CN114231425A - 一株溶磷解钾菌黑曲霉z8及应用 - Google Patents

一株溶磷解钾菌黑曲霉z8及应用 Download PDF

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Abstract

一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8及应用，它涉及微生物学领域，本发明的目的是为了提供一种兼具有溶磷解钾功能的菌株。本发明的溶磷解钾菌黑曲霉(Aspergillus niger)Z8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2021年12月3日，保藏编号：CCTCC No.M20211526。它作为溶磷解钾的促进剂促进作物生长。本发明应用于农业领域。

Description

一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8及应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体涉及一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8及应用。
背景技术
磷、钾是农作物生长必须的营养元素，磷可以参与植物呼吸作用、细胞***、能量转化和生物合成等重要的生理生化过程。钾能激活植物体内多种酶，调节光合速率，促进三磷酸腺苷(ATP)和糖类的产生，调节气孔运动，是调节植物对干旱、盐分、氧化胁迫和细胞凋亡等非生物胁迫的适应性反应的重要信号因子。土壤中的磷、钾是植物所需磷、钾的主要来源，但土壤中磷、钾的存在有多种形态，不同形态对作物的有效性是不同的。土壤中95％以上的磷元素以难溶性的磷酸盐等无效形式存在，不能被植物直接吸收利用。土壤中90％以上的钾都存在于钾长石和云母等硅酸盐矿物中，它们是难溶的，需要经过漫长时间的风化，才能释放出钾。
为了促进作物生长，改善农产品质量，绝大多数农作物都要追施磷肥、钾肥，这些化学肥料不仅利用率较低、浪费矿产资源，还会造成土壤酸化、板结、有机质含量降低和水体富营养化等问题。我国耕地土壤中农作物可直接利用的磷钾养分严重匮乏，大量施用化肥的同时也对生态平衡和环境保护造成了影响，制约了农业的发展。微生物的肥料能促进植物生长，提高植物抗逆性，有效缓解土壤、水体污染，具有较好的应用价值和生态效益。溶磷解钾菌能将土壤中的难溶性或不溶性磷、钾转化为可被植物吸收利用的有效磷、钾，但目前对于可用作微生物肥料的菌株分离较少，且研究大多以单一功能为主，对于兼具有溶磷解钾功能的菌株研究报道鲜见。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种兼具有溶磷解钾功能的菌株。提出了一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8及应用。
本发明的一株溶磷解钾菌黑曲霉(Aspergillus niger)Z8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2021年12月3日，保藏编号：CCTCCNo.M20211526。
本发明的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，它作为溶磷解钾的促进剂促进作物生长。
进一步地，所述的作物为大豆。
进一步地，所述促进剂的制备方法为：
将浓度为1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液按照1％的接种量接种至黑曲霉发酵液中，在28℃培养5d，得到发酵液即为促进剂；所述的黑曲霉发酵液为：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.1g、MgCl2·6H2O 5g、Ca3(PO4)2 5g、钾长石粉2.5g和蒸馏水1000mL；pH＝7.0。
进一步地，所述的促进剂使用方法为：
将大豆种子置于相同环境培养发芽，每3株大豆芽放入50mL培养瓶，每瓶加入30mL土壤浸液，黑曲霉发酵液浓度为1.0％，保持光照培养。
进一步地，所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入孢子悬液，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液为 1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液；其中，每1粒大豆种子加入2mL孢子悬液。
进一步地，所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入2mL孢子悬液混合物，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液混合物是由浓度为1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为0.5％磷酸钙和质量浓度为1.5％的钾长石粉的浓度设混合而成；其中，每1粒大豆种子加入2mL孢子悬液。
进一步地，所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入小球，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的小球是由浓度为 1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为4.5％海藻酸钠、质量浓度为1％的骨炭粉和质量浓度为2.5％二氧化硅混合后，将混合液滴加至质量浓度为1％氯化钙溶液中，得到直径为3～5mm的小球，在4℃冰箱内固定4h；其中，每1粒大豆种子加入2g孢子悬液。
进一步地，所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入小球，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液缓释剂是由浓度为1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为4.5％海藻酸钠、质量浓度为1％的骨炭粉、质量浓度为2.5％二氧化硅、质量浓度为0.5％磷酸钙、质量浓度为1.5％钾长石粉混合后，将混合液滴加至质量浓度为1％氯化钙溶液中，得到直径为3～5mm的小球，在4℃冰箱内固定4h；其中，每1粒大豆种子加入2g孢子悬液。
本发明以黑龙江省农业科学院民主示范区生态试验田为采样点，采集大豆根际土壤，装入灭菌样品袋用冰袋保鲜带灰实验室，对采集土壤进行过筛风干处理，然后对大豆根际微生物进行分离、筛选和纯化：
一、梯度稀释涂布法
称取根际土壤10g，放入盛有90mL无菌蒸馏水的三角瓶中，于28℃、150r/min震荡培养1d。在超净工作台中将菌悬液使用移液枪吸取1mL依次稀释到装有9mL蒸馏水已灭菌试管中，稀释梯度分别为10-2、10-3、10-4。摇匀稀释的试管，吸取100μL加到 PDA固体培养基中，进行涂布，待等到固体培养基表面液体干涩即可，将平板置于28℃恒温培养箱培养3-4d，观察菌落生长。
二、真菌的分离与纯化
选取菌落清晰的稀释涂布平板，在超净工作台中，使用接种环挑取菌丝体，在PDA固体培养基上进行四区划线，将平板置于28℃恒温培养箱培养4-5d，观察四区单菌落的生长情况。取单菌落清晰的四区平板，挑取菌丝体，在PDA固体培养基上进行一区划线，将一区划线平板置于28℃恒温培养箱培养4-5d，待一区划线平板长出菌株后，观察是否为纯化菌株，若不是则重复上述步骤，直至菌株纯化。
三、溶磷解钾菌的筛选
挑取纯化菌株接种至溶磷固体培养基上，28℃倒置恒温培养5d。观察其生长状态，测量透明圈直径(D)与菌落直径(d)，计算D/d比值，出现透明圈的菌株即为溶磷菌株。挑取纯化溶磷菌株，接种至解钾固体培养基上，28℃倒置恒温培养5d。观察其生长状态，测量透明圈直径(D)与菌落直径(d)，计算D/d比值，如出现透明圈，则说明菌株为溶磷解钾菌，根据菌株生长速度和D/d比值，筛选出效果较好的菌进行以下实验。
在50mL三角瓶中配置溶磷解钾液体培养基，将筛选得到的菌株制作孢子悬液(浓度为1×107)，以1％的浓度接种于溶磷解钾液体培养基中，震荡培养8d，培养结束后，离心(8000r/min，10min)分离获得的滤液稀释后通过钼锑抗比色法测量液体中可溶性磷含量，将离心所得固相(矿物与真菌菌丝)放回三角烧瓶中，加入100mL浓度为1mol/L NH4Ac后超声振荡30min，二次离心(8000r/min，10min)分离，所得滤液、浸出液通过电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)进行测量。
四、溶磷解钾菌的鉴定
观察菌株Z8形态特征：菌落初为白色后变为黑色、厚绒状、圆形；直径为28～35mm，菌丝体颜色呈黑色，孢子体为球形、黑褐色；具有浅黄色的渗出液。
菌株活化后用液氮研磨后提取真菌总DNA，利用真菌ITS序列的PCR通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行。PCR扩增扩增产物送于南昌科畅生物科技有限公司测序。得到的测序结果于GenBank 数据库中进行BLAST的比对，挑选出同源性较高的序列，并应用MEGA7.0软件构建***发育树。利用Clustal软件与GenBank的序列进行同源性比较(图1)。菌株Z8与黑曲霉(Aspergillusniger)的同源性达100％，通过形态学和ITS序列鉴定可知菌株Z8为黑曲霉(Aspergillusniger)。
本发明包含以下有益效果：
本发明筛选的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8具有溶磷解钾功能，可促进大豆生长，减少化肥的使用量，提升土壤肥力，在农业生产上具有重要意义。
附图说明
图1为Z8菌株***发育树图；图中，MK271296:Z8；KJ778683.1:黑曲霉；
图2为Z8菌株溶磷量、解钾量数据图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例
采用水培实验验证黑曲霉(Aspergillus niger)Z8对大豆的促生作用，设置CK为对照组，只添加土壤浸液，处理组采用权力要求书5方案实施，同时设置不同浓度菌液处理。
通过水培实验证明(表1)，黑曲霉Z8可显著促进大豆生长，其中1.0％浓度时，促生效果最佳。
表1不同菌液处理对大豆幼苗生物量
Figure RE-GDA0003514981730000041
Figure RE-GDA0003514981730000051
采用盆栽实验验证黑曲霉(Aspergillus niger)Z8对大豆的促生作用，设置CK为对照组，无菌水浸泡大豆种子2h，每盆栽种6粒大豆种子，保持土壤湿润。
处理组T1为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入孢子悬液，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液为 1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液；其中，每1粒大豆种子加入2mL孢子悬液。
处理组T2为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入2mL孢子悬液混合物，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液混合物是由浓度为1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为0.5％磷酸钙和质量浓度为1.5％的钾长石粉的浓度设混合而成；其中，每1粒大豆种子加入2mL孢子悬液。
处理组T3为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入固定化小球，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的固定化小球是由浓度为1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为4.5％海藻酸钠、质量浓度为1％的骨炭粉和质量浓度为2.5％二氧化硅混合后，将混合液滴加至质量浓度为1％氯化钙溶液中，得到直径为3～5mm的小球，在4℃冰箱内固定4h；其中，每 1粒大豆种子加入2g孢子悬液。
处理组T4为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入小球，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液缓释剂是由浓度为1×107 cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为4.5％海藻酸钠、质量浓度为1％的骨炭粉、质量浓度为2.5％二氧化硅、质量浓度为0.5％磷酸钙、质量浓度为1.5％钾长石粉混合后，将混合液滴加至质量浓度为1％氯化钙溶液中，得到直径为3～5mm的小球，在4℃冰箱内固定4h；其中，每1粒大豆种子加入2g孢子悬液。
通过盆栽实验证明(表2)，黑曲霉Z8可显著促进大豆生长，显著提高大豆植株株高、根长、鲜重、干重、可溶性糖、可溶性蛋白含量(p<0.05)。
表2黑曲霉对大豆生长的影响
Figure RE-GDA0003514981730000061
对本实施例的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8溶磷、解钾进行测量，测得黑曲霉Z8溶磷解钾效果较好，溶磷量为363.17mg/L，解钾量为104.63mg/L。本发明筛选的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8具有溶磷解钾功能，可促进大豆生长，减少化肥的使用量，提升土壤肥力，在农业生产上具有重要意义。

Claims (9)

1.一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8，其特征在于，它为黑曲霉(Aspergillus niger)Z8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2021年12月3日，保藏编号：CCTCC No.M20211526。
2.如权利要求1所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于它作为溶磷解钾菌的促进剂促进作物生长。
3.根据权利要求2所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述的作物为大豆。
4.根据权利要求2所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述促进剂的制备方法为：
将浓度为1×107cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液按照1％的接种量接种至黑曲霉发酵液中，在28℃培养5d，得到发酵液即为促进剂；所述的黑曲霉发酵液为：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.1g、MgCl2·6H2O 5g、Ca3(PO4)2 5g、钾长石粉2.5g和蒸馏水1000mL；pH＝7.0。
5.根据权利要求2或4所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述的促进剂使用方法为：
将大豆种子置于相同环境培养发芽，每3株大豆芽放入50mL培养瓶，每瓶加入30mL土壤浸液，黑曲霉发酵液质量浓度为1.0％，保持光照培养。
6.根据权利要求2或4所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入孢子悬液，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液为1×107cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液；其中，每1粒大豆种子加入2mL孢子悬液。
7.根据权利要求2或4所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入2mL孢子悬液混合物，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液混合物是由浓度为1×107cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为0.5％磷酸钙和质量浓度为1.5％的钾长石粉的浓度设混合而成；其中，每1粒大豆种子加入2mL孢子悬液。
8.根据权利要求2或4所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入固定化小球，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的固定化小球是由浓度为1×107cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为4.5％海藻酸钠、质量浓度为1％的骨炭粉和质量浓度为2.5％二氧化硅混合后，将混合液滴加至质量浓度为1％氯化钙溶液中，得到直径为3～5mm的小球，在4℃冰箱内固定4h；其中，每1粒大豆种子加入2g孢子悬液。
9.根据权利要求2或4所述的一株溶磷解钾菌黑曲霉Z8的应用，其特征在于所述的促进剂使用方法为：
将大豆浸泡在无菌水2h后，在土壤中挖出栽培坑，加入小球，覆盖一层土壤，放入浸泡后的大豆种子，再覆盖一层土壤，保持土壤湿润，即完成；所述的孢子悬液缓释剂是由浓度为1×107cuf/mL的黑曲霉(Aspergillus niger)Z8的孢子悬液、质量浓度为4.5％海藻酸钠、质量浓度为1％的骨炭粉、质量浓度为2.5％二氧化硅、质量浓度为0.5％磷酸钙、质量浓度为1.5％钾长石粉混合后，将混合液滴加至质量浓度为1％氯化钙溶液中，得到直径为3～5mm的小球，在4℃冰箱内固定4h；其中，每1粒大豆种子加入2g孢子悬液。
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