CN114410471B

CN114410471B - 水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法及所用培养基

Info

Publication number: CN114410471B
Application number: CN202111602627.0A
Authority: CN
Inventors: 张奇春; 杨小渔; 张耿苗; 王京文; 赵钰杰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114410471A

Abstract

本发明公开了水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选的方法以及相应的培养基，筛选方法包括以下步骤：制备水稻根际土壤非共生固氮菌株选择性培养基，命名为AVM培养基；水稻根际土壤的获取；菌株的分离；菌株的纯化；菌株的DNA提取、PCR分析及鉴定；乙炔还原活性测定固氮能力。本发明可用于水稻根际土壤中固氮菌的筛选。

Description

水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法及所用培养基

技术领域

本发明涉及一种水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法及所用培养基。

背景技术

近年来，粮食安全问题已成为全球重点关注的农业问题。为了提高粮食产量，过量使用氮肥导致氮肥利用率下降、土壤板结以及水体富营养化等环境问题突增，如何处理好氮肥与农业生产之间的关系是一个亟待解决的问题。生物固氮是固氮微生物在固氮酶的催化下将空气中的氮气转化成活性氮的自然过程，是陆地和海洋生态***中活性氮的主要非人为输入来源。在土壤微生物群中，含有多种具有固氮作用的菌种，一般为细菌或者古生菌，它们能够将大气中的氮气转化为对植物生长更有用的形式。在广泛应用氮肥之前，生物固氮是农业生产中活性氮输入的主要来源。随着氮肥施用量的增加，人们对生物固氮的重视程度逐渐降低，然而，更有效地开发和利用自然过程生物固氮作用是逐步降低氮肥施用量的潜在途径。这些固氮菌对于提高农业生产量有巨大的意义，研究将其应用于肥料的生产，这种肥料前途一片光明，对农作物增产具有一定作用。

非共生固氮是非豆科作物栽培过程中的主要生物固氮途径，在农田氮供应中发挥着广泛的作用。而以往的固氮菌大多从豆类根瘤中分离得到共生型的固氮菌。非共生型固氮菌与共生固氮菌相对，是指不需要进入生物体内进行固氮的固氮菌。所以从土壤中分离的是非共生型固氮菌，从植株根瘤分离的是共生型固氮菌；对于非共生型的固氮菌，缺乏相当报道。因此，急需一种土壤固氮菌株的筛选的方法，从而分离筛选非共生固氮菌。

目前报道的非共生型固氮菌的筛选培养基较多，如Ashby无氮培养基，Waksmen无氮培养基等。但是存在筛选菌株效率不高等缺陷。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选的方法以及相应的培养基，本发明的根际水稻土壤固氮菌株筛选的方法，可用于水稻根际土壤中固氮菌的筛选。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻土壤非共生固氮菌株选择性培养基(AVM培养基)，其配方为：牛肉蛋白提取物3g/L，DL-苹果酸2.5g/L，氢氧化钾2.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钠1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，酵母提取物0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，Fe-EDTA 66mg/L，硫酸锰10mg/L，钼酸钠2mg/L，生物素0.2mg/L，氯化铵0.5mg/L，琼脂15g/L，余量为水(即，水定容至1L)，pH6.6～7.0。

生物素指维生素H。

AVM培养基后续需灭菌处理，即，过0.22μm滤膜除菌。如采用无菌水进行配置，可无需后续的灭菌处理。

本发明还同时提供了一种水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，包括以下步骤：

1)制备水稻土壤非共生固氮菌株选择性培养基---AVM培养基：

2)水稻根际土壤的获取；

3)菌株的分离；

4)菌株的纯化；

5)菌株的DNA提取、PCR分析及鉴定。

作为本发明的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法的改进，还包括步骤6)的乙炔还原活性测定固氮能力。

作为本发明的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法的进一步改进，步骤3)为：

将步骤2)所得的水稻根际土壤进行清洗后，再采用释稀法进行菌株的分离：

在1#～7#试管中分别加入10ml的无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲液)，向1#试管中加入2.0g清洗后水稻根际土壤均匀混合，取1#试管所得的500ul土壤悬液加入至2#试管内均匀混合，而后依次类推，直至取6#试管所得的500ul土壤悬液加入至7#试管内均匀混合；

所述无菌磷酸盐缓冲溶液为将PBS缓冲液经过2道0.22um无菌过滤；

所述PBS缓冲液的配方为：NaCl:8g/L，KCl:0.2g/L，KH₂PO₄:0.27g/L，Na₂HPO₄:1.44g/L，余量为水(即，水定容至1L)；

对3#～7#试管分别进行如下处理：

先将200ml的AVM培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后，用无菌吸管吸取200ul水稻根际土壤悬液加入AVM培养基平板中，迅速用涂布棒将土壤悬液均匀涂布在培养皿中并且使其干燥，用封口膜密封每个培养皿，并倒置于32℃的培养箱中放置(培养)2～3天。

说明：此步骤中，经培养后，土壤悬液中的细菌由单个细胞生长繁殖形成菌落，观察细菌的生长。

操作过程中的培养基、无菌水等按照常规的高压蒸汽灭菌法进行灭菌(103.4kpa，30min)。

水稻根际土壤的清洗方式为：将步骤2)所得的水稻根际土壤放入质量浓度为0.9％的NaCl无菌水溶液中，搅拌4～6分钟后，离心(8000±1000g离心10±2min)，收集离心所得的沉淀物，作为清洗后水稻根际土壤。

一般而言，水稻根际土壤与0.9％的NaCl无菌水溶液的料液比为1g/8～12ml。

作为本发明的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法的进一步改进：所述步骤4)的菌株的纯化为：

针对步骤3)培养所得的细菌，根据菌落形态选择长势较好、生长速度较快的不同菌落，使用接种针取上述细菌单个菌落在AVM培养基平板上划线，划线后，用封口膜密封培养皿，在28±0.5℃下密封培养直至获得肉眼可见的完整菌落(该培养条件下细菌开始生长，一般培养24小时，即可获得该完整菌落)；得纯化菌株；

将纯化菌株加入LB液体培养基中密封培养18小时后离心(10000×g，10min)，弃净上清，取离心所得的底部沉淀物作为菌株种子液；

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨2.5g/250mL，酵母提取物1.25g/250mL，氯化钠2.5g/250mL，水250mL。

作为本发明的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法的进一步改进：

所述步骤6)为：

取步骤4)所得的菌株种子液1ml接种到含有100ml AVM培养基的容器(例如锥形烧瓶)中，在30±0.5℃下进行旋转摇瓶(110rpm)密封培养，直至生长至指数中期(约48h)；

取生长至指数中期的菌液1ml接种至含有10mL AVM培养基的容器中，并在30±0.5℃下密封培养至指数期(约48小时)；然后，将密封容器顶部空间气体的10％(体积％)用乙炔代替，并再次于30±0.5℃下密封培养6小时；用气相色谱仪测定生成的乙烯。

作为本发明的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法的进一步改进，步骤5)为：

①、菌株的DNA提取：将上述步骤4)所得的纯化菌株根据细菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio公司)进行；

②、菌株的PCR分析：使用通用引物对步骤①所得的菌株基因组DNA的16s rRNA基因全长序列进行测序PCR扩增；

所述通用引物为：27F-GAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R-TACGGYTACCTTGTTACGACTT

扩增条件如下：

扩增体系：DNA模板0.5uL/样品、2×Taq PCR MasterMix 12.5uL、通用引物1uL、双蒸水10uL；

混匀后将其放入PCR仪中进行扩增，PCR程序如下:95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30次循环；72℃保温10min；

PCR结束后，取2uL反应液与2uL DNA loading buffer混匀，并以3uL DNA marker作为对照进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增是否成功；

当电泳扩增获得约1500bp片段，判定PCR扩增成功；

反之，当电泳结果没有获得上述相应片段时，判定PCR扩增失败；

③、菌株的DNA测序：在Sangon公司使用通用引物(27F和1492R)对菌株进行测序；测序结果使用Bioedit和Mega4进行分析，将获取到的fasta格式的结果在EZ-biocloud网站上进行16S-rRNA细菌鉴定，确认其是已知菌种还是未知菌种。

所述步骤2)中，直接将水稻连根拔起，抖掉根周围松散的土壤，然后用刷子将根上剩余的土壤轻轻刷下来，得到水稻根际土壤。

本发明开发了水稻土壤非共生固氮菌株选择性培养基---AVM培养基，本发明分析了非共固氮菌株适宜的营养组成，进行选择性培养基元素的配比，提高了钾的含量，重新分配了磷、钾、钙含量配比，提高了分离和筛选效率。

传统水稻根际土壤的采集是用抖落法，此法有很大的局限性，本发明对此进行了改进，先除去抖落的土壤，然后用毛刷轻刷水稻根部，收集毛刷轻刷所得的土壤作为根际土壤。

本发明设定了特定的菌株纯化方法。

采用本发明的方法能有效分离和筛选到目标菌株，且得到的菌株固氮效率高。

综上，本发明可用于水稻根际土壤中固氮菌的筛选，提高土壤氮素的利用率，同时可作为制作高效氮肥材料的潜质。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为从水稻根际土壤中分离的固氮细菌；

图1中，左图为水稻根际土壤I中分离的菌落形态，右图为水稻根际土壤II中分离的菌落形态。

图2为分离到的Azo-1至Azo-16菌株的细菌纯化后在平板上划线后菌落形态图；从左到右依次为Azo-1～Azo-4，Azo-5～Azo-8，Azo-9～Azo-12，Azo-13～Azo-16。

图3为菌株Azo-1的***发育树图。

图4为菌株Azo-2的***发育树图。

图5为菌株Azo-3的***发育树图。

图6为菌株的乙炔还原活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种水稻根际土壤固氮菌株筛选方法，其制备方法为依次进行以下步骤：

1)、水稻土壤固氮菌株选择性培养基(AVM)配方：

在1L容器中，加入表1各组分，并加水(无菌水)定容至1000mL。

表1选择性培养基A VM配方

生物素指维生素H。

2)、水稻根际土壤采集：

以浙江省宁波市鄞州区横溪镇金峨村水稻土壤为样本，抖落水稻根际松散的土，将仍粘附在根表面的土壤视为根际土，即，用刷子将根上剩余粘附的土壤轻轻刷下来并进行收集，从而获得水稻根际土壤；将获得的2个根际土样本(I和II)混合后进行如下步骤3)。

3)、菌株的分离：

取5g水稻根际土壤放入50ml无菌0.9％NaCl溶液适度轻微搅动5min，然后8000g离心10min，收集离心所得的沉淀物，作为清洗后水稻根际土壤。

准备七个试管，每个试管中分别加入10ml的无菌磷酸盐缓冲溶液，并对其从1到7进行编号，向1#试管中添加2.0g清洗后水稻根际土壤，混合均匀。从1#试管中取出500ul土壤悬液加入2#试管混合均匀，从2#试管中取出500ul悬液加入3#试管混合均匀，以此类推，直至从6#试管中取出500ul悬液加入7#试管混合均匀。

所述无菌磷酸盐缓冲溶液为将PBS缓冲液经过2道0.22um无菌过滤，所述PBS缓冲液的配方为：NaCl:8g/L，KCl:0.2g/L，KH₂PO₄:0.27g/L，Na₂HPO₄:1.44g/L，余量为水(即，水定容至1L)。

对3#～7#试管中的水稻根际土壤悬液分别进行如下处理：

取200ul水稻根际土壤悬液加入装有AVM固体选择性培养基(约200ml)的培养皿中，用涂布棒将水稻根际土壤悬液均匀涂布在培养皿中并且保持干燥(用封口膜密封每个培养皿)，并在32℃的培养箱中放置2-3天，观察细菌的生长；当单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落条件时，结束此步骤的培养，因此培养时间约为2～3天。

说明：将200ml的AVM培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后，即得AVM固体选择性培养基。

所得结果如图1所述。

此步骤所得的单菌落分别进行如下的步骤4)：

4)菌株的纯化：

使用接种针取上述细菌单个菌落在AVM培养基平板上划线，划线后，用封口膜密封培养皿，在28℃下密封培养，细菌开始生长，直到培养至肉眼能够看到完整的菌落(培养时间约为24小时)；获得纯化菌株16株(图2)；

5)菌株的鉴定：

提取步骤4)所得的纯化菌株DNA，并利用16s rRNA通用引物进行PCR后进行测序。

具体如下：

①、菌株的DNA提取：将上述步骤4)所得的纯化菌株根据Solarbio公司购置的细菌基因组DNA提取试剂盒进行；

②、菌株的PCR分析：使用通用引物(27F-GAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R-TACGGYTACCTTGTTACGACTT)对步骤①所得的菌株基因组DNA的16s rRNA基因全长序列进行测序PCR扩增；

扩增条件如下：DNA模板0.5uL/样品、2×Taq PCR MasterMix 12.5uL、引物1uL(浓度为15μmol/L)、双蒸水10uL；

当电泳扩增获得1500bp片段，判定PCR扩增成功；

反之，当电泳结果没有获得相关片段时，判定PCR扩增失败；

③、菌株的DNA测序：在Sangon公司使用通用引物(27F和1492R)对菌株进行测序。测序结果使用Bioedit和Mega4进行分析，将获取到的fasta格式的结果在EZ-biocloud网站上进行16S-rRNA细菌鉴定，确认其是已知菌种还是未知菌种。

共获得目标菌株3株，为如图3～图5所示的Azo-1、Azo-2、Azo-3。

6)对分离的菌株进行乙炔还原试验：

乙炔还原法是生物固氮研究的常用方法，用此方法检测到固氮微生物具有将乙炔还原成乙烯的现象，在固氮研究领域等同于其具有将氮还原成氨的固氮能力。

对纯化菌株Azo-1、Azo-2、Azo-3分别进行如下处理：

用接种环取一环纯化菌株加入LB液体培养基(10ml)中培养18小时后离心(10 000×g，10min)，净上清，取离心所得的底部沉淀物作为菌株种子液；

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨2.5g/250mL，酵母提取物1.25g/250mL，氯化钠2.5g/250mL，水定容至250mL。

取菌株种子液1ml接种到含有100ml AVM液体培养基的锥形烧瓶中，在30℃下进行旋转摇瓶(110rpm)密封培养，生长至指数中期(48h)；

取生长至指数中期的菌液4ml接种至含有40mL AVM液体培养基的密封容器中，并在30℃下旋转摇瓶密封培养至指数期。培养后，用乙炔(10％v/v)代替密封容器顶部空间的气体，并再次在30℃下密封培养6小时；用气相色谱仪测定生成的乙烯。测定结果如图6所示，菌株Azo-1、Azo-2、Azo-3均表现出乙炔还原活性，其中Azo-2的菌株的乙炔还原活性最高。

乙烯生成速率的计算公式为：乙烯生成速率(nmol mg^-1min^-1)＝乙烯浓度(nmol L^-1)×容器体积(L)/[密封时间(min)×样品重量(mg)]。

对比例1、将AVM培养基改为常规的Ashby培养基，具体配方为：磷酸二氢钾0.2g/L,硫酸镁0.2g/L，氯化钠0.2g/L，碳酸钙5.0g/L，甘露醇10.0g/L，硫酸钙0.1g/L，琼脂18.0g/L,pH值6.8-7.0。

利用此培养基重复上述实施例1所述的水稻根际土壤，在配方中，由于营养元素磷、钾、钙含量配比原因，因此最终无法获得固氮菌株。

对比例2、将AVM培养基改为如下的培养基：KH₂PO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 0.8g，MgSO₄.7H₂O0.2g，CaSO₄.2H₂O 0.1g，Na₂MoO₄.2H₂O(微量)，酵母膏0.5g，甘露醇20g，FeCl₃微量，蒸馏水1000ml，琼脂15g，pH 7.2。

利用此培养基重复上述实施例1所述的水稻根际土壤，无法获得固氮菌株。

对比例3、将实施例1的AVM培养基配方中的“氢氧化钾2.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾1g/L”改成“氢氧化钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L”，其余等同于实施例1。

对比例4、将实施例1的AVM培养基配方中的“氢氧化钾2.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L”改成“氢氧化钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L”，同时取消配方中的“0.2g氯化钙”，其余等同于实施例1。

对比例5、水稻根际土壤样品采用抖落法获取；利用此培养基重复上述实施例1所述的水稻根际土壤，所得结果为：无法获得固氮菌株。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法及所用培养基

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtttgatc ctggctcag 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims

1.水稻根际土壤非共生固氮菌株选择性培养基，其特征在于：

培养基命名为AVM培养基，配方为：牛肉蛋白提取物3g/L，DL-苹果酸2.5g/L，氢氧化钾2.5 g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钠1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，酵母提取物0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，Fe-EDTA 66 mg/L，硫酸锰10mg/L，钼酸钠2mg/L，生物素0.2mg/L，氯化铵0.5 mg/L，琼脂15g/L，余量为水， pH6.6~7.0。

2.水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备如权利要求1所述的AVM培养基；

2）水稻根际土壤的获取；

直接将水稻连根拔起，抖掉根周围松散的土壤，然后用刷子将根上剩余的土壤轻轻刷下来，得到水稻根际土壤；

3）菌株的分离；

4）菌株的纯化；

5）菌株的DNA提取、PCR分析及鉴定。

3.根据权利要求2所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于：还包括步骤6）乙炔还原活性测定固氮能力。

4.根据权利要求3所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于步骤3）为：

将步骤2）所得的水稻根际土壤进行清洗后，再采用释稀法进行菌株的分离：

在1#~7#试管中分别加入10ml 的无菌磷酸盐缓冲溶液，向1#试管中加入2.0g清洗后水稻根际土壤均匀混合，取1#试管所得的500ul土壤悬液加入至2#试管内均匀混合，而后依次类推，直至取6#试管所得的500ul土壤悬液加入至7#试管内均匀混合；

对3#~7#试管分别进行如下处理：

先将200ml的AVM培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后，用无菌吸管吸取200ul水稻根际土壤悬液加入AVM培养基平板中，用涂布棒将土壤悬液均匀涂布在培养皿中并且使其干燥，用封口膜密封每个培养皿，并倒置于32℃的培养箱中放置2~3天。

5.根据权利要求4所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于：

所述无菌磷酸盐缓冲溶液为将PBS缓冲液经过2次0.22μm无菌过滤；

所述PBS缓冲液的配方为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH₂PO₄0.27g/L，Na₂HPO₄1.44g/L，余量为水。

6.根据权利要求3~5任一所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于：

所述步骤4）的菌株的纯化为：

针对步骤3）培养所得的细菌，使用接种针取细菌单个菌落在AVM培养基平板上划线，划线后，用封口膜密封培养皿，在28±0.5℃下密封培养直至获得肉眼可见的完整菌落；得纯化菌株；

将纯化菌株加入LB液体培养基中密封培养18小时后离心，弃上清，取离心所得的底部沉淀物作为菌株种子液；

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨2.5g，酵母提取物1.25g，氯化钠2.5g，水250mL。

7.根据权利要求6所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征是：

所述步骤6）为：

取步骤4）所得的菌株种子液1ml接种到含有100 ml AVM培养基的容器中，在30±0.5℃进行旋转摇瓶密封培养，直至生长至指数中期；

取生长至指数中期的菌液1ml接种至含有10mL AVM培养基的容器中，并在30±0.5℃密封培养至指数期；然后，将密封容器顶部空间气体的10%用乙炔代替，并再次于30±0.5℃下密封培养6小时；用气相色谱仪测定生成的乙烯。

8.根据权利要求7所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征是所述步骤5）为：

①、菌株的DNA提取：将上述步骤4）所得的纯化菌株根据细菌基因组DNA提取试剂盒进行；

所述通用引物为：27 F-GAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492 R-TACGGYTACCTTGTTACGACTT；

扩增体系：DNA模板 0.5uL/样品、2× Taq PCR MasterMix 12.5uL、通用引物1uL、双蒸水10uL；

混匀后将其放入PCR仪中进行扩增，PCR程序如下: 95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30次循环；72℃保温10min；

PCR结束后，取2uL反应液与2uL DNA loading buffer混匀，并以3uL DNA marker 作为对照进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增是否成功；

当电泳扩增获得1.5kbp片段，判定PCR扩增成功；

反之，当电泳结果没有获得上述片段时，判定PCR扩增失败；

③、菌株的DNA测序：在Sangon公司使用通用引物对菌株进行测序；测序结果使用Bioedit和Mega4进行分析，将获取到的fasta格式的结果在EZ-biocloud网站上进行16S-rRNA细菌鉴定，确认其是已知菌种还是未知菌种。