桃酸进行对映体拆分。此外，还可利用还原剂来不对称合成(R)-(-)-扁桃酸。

最近，利用生物法合成(R)-(-)-扁桃酸正在逐渐成为研究的热点。例如，专利报道(CN 1710087，2005)以苯甲酰甲酸甲酯或苯甲酰甲酸的其它衍生物为底物，采用酵母或白地霉等微生物细胞作为催化剂，选择性地将底物中的羰基还原为羟基，从而获得以一种立体构型为主的扁桃酸单一对映体。专利(CN 1840671，2006)以筛选到的黄色短杆菌(Brevibacterium favum)AS 1.818作为催化剂，不对称转化外消旋的扁桃酸得到产物(R)-扁桃酸，产物的光学纯度可达90％e.e.以上。也有文献报道利用脱氢酶选择性降解(S)-(+)-扁桃酸而得到(R)-(-)-扁桃酸。例如，Miyamoto等(Biotechnol.Lett.，1992，14：1137-1142)利用Alcaligenes bronchisepticus拆分外消旋的扁桃酸，产率为42％，e.e.为97％。Jamaluddin等(J.Bacteriol.，1970，101：786-793)利用Aspergillus niger脱氢酶选择性氧化外消旋的扁桃酸得到光学纯的(R)-(-)-扁桃酸。Takahashi等(J.Ferment.Bioeng.，1995，3：247-250)利用Pseudomonas polyolor转化外消旋的扁桃酸，得到(R)-(-)-扁桃酸，产率为35％，e.e.为99.9％。Li GY等(Process Biochemistry，2007，42：1465-1469)利用壳聚糖固定化Saccharomyces cerevisiae来不对称还原苯甲酰甲酸为(R)-(-)-扁桃酸，产率为62％，e.e.为98％。

然而，上述公开报道的方法一般仅限于实验室规模，还不适用于工业化生产(R)-(-)-扁桃酸，主要是由于还原催化剂或拆分试剂价格昂贵，物理化学方法技术要求严格，而在生物化学方法中需要先合成其转化的前体，其步骤相当繁琐且反应条件剧烈，对生态不够友好，同时还需要消耗昂贵的辅酶。

腈水解酶能够催化有机腈化合物一步水解为羧酸并产生一分子的氨，该过程反应条件温和，不需要任何辅因子的参与，反应效率极高，同时反应过程具有较好的区域和立体选择性。另一方面，反应底物扁桃腈易于大规模生产且成本低廉；更为重要的是，当(R)-(-)-扁桃腈被对映选择性地酶促水解为(R)-(-)-扁桃酸后，剩余的(S)-(+)-扁桃腈在弱碱性条件下可以自发地消旋转化为外消旋的扁桃腈，这样理论上可以得到100％的产率。因此，如果能够获得对扁桃腈具有高水解活性和对映选择性的腈水解酶，则有望实现(R)-(-)-扁桃酸的大规模工业化生产。

目前已有一些文献报道利用腈水解酶催化扁桃腈水解合成(R)-(-)-扁桃酸。例如，Yamamoto等(Appl.Environ.Microbiol.，1991，57：3028-3032)利用Alcaligenesfaecalis ATCC 8750转化外消旋的扁桃腈合成(R)-(-)-扁桃酸；Kaul等(Tetrahedron：Asymmetry，2004，15：207-211)利用Pseudomonas putida将扁桃腈水解为(R)-(-)-扁桃酸，转化率大于40％，e.e.大于98％。但是，上述报道的方法存在的主要问题是：野生菌株中酶的产量很低，催化活力不高，酶的稳定性较差，而且不能耐受高浓度的底物，因此它们的总体催化效率不高，难以应用于扁桃酸的批量生产。

发明内容

本发明提供了一种编码腈水解酶的碱基序列，同时提供了含有上述碱基序列的质粒，以及由这种质粒转化宿主而得到的转化体。本发明还提供了一种对扁桃腈显示出高活性和对映选择性的重组腈水解酶，以及利用该酶由扁桃腈制备(R)-(-)-扁桃酸的方法。

本发明所述的腈水解酶来源于产碱杆菌属菌株ECU0401(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.2009)。该菌株是发明人从土壤中分离、纯化得到的，已经申请发明专利，公开号为CN 101134943和CN101186933。

本发明所述腈水解酶的编码DNA片段可以通过如下步骤分离：从产碱杆菌CGMCC No.2009中提取基因组DNA，用限制性内切酶对基因组DNA进行消化，得到的DNA片段通过电泳分离纯化，回收DNA片段，将其***载体质粒并转化相应的微生物宿主得到转化体库。从库中筛选出含腈水解酶基因序列的克隆，通过对相应重组质粒测序、分析该腈水解酶基因的碱基序列，确定出编码目标腈水解酶的DNA碱基序列，并从该DNA碱基序列推断出腈水解酶的氨基酸序列。

通过如上分离得到的编码本发明所述腈水解酶的DNA碱基序列包含序列表中SEQ NO.1的碱基序列。碱基序列SEQ NO.1编码了SEQ NO.2的氨基酸序列，由于密码子的简并性，编码SEQ NO.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ NO.1。另外，还可以通过适当引入替换、缺失、改变、***或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQNO.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

SEQ NO.1的同系物也指启动子变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、***或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQ NO.1或其同系物是一种具有能够在标准条件下和具有与SEQ NO.1互补序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用协议(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明所述的腈水解酶具有序列表中SEQ NO.2的氨基酸序列，或者在保持腈水解酶的活性下，将SEQ NO.2的氨基酸进行替换、缺失、改变或***其中的一个或两个，优选为几个氨基酸而得到的氨基酸序列。

将所得到的编码本发明所述腈水解酶的DNA***到一个表达质粒中，例如，当宿主是大肠杆菌时，典型的表达质粒包括pUC18、pUC19、pSC101、pBR322、pHS1、pHS2，这样可以得到表达腈水解酶的质粒。对于宿主的选择不仅仅局限于大肠杆菌等，任何微生物只要满足重组载体可以稳定地和自动地生长，并且一些外源的DNA可以被表达即可作为转化宿主。

在本发明中，由质粒转化表达宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明所述的腈水解酶。任何一种人工的或天然的含有适量的碳源、氮源、无机和其他营养物质的介质，只要能够满足使宿主菌株生长并产生腈水解酶均可使用。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据培养类型和方法等因素的不同而进行适当的选择，只要使宿主菌株能够生长并产生腈水解酶即可。

用于制备本发明的(R)-(-)-扁桃酸及其衍生物的方法中的腈水解酶，可以是上述产生腈水解酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物的腈水解酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。为了改善目标反应的反应性和选择性，可以使用有机溶剂或者在反应前和反应中处理反应体系、转化体细胞或者转化体的加工制品。有机溶剂适当的选择一种或多种醇类，如甲醇和乙醇等；可与水混合的有机溶剂，例如丙酮、二甲基亚砜、***、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃和二甲基甲酰胺；芳香族有机溶剂如苯和甲苯；烷烃类如正己烷和辛烷。有机溶剂的用量可根据腈水解酶活性的稳定性范围而定。其他处理方法，比如利用CTAB对细胞进行通透处理，CTAB的浓度为1～10％(w/v)，处理时间为0.1～2h。为了进一步提高反应的效率，还可以向反应体系中加入各种添加剂，例如有些金属离子会抑制腈水解酶的活性，因此，可向反应体系中加入金属离子螯合剂，例如EDTA。而有些还原试剂，如半胱氨酸和二硫苏糖醇则有利于腈水解酶的酶活。

在由腈水解酶催化相应的腈化合物水解制备本发明的(R)-(-)-扁桃酸及其衍生物时，选择对反应性如腈水解酶的活性和稳定性有利的条件有利于反应的进行。

反应中使用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质。其中的缓冲液可以是向水中加入一种或多种适当选自磷酸、Tris、柠檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、MOPS、MES、CAPS、CHES、PIPES和其他的酸成分而得到。

本发明方法所述的pH值优选保持在腈水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选为pH 4.0～10.0。反应温度优选保持在腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选为20～60℃。

本发明方法所述的底物浓度没有限制，通常为5～200mmol/L。考虑到反应的效率，底物浓度优选为大于等于50mmol/L，更优选为大于等于100mmol/L并且优选为小于等于200mmol/L。同时为了提高生产效率，可以在反应时批次添加腈。反应所生成的产物可以在反应结束后分离，也可以通过原位分离的方法不断地将产物移走。

本发明的方法中，当所使用的催化剂是静息细胞时，其用量为1～100g/L；当使用的催化剂是固定化细胞时，其用量为5～500g/L；当催化剂是细胞提取物时，其用量为5～100mg/L。

本发明所述的腈水解酶可以提供由扁桃腈及其衍生物得到相应的扁桃酸及其衍生物。因此，本发明中的腈水解酶可以在工业上方便地由扁桃腈及其衍生物制备光学纯的扁桃酸及其衍生物。本发明中所选的底物通式为：

其中R＝H、OH、Cl、F、Br、NO₂、CH₃或CH₃O。优选的底物为扁桃腈、邻氯扁桃腈、间氯扁桃腈、对氯扁桃腈及对羟基扁桃腈。

在本发明方法中制备的扁桃酸及其衍生物可简单地通过萃取来从水相中分离。为此，先用碱(如氢氧化钠和氨水)来碱化反应液，优选将pH调至8.0～9.0，然后用有机溶剂萃取以除去反应液中的杂质，可以重复几次以彻底去除杂质及未反应完的底物。然后，再加入酸(如盐酸或硫酸)来酸化反应液，优选pH值在1.0～2.0之间，再用有机溶剂萃取，可以重复几次以提高产率。有机溶剂包括乙酸乙酯、***、甲苯或正己烷等。通过将有机溶剂浓缩或去除后，即可得到较高化学纯度的产物，还可以通过重结晶来进一步提高产物的化学纯度和光学纯度。

通过以上优选的方法，根据用于反应的底物的种类，本发明方法的产物可以以60％-98％的产率分离。分离的产物具有很高的化学纯度，经过重结晶之后其对映体过量值高于99.5％。

本发明提供了一种编码腈水解酶的碱基序列，和含有此碱基序列的质粒以及通过将此质粒转化表达宿主而得到的转化体微生物。本发明公开的腈水解酶能够以绿色环保的方式高效催化扁桃腈不对称水解制备光学纯的(R)-(-)-扁桃酸，具有优良的效果，工业应用开发的潜力很大。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术内容做进一步描述，其目的在于更好地理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围。

实施例1 产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401的培养

将产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401在具有下述组成的液体介质中，于30℃，180rpm振荡培养48h制备表现腈水解酶活性的细胞。

培养基介质组成

甘油：10g/L；蛋白胨：15g/L；酵母膏：8g/L；KH₂PO₄：4g/L；NaCl：2g/L；MgSO₄：0.2g/L；FeSO₄：0.05g/L；pH 7.0。

将发酵液以12,000×g离心10min回收细胞，并用生理盐水洗涤两次，储存于4℃冰箱中备用。

实施例2 产碱杆菌基因组DNA的制备

将菌体Alcaligenes sp.ECU0401活化后接种于1.5ml发酵培养基，30℃培养12h，离心收集菌体(12000rpm，3min)。菌体用TE溶液洗涤两次(10000rpm，离心3min)，重新悬浮于300μl TE溶液中。加入200μl 10％SDS和5μl的20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于30℃温育2小时。菌体细胞破裂后释放出大量的多糖，加入500μl 5mol/L氯化钠和500μl CTAB/NaCl溶液的混合液，上下颠倒离心管，充分混匀，55℃温育10min，然后取出，重新混匀，55℃再温育10min。冰浴冷却混合液，加等体积的酚氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)抽提两次，12000rpm，离心10min。取上清液加入20μl RNase溶液，30℃温育60min。加入0.5倍体积的异丙醇沉淀基因组DNA，沉淀溶解于50μl的双蒸水中。

实施例3 产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401基因组DNA库的制备

将实施例2得到的基因组DNA用限制性内切酶Sau I进行完全消化，并通过琼脂糖凝胶电泳分离，按DNA长度分段，收集2kb以上的DNA片段，与5’端已被限制性内切酶Sau I消化并已经脱去磷酸的载体pUC18进行连接，将所得质粒库转化大肠杆菌DH5α，并将转化体涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃静置培养以形成单菌落。

实施例4 从质粒库中筛选含有腈水解酶基因序列的质粒

将实施例3中获得的单菌落接种到LB液体介质中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。以所得到的菌体作为PCR的模板，以根据腈水解酶保守序列设计的简并引物GCCGCBGTDCAGGC和GTGARTAGTGGCCC作为PCR引物进行扩增。

PCR扩增条件：

1)95℃，变性3min

2)95℃，变性1min，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，做30个循环。

3)72℃，延伸10min，冷却至4℃。

能够扩增出目标条带的模板质粒即为含有腈水解酶基因的质粒。

实施例5 编码腈水解酶的DNA序列的测定

从实施例4中得到的含有腈水解酶基因序列的转化体中提取质粒，并送至英骏生物技术有限公司测序，得到编码腈水解酶基因的碱基序列(SEQ NO.1)。SEQNO.2为由SEQ NO.1翻译得到的氨基酸序列。由氨基酸序列估计的腈水解酶分子量约为38.5kDa。

实施例6 重组转化体的制备

根据实施例5测序得到的腈水解酶的编码碱基序列，设计PCR扩增的引物5’-AGGCTGCAGTAAGGAGGAATGATCGATGCAGACAAGAAAAATCGTCC-3’和5’-TTCGGATCCTCAGGACGGTTCTTGCAC-3’，以实施例3中含有腈水解酶基因序列的质粒作为模板，在以下条件下进行PCR扩增。

反应体系：

去离子水20μl，缓冲液3μl，dNTP 2μl，引物各1μl，Taq DNA聚合酶1μl，模板2μl。

PCR扩增条件同实施例4。通过PCR扩增，得到含有PstI和BamHI酶切位点的片段，利用限制性内切酶PstI和BamHI对此片段在30℃下酶切12个小时，经琼脂糖凝胶电泳纯化，回收目标片段。将酶切后的片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经PstI和BamHI酶切后的质粒pUC19，在5℃下连接过夜得到重组质粒pNLE，将此重组质粒转化宿主菌得到重组转化体。

实施例7 转化体细胞的获得

挑取转化体单菌落接种至50ml含相应抗生素的发酵培养基中，预培养15h，以该培养液作为种子，按5％的接种量接种至100ml的发酵培养基中，在30℃，180rpm的摇床上培养至OD₆₀₀＝1.0，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养10h，以12,000×g离心10min，回收细胞。

实施例8 利用静息细胞催化扁桃腈水解生产(R)-(-)-扁桃酸

称取按实施例7制备的静息细胞5g(湿重)，悬浮于100ml Tris-HCl缓冲液中，加入200mmol/L扁桃腈作为底物，在37℃，150rpm的恒温摇床上振荡反应，反应5h后，将反应液以12,000×g离心10min，除去细胞。在上清液中加入2mol/LHCl酸化至pH为1.0～2.0，加入食盐至饱和，用等体积的乙酸乙酯萃取，重复三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去有机溶剂，得到扁桃酸粗品。经过甲苯重结晶后，得到(R)-(-)-扁桃酸的纯品：白色粉末，产率90％，e.e.＞99.5％，比旋光度

由此可见，以该转化体细胞作为催化剂能够耐受高浓度、高毒性的扁桃腈，并且具有良好的催化效果。

实施例9 利用静息细胞催化扁桃腈批次水解生产(R)-(-)-扁桃酸

称取按实施例7制备的静息细胞1.0g(湿重)，悬浮于10ml Tris-HCl缓冲液中，加入100mmol/L扁桃腈作为底物，在28℃，180rpm的恒温摇床上振荡反应，以薄板层析(TLC)监测反应进程。当反应完全后，将反应液以12,000×g离心10min，收集上清；同时将细胞用缓冲液洗涤两次后，重新悬浮于10ml缓冲液中，加入100mmol/L扁桃腈作为底物继续反应。如此重复反应10批次后，共获得扁桃酸粗品1.5g，收率98％，产物的e.e.为99％。未发现细胞酶活有显著下降，说明该细胞具有很好的重复操作稳定性，具有潜在的工业应用前景。

实施例10 批次补加底物扁桃腈制备(R)-(-)-扁桃酸

称取按实施例7制备的静息细胞0.8g(湿重)，悬浮于10ml Tris-HCl缓冲液中，加入100mmol/L扁桃腈作为底物，在30℃，200rpm的恒温摇床上振荡反应，薄板层析(TLC)监测反应进程。当反应完全后，再次往反应体系中加入100mmol/L扁桃腈，如此连续补加5次后，反应体系中累积的(R)-(-)-扁桃酸的浓度达到0.52mol/L，经分离提取得到产品0.77g，收率84.4％，产物的e.e.为99％。

实施例11 利用固定化细胞催化扁桃腈水解生产(R)-(-)-扁桃酸

在100ml含有100mmol/L底物扁桃腈的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.5)中，加入海藻酸钙固定化细胞20g，在40℃，160rpm的恒温摇床上振荡反应4h，反应完后，将固定化细胞用纱布过滤，用缓冲液洗涤固定化细胞三次，继续进行下一批次的反应，固定化细胞可重复利用15批次以上。固定化细胞在15批次反应中共制备出117.9g(R)-(-)-扁桃酸，催化剂的利用效率为171.6g产品/g细胞，产物的e.e.大于95％。达到了令人满意的效果，具有很好的工业应用前景。

实施例12 利用静息细胞催化邻氯扁桃腈水解生产(R)-(-)-邻氯扁桃酸

称取10g(湿重)按实施例7制备的静息细胞，悬浮于100ml Tris-HCl缓冲液中，加入50mmol/L邻氯扁桃腈作为底物，在37℃，150rpm的恒温摇床上振荡反应，薄板层析(TLC)监测反应进程。当反应完全后，将反应液以12,000×g离心10min，除去细胞。在上清液中加入2mol/L HCl酸化至pH为1.0～2.0，加入食盐至饱和，用等体积的乙酸乙酯萃取，重复三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去有机溶剂，得到邻氯扁桃酸粗品。经过甲苯重结晶后，得到(R)-(-)-邻氯扁桃酸的纯品：灰色晶体，产率85％，e.e.＞99.7％，比旋光度

由此可见，以该转化体细胞作为催化剂能够耐受高浓度、强毒性的邻氯扁桃腈，并且具有很好的催化效果。

序列表

SEQNO.1：

ATGCAGACAA GAAAAATCGT CCGGGCAGCC GCCGTACAGG CCGCCTCTCC

CAACTACGAC CTGGCAGCAG GTGTTGATAA AACCATTGAA CTGGCTCGAC

AAGCGCGTGA TGAAGGCTGC GACCTGATCG TATTTGGTGA AACCTGGTTG

CCAGGCTATC CCTTCCACGT CTGGCTAGGT GCGCCGGCCT GGTCACTGAA

AIACAGTGCT CGTTACTATG CCAACTCACT CTCGCTGGAC AGTGCAGAGT

TTCAGCGCAT TGCCCAGGCT GCGCGAACCT TGGGCATTTT CATCGCATTG

GGCTAIAGCG AACGCAGCGG TGGCAGCCTG TATCTGGGCC AATGCCTGAT

CGACGACAAA GGCGAGATGC TGTGGTCACG TCGCAAACTC AAACCCACGC

ATGTAGAGCG CACCGTATTT GGTGAGGGTT ATGCCCGTGA TCTGATTGTG

TCCGACACAG AACTGGGACG CGTCGGCGCT CTATGCTGCT GGGAGCATTT

GTCGCCCTTG AGCAAGTACG CGCTGTACTC CCAGCATGAA GCCATTCACA

TTGCTGCCTG GCCGTCGTTT TCGCTAIACA GCGAACAGGC CCACGCCCTC

AGCGCCAAGG TGAACATGGC CGCCTCGCAA ATCTATTCGG TGGAAGGCCA

ATGCTTTACC ATCGCCGCCA GCAGTGTGGT CACCCAAGAG ACGCTAGACA

TGCTGGAAGT GGGTGAGCAC AACGCCTCTT TGCTGAAAGT GGGCGGTGGC

AGTTCCATGA TTTTTGCACC GGACGGACGT ACACTGGCTC CCTACCTGCC

TCACGATGCC GAGGGCTTGA TCATTGCCGA TCTGGAIATG GAGGAGATTG

CCTTCGCCAA GGCGATCAAT GACCCCGTGG GCCACTATTC CAAACCTGAA

GCCACCCGTC TGGTGCTGGA CTTGGGGCAC CGAGAACCCA TGACTCGGGT

GCACTCCAAA AGCGTGACCA AGGCAGAGGC TTCCGAGCCA GGTGTGCAAA

GTACGGCTAC CTCAGTCGCT ATCAGCCATC CACAGGACTC GGACACACTG

CTCGTGCAAG AACCGTCCTG A

SEQ NO.2

MQTRKIVRAAAVQAASPNYDLAAGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPG

YPFHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSER

SGGSLYLGQCLIDDKGEMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRV

GALCCWEHLSPLSKYALYSQHEAIHIAAWPSFSLYSEQAHALSAKVNMAASQI

YSVEGQCFTIAASSVVTQETLDMLEVGEHNASLLKVGGGSSMIFAPDGRTLAP

YLPHDAEGLIIADLDMEEIAFAKAINDPVGHYSKPEATRLVLDLGHREPMTRV

HSKSVTKAEASEPGVQSTATSVAISHPQDSDTLLVQEPS

Claims

1.一种催化扁桃腈水解合成(R)-(-)-扁桃酸的腈水解酶，其特征在于，所述的腈水解酶是由产碱杆菌属Alcaligenes sp.ECU0401，保藏号为CGMCC No.2009的菌株得到的具有如下(a)或(b)的DNA的碱基序列：

(a)

ATGCAGACAA GAAAAATCGT CCGGGCAGCC GCCGTACAGG CCGCCTCTCC

CAACTACGAC CTGGCAGCAG GTGTTGAIAA AACCATTGAA CTGGCTCGAC

AAGCGCGTGA TGAAGGCTGC GACCTGATCG TATTTGGTGA AACCTGGTTG

CCAGGCTATC CCTTCCACGT CTGGCTAGGT GCGCCGGCCT GGTCACTGAA

ATACAGTGCT CGTTACTATG CCAACTCACT CTCGCTGGAC AGTGCAGAGT

TTCAGCGCAT TGCCCAGGCT GCGCGAACCT TGGGCATTTT CATCGCATTG

GGCTATAGCG AACGCAGCGG TGGCAGCCTG TATCTGGGCC AATGCCTGAT

CGACGACAAA GGCGAGATGC TGTGGTCACG TCGCAAACTC AAACCCACGC

ATGTAGAGCG CACCGTATTT GGTGAGGGTT ATGCCCGTGA TCTGATTGTG

TCCGACACAG AACTGGGACG CGTCGGCGCT CTATGCTGCT GGGAGCATTT

GTCGCCCTTG AGCAAGTACG CGCTGTACTC CCAGCATGAA GCCATTCACA

TTGCTGCCTG GCCGTCGTTT TCGCTATACA GCGAACAGGC CCACGCCCTC

AGCGCCAAGG TGAACATGGC CGCCTCGCAA ATCTATTCGG TGGAAGGCCA

ATGCTTTACC ATCGCCGCCA GCAGTGTGGT CACCCAAGAG ACGCTAGACA

TGCTGGAAGT GGGTGAGCAC AACGCCTCTT TGCTGAAAGT GGGCGGTGGC

AGTTCCATGA TTTTTGCACC GGACGGACGT ACACTGGCTC CCTACCTGCC

TCACGATGCC GAGGGCTTGA TCATTGCCGA TCTGGATATG GAGGAGATTG

CCTTCGCCAA GGCGATCAAT GACCCCGTGG GCCACTATTC CAAACCTGAA

GCCACCCGTC TGGTGCTGGA CTTGGGGCAC CGAGAACCCA TGACTCGGGT

GCACTCCAAA AGCGTGACCA AGGCAGAGGC TTCCGAGCCA GGTGTGCAAA

GTACGGCTAC CTCAGTCGCT ATCAGCCATC CACAGGACTC GGACACACTG

CTCGTGCAAG AACCGTCCTG A；或者

(b)在保持由上述(a)碱基序列编码的腈水解酶的催化活性的前提下，由***、缺失或替换上述(a)碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。

2.一种含有如权利要求1所述的碱基序列的重组质粒。

3.一种含有权利要求2所述的碱基序列的重组质粒经转化宿主细胞而得到的转化体。

4.如权利要求1所述的重组腈水解酶，其特征在于，它是由所述的DNA序列编码，包括如下的(a)或(b)的氨基酸序列：

(a)

MQTRKIVRAAAVQAASPNYDLAAGVDKTIELARQARDEGCDLIVFGETWLPG

YPFHVWLGAPAWSLKYSARYYANSLSLDSAEFQRIAQAARTLGIFIALGYSER

SGGSLYLGQCLIDDKGEMLWSRRKLKPTHVERTVFGEGYARDLIVSDTELGRV

GALCCWEHLSPLSKYALYSQHEAIHIAAWPSFSLYSEQAHALSAKVNMAASQI

YSVEGQCFTIAASSVVTQETLDMLEVGEHNASLLKVGGGSSMIFAPDGRTLAP

YLPHDAEGLIIADLDMEEIAFAKAINDPVGHYSKPEATRLVLDLGHREPMTRV

HSKSVTKAEASEPGVQSTATSVAISHPQDSDTLLVQEPS；或者

(b)在保持催化活性的前提下，由***、缺失或替换上述(a)氨基酸序列中至少一个氨基酸残基而得到的变异的氨基酸序列。

5.一种如权利要求1所述的重组腈水解酶被用于催化合成(R)-(-)-扁桃酸及其类似物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述的重组腈水解酶采用如下步骤催化合成(R)-(-)-扁桃酸及其类似物：

(1)对权利要求1所述的转化体重组微生物进行增殖培养，表达目标蛋白，收集重组微生物细胞；

(2)将收获的重组微生物静息细胞或对重组微生物细胞进行固定化处理后得到的固定化细胞悬浮于pH为4.0～10.0的缓冲液中，加入扁桃腈或其结构类似物作为底物，在20～60℃反应1～10小时，然后从反应液中分离提取目标产物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的扁桃腈及其类似物的结构通式为：

其中R＝H、OH、Cl、F、Br、NO₂、CH₃或CH₃O。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中选择的固定化方法是海藻酸钙包埋法，固定化重组细胞中海藻酸钠的含量是10～30g/L，游离重组细胞的含量是2～150g/L。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，所述的底物浓度为5～200mmol/L；所述的静息细胞在缓冲液中的含量为1～100g/L。

10.根据权利要求6和8所述的方法，其特征在于，使用固定化重组细胞转化时，固定化细胞在缓冲液中的含量为5～500g/L。