CN112625960B - 一株土壤杆菌dp3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用 - Google Patents

一株土壤杆菌dp3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种土壤杆菌DP3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用。溶磷菌，可以将难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷可用于改善盐碱土微环境，提高土壤磷素利用率，促进作物生长。本发明目的在于筛选提高盐碱土壤作物成活率的新型菌株，并提供了土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3，该菌株具有良好的耐盐、溶磷及促进作物生长的效果，应用于生物菌肥、土壤改良剂的应用具有良好的效果。

Description

一株土壤杆菌DP3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用
技术领域
本发明属于土壤改良工程菌株技术领域，具体涉及一株土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)DP3，其菌剂及在生物肥料领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
根据***粮食及农业组织(FAO)和***教科文组织(UNESCO)的报告，全球盐碱地的面积高达9.5438×108hm2，土壤盐碱化是一个全球性的环境问题。据估计，全球的盐碱地每年以1.0×106～1.5×106hm2的速度增长。盐渍化不仅破坏土壤的结构和性质，阻碍作物的生长发育，而且还会最终影响生态环境和农业的可持续发展。
磷(P)是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，在多个重要的功能包括能量代谢、结构功能、信号传导功能以及遗传特征的世代传递中均有重要作用。我国土壤全磷含量较高，但能被植物直接吸收利用的有效磷含量一般不超过全磷量的5％，大部分磷肥与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等结合，形成难溶性磷酸盐，植物不能直接吸收利用，使磷成为制约作物生产的主要因素。
溶磷菌，也叫解磷菌，可以将难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷。如芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆菌属(Clromobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、土壤杆菌(Agrobacterium)等都属于溶磷菌。将溶磷菌添加进盐碱土，可以改善盐碱土微环境，提高土壤磷素利用率，促进作物生长。因此，耐盐溶磷菌的研究及应用不仅可以改善盐碱地质量，调节土壤中微生物生态平衡，而且有利于农业的可持续发展。
发明内容
基于上述研究背景，本发明目的在于提供用于提高盐碱土壤作物成活率的新型菌株。为了实现该目的，本发明对东营黄河三角洲地区碱蓬根际土壤进行筛选，获得的一株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3，通过形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析进行鉴定，测定其耐盐性和溶磷能力以及盐碱地实际应用情况，为提高盐碱化土壤磷素利用率提供菌种资源。
基于上述研究内容，本发明第一方面，提供一株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3，所述菌株已于2020年12月7日保藏于国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC No.21306。
本发明第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3和/或所述菌的培养物。
本发明第三方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂在制备生物肥料领域的应用。
本发明第四方面，提供一种生物肥料，所述生物肥料包括第一方面所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3和/或第二方面所述菌剂。
本发明第五方面，提供一种土壤改良剂，所述土壤改良剂中包括和/或第四方面所述生物肥料。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明提供的溶磷细菌DP3，具有良好的耐盐性和溶磷能力，可用于促进盐碱土壤中作物的生长，为提高盐碱化土壤磷素利用率提供菌种资源。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3菌落照片图；
图2为实施例1中所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3菌体电镜照片图；
图3为实施例1中所述DP3的16S rDNA***发育树图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，溶磷菌能够将土壤中难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷从而更容易被作物应用，进一步起到促进作物生长的作用。尽量的筛选高效的溶磷菌对于盐碱土壤的改良及作物生长都具有重要的意义。因此，本发明提出了一株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3，包括该菌株的菌剂及其在土壤改良领域的应用。
基于上述研究内容，本发明第一方面，提供一株土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3，所述菌株已于2020年12月7日保藏于国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC No.21306。
第一方面所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
所述菌株分离自东营碱蓬根际盐碱土，其细菌形态满足根瘤菌特征，经基因组测序比对认定为土壤杆菌，定名为土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3。
所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3的形态学特征如下：
菌体特征：菌体为革兰氏阴性杆状菌，无芽孢，单个或成对排列。电子显微镜下呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm。
菌落特征：在LB培养基上培养48h后，菌落呈圆形，光滑。
所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3的生理生化特征如下：能够利用底物中的硝酸钾、尿素，能水解七叶苷柠檬酸铁及4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，能够同化右旋糖、左旋***糖、右旋甘露糖、右旋甘露醇、N-乙酰基葡糖胺及D-麦芽糖、葡萄糖酸钾及苹果酸。
优选的，所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3的培养基为LB培养基或PKO培养基。
进一步的，所述LB培养基中包括胰蛋白胨、酵母抽提物2.5g/L及氯化钠。
具体的，所述LB液体培养基：胰蛋白胨4～6g/L，酵母抽提物2～3g/L，氯化钠4～6g/L，去离子水0.8～1.2L。
具体的，所述LB固体培养基：4～6g/L，酵母抽提物2～3g/L，氯化钠4～6g/L，琼脂18～22g/L，去离子水0.8～1.2L，pH＝7.4。
进一步的，所述PKO培养基包括葡萄糖、磷酸三钙、硫酸铵、氯化钠、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁及酵母粉。
具体的，所述PKO液体培养基中，葡萄糖8～11g/L，磷酸三钙4～6g/L，硫酸铵0.4～0.6g/L，氯化钠0.15～0.25g/L，氯化钾0.15～0.25g/L，七水硫酸镁0.2～0.4g/L，硫酸锰0.02～0.05g/L，硫酸亚铁0.002～0.005g/L，酵母粉0.4～0.6g/L，蒸馏水0.9～1.1L，pH＝7.0±0.2，高温高压灭菌。
具体的，所述PKO固体培养基中，葡萄糖8～11g/L，磷酸三钙4～6g/L，硫酸铵0.4～0.6g/L，氯化钠0.15～0.25g/L，氯化钾0.15～0.25g/L，七水硫酸镁0.2～0.4g/L，硫酸锰0.02～0.05g/L，硫酸亚铁0.002～0.005g/L，酵母粉0.4～0.6g/L，蒸馏水0.9～1.1L，琼脂20g/L，pH＝7.0±0.2，高温高压灭菌。
本发明第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3和/或菌的培养物。
所述菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
作为优选，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
优选的，所述菌剂可为下述1)-6)中的任一菌剂：
1)用于溶磷的菌剂；
2)促进植物生长的菌剂；
3)改良培肥土壤的菌剂；
4)降低植物对逆境敏感性的菌剂；
5)提高植物抗逆性的菌剂；
6)修复土壤生态的菌剂。
本发明第三方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂在制备生物肥料领域的应用。
优选的，所述生物肥料的使用方式包括但不限于直接施用于土壤中或对作物种子进行处理。
本发明第四方面，提供一种生物肥料，所述生物肥料包括第一方面所述土壤杆菌(Agrobacterium sp.)DP3和/或第二方面所述菌剂。
本发明第五方面，提供一种土壤改良剂，所述土壤改良剂中包括和/或第四方面所述生物肥料。
优选的，所述土壤改良剂中还包括其特具有土壤改良活性的物质，所述土壤改良活性包括但不限于多糖类、碱性硅酸盐类、具开张孔隙的合成泡沫、腐植酸类改良剂或抑盐剂。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1耐盐溶磷菌的筛选及鉴定
1、培养基的配置
LB液体培养基：胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物2.5g/L，氯化钠5g/L，去离子水1000mL，pH＝7.4。
LB固体培养基：胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物2.5g/L，氯化钠5g/L，琼脂20g/L，去离子水1000mL，pH＝7.4。
PKO液体培养基：葡萄糖10g/L，磷酸三钙5g/L，硫酸铵0.5g/L，氯化钠0.2g/L，氯化钾0.2g/L，七水硫酸镁0.3g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.003g/L，酵母粉0.5g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0±0.2，121℃高温高压灭菌30min。
PKO液体培养基：葡萄糖10g/L，磷酸三钙5g/L，硫酸铵0.5g/L，氯化钠0.2g/L，氯化钾0.2g/L，七水硫酸镁0.3g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.003g/L，酵母粉0.5g/L，蒸馏水1000mL，琼脂20g/L，pH＝7.0±0.2，121℃高温高压灭菌30min。
2、溶磷菌的分离和筛选
称取东营碱蓬根际盐碱土10g，放入盛有90mL无菌水的250mL锥形瓶中，浸泡20min后，将盛有土样和无菌玻璃珠的锥形瓶在恒温振荡培养箱上以30℃、160r/min的条件下充分振荡20min，制成土悬液。
用移液枪吸取1mL悬液至盛有9mL无菌水的15mL离心管中，依次配备浓度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤稀释液。
分别从10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释液中取100μL土壤稀释液接种于PKO培养基上，涂布均匀。每个土壤稀释梯度做3个平行。
将涂布好的平板放于30℃恒温培养箱中倒置培养3～5d，待菌体长出后挑取四周透明圈大的单菌落(具有透明圈的菌落视为具有溶磷活性的菌落)，不断地在PKO固体培养基上进行划线纯化，纯化4次以上直至获得纯培养物。
挑取纯培养物接种至LB斜面培养基上，在30℃下培养2～3d后，4℃冰箱保存待用。挑取纯培养物接种至LB液体培养基中，在30℃、160r/min条件下培养至对数生长期后，菌悬液与30％浓度甘油以1:1的比例进行混合，放在-80℃冰箱中保存待用。
3、土壤杆菌DP3鉴定
(1)形态鉴定：
取纯培养物接种至LB液体培养基中，在30℃、160r/min条件下培养至对数生长期后，用移液枪吸取1mL菌液至盛有9mL无菌水的15mL离心管中，依次配备浓度为10-5、10-6、10-7的菌稀释液。吸取100μL 10-5、10-6、10-7稀释梯度的菌液接种至LB固体培养基中，用涂布器将菌液在平板上涂布均匀。每个稀释梯度做三个平行。将平板放置在30℃的恒温培养箱内培养48h，观察菌株的生长情况及菌落特征；挑取单菌落置于洁净玻片上，革兰氏染色，然后在光学显微镜下观察细胞形态及染色情况。
形态鉴定结果为：菌体为革兰氏阴性细菌，无芽孢，单个或成对排列。在LB培养基上培养48h后，菌落呈圆形，光滑(图1)。电子显微镜下呈杆状，大小为(1.5～0.3)μm×(0.6～1.0)μm(图2)。
(2)生理生化特征鉴定
菌种DP3生理生化特性测定依据《常用细菌***鉴定手册》和API 20NE说明书。
菌种DP3的触酶和氧化酶均为阳性。具体生理生化实验结果见表1。
表1DP3菌种的生理生化特征鉴定
Figure BDA0002865252030000061
Figure BDA0002865252030000071
+：阳性；-：阴性
(3)16S rDNA序列分析
采用细菌总DNA提取试剂提取菌株基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行扩增。采用100μL16S rDNA反应体系：Taq(5U/μL)0.8μL；10×PCR Buffer(Mg2+Plus)10μL；dNTP Mixture(2.5mM/each)8μL；模板DNA 2.5ng；引物F1(10μmol/L)2μL，引物R1(10μmol/L)2μL；ddH2O补足到100μL。反应条件为95℃5min；95℃1min，57℃1min，72℃1min20sec，共计30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物测序后用BLAST进行相似性搜索和同源性比对，采用ClustalX2.0进行序列比对分析，采用MEGA7软件临位连接法显示DP3的16S rDNA***发育树(图3)。
鉴定结果为土壤杆菌。
实施例2溶磷菌的耐盐碱程度实验
1、溶液的配置
不同梯度盐碱度溶液的配置：设置盐度为0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、3.0g/L，设置碱度为7.2、7.6、8.0、8.4，共20个处理。盐度用氯化钠配置，碱度用盐酸和氢氧化钠调节。
无盐度LB液体培养基的配置：胰蛋白胨5g/L，酵母抽提物2.5g/L，去离子水1000mL，pH自然。
2、不同盐碱度下DP3的生长曲线测定
将菌种DP3接种到液体LB培养基，培养至OD＝0.1(菌密度约为108个/mL)后，放入4℃冰箱保存，备用。
以5％的接种量将OD＝1.0的菌液接种到含10％无盐度LB的不同盐碱度的培养基中，每隔两个小时在600nm波长下测一次吸光度。
结果表明，溶磷菌DP3有较强的耐盐碱性。当pH为7.2、7.6时，DP3在盐度为1.0g/L的条件下达到的菌密度最高，最大吸光度分别达到0.603和0.622。当pH为8.4时，DP3在盐度3.0g/L时达到最大比生长速率，最大比生长速率为0.02651/h。
实施例3溶磷菌DP3接种下的玉米发芽实验
选取粒大圆润、籽粒饱满的玉米种子，用70％无水乙醇浸泡2min消毒后，用自来水冲洗干净。每个培养皿上覆上滤纸、播种10粒玉米种子后，接种109个DP3菌，并用不同盐碱梯度的水浇灌。盐度梯度为0.1g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、3.0g/L，碱度梯度为7.2、7.6、8.0、8.4，共20个处理。每个盐碱梯度设置两个平行。从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买的同样有溶磷能力的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)作对照。观察一周后玉米种子的发芽情况。
结果表明，接种DP3的玉米种子在任意碱度、盐度为3.0g/L时，发芽率均能达到70％以上，而接种Bacillus megaterium的玉米种子在同样的盐碱度环境下时，发芽率不超过40％。这表明，接种DP3的玉米种子在更高的盐碱度条件下更能促进玉米种子的发芽。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一株土壤杆菌DP3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用
<130> 2010
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1366
<212> DNA
<213> 土壤杆菌（Agrobacterium sp.）DP3 16S rDNA
<400> 1
gcttacacat gcaagtcgag cgccccgcaa ggggagcggc agacgggtga gtaacgcgtg 60
ggaatctacc gagccctgcg gaatagctcc gggaaactgg aattaatacc gcatacgccc 120
tacgggggaa agatttatcg gggtttgatg agcccgcgtt ggattagcta gttggtgggg 180
taaaggccta ccaaggcgac gatccatagc tggtctgaga ggatgatcag ccacattggg 240
actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg 300
caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgaaggccc tagggttgta aagctctttc 360
aacggtgaag ataatgacgg taaccgtaga agaagccccg gctaacttcg tgccagcagc 420
cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg 480
cggatattta agtcaggggt gaaatcccgg ggctcaacct cggaactgcc tttgatactg 540
ggtatcttga gtatggaaga ggtaagtgga attgcgagtg tagaggtgaa attcgtagat 600
attcgcagga acaccagtgg cgaaggcggc ttactggtcc attactgacg ctgaggtgcg 660
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg 720
ttagccgtcg ggcagtatac tgttcggtgg cgcagctaac gcattaaaca ttccgcctgg 780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gctcttgaca ttcggggtat 900
gggcagtgga gacattgtcc ttcagttagg ctggccccag aacaggtgct gcatggctgt 960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccctt 1020
agttgccagc atttagttgg gcactctaag gggactgccg gtgataagcc gagaggaagg 1080
tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg 1140
tggtgacagt gggcagcgag acagcgatgt cgagctaatc tccaaaagcc atctcagttc 1200
ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cagatcagca 1260
tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg 1320
ttttacccga aggtagtgcg ctaaccgcaa ggaggcagct aaccac 1366

Claims (11)

1.一株土壤杆菌DP3（Agrobacterium sp.），其特征在于，所述菌株已于2020年12月7日保藏于国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其生物保藏号为：CGMCC No. 21306；
所述的土壤杆菌DP3具有 SEQ ID NO :1所示的16S rDNA 序列。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的土壤杆菌DP3。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂剂型为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
5.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
6.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂可为下述1)-6)中的任一菌剂：
1)用于溶磷的菌剂；
2)促进植物生长的菌剂；
3)改良培肥土壤的菌剂；
4)降低植物对逆境敏感性的菌剂；
5)提高植物抗逆性的菌剂；
6)修复土壤生态的菌剂。
7.权利要求1所述的土壤杆菌DP3或权利要求2-6任一项所述的菌剂在制备生物肥料领域的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物肥料的使用方式包括直接施用于土壤中或对作物种子进行处理。
9.一种生物肥料，其特征在于，所述生物肥料包括权利要求1所述的土壤杆菌DP3、权利要求2-6任一项所述的菌剂。
10.一种土壤改良剂，其特征在于，所述土壤改良剂中包括权利要求9所述的生物肥料。
11.如权利要求10所述的土壤改良剂，其特征在于，所述土壤改良剂中还包括具有土壤改良活性的物质，所述土壤改良活性包括多糖类、碱性硅酸盐类、具开张孔隙的合成泡沫、腐植酸类改良剂或抑盐剂。
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