CN114317227A - 一种外泌体纯化方法及其一体机装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外泌体纯化一体化方法，包括S1二次两级切向超滤、S2待提取液前处理、S3外泌体粒径、浓度检测以及S4冻干的步骤，本发明还提供了外泌体纯化一体化装置。通过本发明能够较好地纯化外泌体，具有较高的实用价值，解决目前市面上常规外泌体纯化方法纯化过程繁琐、历时较长、成本高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种外泌体纯化方法及一体机装置。
背景技术
2013年，诺贝尔生理或医学奖授予研究细胞囊泡运输调控机制领域研究的三位科学家，之后外泌体研究逐渐成为科研热点。外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，广泛存在于细胞培养上清液、血液、唾液、尿液、***、羊水以及其它生物体液中。其携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，可以调控细胞代谢、细胞凋亡以及免疫调节等作用，可作为医疗美容、再生医学、疾病诊断等行业，被誉为细胞治疗的下一个前沿领域。
目前，外泌体的分离富集提取方法主要靠人工操作，主要技术方法包括离心、沉淀、超滤、免疫亲和及微流控等，并借助流式细胞术和纳米颗粒示踪分析技术对外泌体粒径大小参数等进行定量分析，以便保证外泌体质量。随着科学技术的发展和人们健康观念和追求美的观念的普及，外泌体市场需求变大，传统外泌体分离技术方法规模化提取分离与纯化受限产能不足，造成外泌体供不应求。
由于当前外泌体分离提取多为人工操作，整个分离提取过程繁琐，历经时间较长，现有自动分离提取设备产量低，耗时长，成本高，难以满足市场需求。各外泌体商家迫切需要一套能够快速、大量、优质获取高纯度外泌体制备平台。但是外泌体纯化过程中的超速离心法，过程繁琐，耗时耗力，对操作人员经验依赖性强，收集结果重复性差，回收率低，限制了其在外泌体工业化生产和临床应用；亲和层析、离子交换层析等层析法具备一定的工业纯化生产中，虽然可对目标纯化物进行定量、浓度检测等，但受制于层析柱的对进料样品的PH、缓冲和电导率以及纯化物自身的等电点等参数要求，在工业化进程中具有一定的局限性；免疫磁珠法和微流控法成本较高，经济性差，技术要求较高，适于微量纯化操作，难以大规模制备等问题；此外，对于原料样品中外泌体含量浓度测定和产出的外泌体粒径质量检测也成为商家们的迫切需求，市面上TFF(切向流)、FPLC(快速蛋白液相色谱)、NTA(纳米颗粒跟踪分析)技术独立运行使用限制了整个外泌体行业的发展，难以满足人们对外泌体系列产品日益增长的需求。因此具有外泌体定量检测颗粒示踪分析并可规模化生产的一体机产品成为各大科研院所、高校和企业厂商的迫切需求。同时，整合一套集成TFF、FPLC、NTA技术并具有兼容操作***的一体机迫在眉睫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种外泌体纯化方法，以解决目前市面上常规外泌体纯化方法纯化过程繁琐、历时较长、成本高的问题。
为解决上述问题，本发明提供一种外泌体纯化方法，包括以下步骤：
S1二次两级切向超滤：将含有外泌体的待提取液通入第一级切向流超滤装置，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将所述渗透液泵入第二级切向流超滤装置，进一步过滤后得到富集液；
所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于于所述外泌体直径，使得外泌体能够穿过第一级切向流超滤***的超滤膜且无法穿过第二级切向流超滤的超滤膜；
S2待提取液前处理:将S1中得到的富集液经过滤膜超滤后通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；
S3外泌体粒径、浓度检测：将步骤S2得到的层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果；
S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。
本发明上述的方法通过二次两级切向流超滤，极大提高外泌体的分离纯度，具有缩短分析周期，提高分离纯化能力，增加灵敏度的优点；通过第一级切向流超滤膜的过滤，先将样本中的细胞、细胞碎片、凋亡小体过滤掉得到渗透液，再通过第二级切向流超滤膜的过滤，将外泌体渗透液二次切向流超滤得到富集液，纳米颗粒跟踪分析仪对富集液中的外泌体粒径进行分析，根据外泌体参数结果反馈给切向流超滤***再纯化，保证纯化质量；富集液冻干后得到纯度和回收率较高的外泌体冻干粉。通过本发明的方法可实现高通量、大规模、工厂化外泌体的提取分离富集，解决外泌体产能不足的问题，进而满足市场需求。本发明通过运用快速蛋白液相层析(FPLC)技术和纳米颗粒示踪分析(NTA)技术，并结合成熟的切向流超滤(TFF)技术，通过改进切向流超滤法为二次两级切向超滤，在快速蛋白液相层析方法原有基础上提高纯化效率，整合NTA对富集后的外泌体进行粒径示踪分析,三项技术结合作为外泌体纯化的核心步骤，后并将提取得到的外泌体进行冻干操作最终制备获得纯度较高的外泌体；相对于超速离心、尺寸排阻色谱和免疫沉淀方法，超滤技术具有时间短，简单高效的优点，切向流超滤更加有效减少对外泌体的损伤，可用于高纯度、高通量大规模工厂化样品的分离纯化生产。
作为优选的方案，其特征在于：所述步骤S2中，所述第一级TFF超滤膜的孔径大于等于0.18μm，所述第二级TFF超滤膜的孔径小于等于0.03μm。
作为优选的方案，所述步骤S4的具体操作为：在富集液中加入赋形剂，之后将富集液装瓶后转入真空冷冻干燥机，冻干后得到冻干粉。
作为优选的方案，所述步骤S2中，层析处理的条件如下：层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，PH7.9；洗脱液为0.06MTris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。
作为优选的方案，所述步骤S3中，所述层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液的体积配比为6：4。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述含有外泌体的待提取液包括细胞上清液、血液、尿液、唾液、羊水、尿液、***中的一种或多种。；
作为优选的方案，所述步骤S3中，还包括对富集液中外泌体的浓度以及粒径范围进行监测的步骤：检测外泌体浓度范围大于等于109个/ml，粒径范围为30nm-150nm，若外泌体的浓度以及粒径范围处于上述范围中，则进入步骤S4；若外泌体的浓度以及粒径范围不处于上述任一范围中，则重返步骤S2进行二次切向超滤处理。
本发明要解决的另一个技术问题是：提供一种外泌体纯化一体机装置，以解决目前市面上常见外泌体纯化设备生产效率低，操作复杂的问题。
为解决上述问题，本发明提供了一种外泌体纯化一体机设装置，包括通过管路连通的切向流超滤***、快速蛋白液相色谱***、纳米颗粒示踪分析***以及用于驱动的蠕动泵；所述切向流超滤***包括相连通的第一级切向流超滤装置与第二级切向流超滤装置，所述第一级切向流超滤装置与第二级切向流超滤装置内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤***超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤***超滤膜的孔径；所述第二级切向流超滤装置与所述快速蛋白液相色谱***的进口相连接，所述快速蛋白液相色谱***的出口与纳米颗粒示踪分析***相连接。
作为优选的方案，所述第一级切向流超滤装置上设置有第一级进口、第一级出口，所述第二级切向流超滤装置上设置有第二级进口、第二级出口，且所述第一级出口与所述第二级进口相连通。
作为优选的方案，所述纳米颗粒示踪分析***还与所述第一级进口相连通。
作为优选的方案，所述快速蛋白液相色谱***还与一冻干冷藏***相连接。
作为优选的方案，所述冻干冷藏***包括机械驱动装置、冷冻干燥机、低温仓储空间，且所述机械驱动装置用于将冷冻干燥机冷冻后的产品移动至低温仓储空间。
本发明所提供的设备通过二次两级切向流超滤，极大提高外泌体的分离纯度，具有缩短分析周期的优点，提高了分离纯化能力，增加了灵敏度，采用“TFF+FPLC+NTA”的“三明治汉堡”结构模型，将各***顺序串联配置，待提取液体样本在蠕动泵外压下通过TFF、FPLC、NTA以对外泌体进行自动化前处理、浓度含量检测、富集纯化和粒径分析操作，其纯度、质量达到收集要求后，富集纯化液经真空冷冻干燥机冻干为冻干粉，制备获得的冻干粉中，外泌体的纯度较高。
附图说明
图1为本发明中外泌体纯化一体化设备的结构示意图；
图2为本发明的工作原理示意图；
图3为本发明的工作过程图。
附图标记说明：
1、切向流超滤***；11、第一级切向流超滤装置；111、第一级进口；112、第一级出口；12、第二级切向流超滤装置；121、第二级进口；122、第二级出口；2、快速蛋白液相色谱***；3、纳米颗粒示踪分析***；4、冷冻干燥机；5、机械驱动装置；6、低温仓储空间。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例1：
本实施例提供了外泌体纯化一体化设备，具体包括通过管路依次相连通的切向流超滤***1、快速蛋白液相色谱***2、纳米颗粒示踪分析***3以及用于驱动的蠕动泵；所述蠕动泵用于驱动设备内部液体的流动；通过加入含有外泌体的待提取液至设备中，待提取液依次流经切向流超滤***1、快速蛋白液相色谱***2、纳米颗粒示踪分析***3完成外泌体的纯化；
所述切向流超滤***1包括相连通的第一级切向流超滤装置11与第二级切向流超滤装置12，所述第一级切向流超滤装置11上设置有第一级进口111、第一级出口112，所述第二级切向流超滤装置12上设置有第二级进口121、第二级出口122，且所述第一级出口112与所述第二级进口121相连通，使得通入的待提取液先进入至第一级切向流超滤装置11进行超滤，之后流入到第二级切向流超滤装置12中进行再次地超滤；
所述第一级切向流超滤装置11与第二级切向流超滤装置12内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤***1超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤***1超滤膜的孔径；且第二级切向流超滤***1超滤膜的孔径小于通入的待提取液中外泌体的直径；
所述第二级切向流超滤装置12与所述快速蛋白液相色谱***2的进口相连接，所述快速蛋白液相色谱***2的出口与纳米颗粒示踪分析***3相连接；
所述快速蛋白液相色谱***2还与一冻干冷藏***相连接，所述冻干冷藏***包括机械驱动装置5、冷冻干燥机4、低温仓储空间6，且所述机械驱动装置5用于将冷冻干燥机4冷冻后的产品移动至低温仓储空间6。
实施例2：
本实施例提供了一种外泌体的纯化方法，包括以下步骤：
S1二次切向超滤：将含有外泌体的带提取液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体，将其截留，回收过滤液得到富集液；
所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；且所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.18μm，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.03μm；
S2富集液处理：将缓冲液流动相经过真空抽滤或超声15min脱气处理以除去气泡；快速蛋白液相色谱设备的进口管从20％乙醇保护液先转移至去离子水泵冲洗，后转移至缓冲液泵冲洗，其流速0.7mL/min，泵压报警0.2MPa。
将富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；
本实施例中，层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5MNaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。
S3外泌体粒径、浓度检测：先后使用1mL酒精、1mL纯水冲洗纳米颗粒追踪分析仪的检测窗，再将步骤S2得到的层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液以体积比6:4进行混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，检测外泌体浓度范围是否达到109个/ml，粒径范围30nm-150nm，若达到则进入S4步骤，若未达到则再次返回步骤S2中进行二次切向过滤处理；
S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏***由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警***。
实施例3：
本实施例提供了一种外泌体的纯化方法，包括以下步骤：
S1二次切向超滤：将含有外泌体的带提取液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体，将其截留，回收过滤液得到富集液；
所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；且所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.19μm，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.02μm；
S2富集液处理：将缓冲液流动相经过真空抽滤或超声15min脱气处理以除去气泡；快速蛋白液相色谱设备的进口管从20％乙醇保护液先转移至去离子水泵冲洗，后转移至缓冲液泵冲洗，其流速0.7mL/min，泵压报警0.2MPa。
将富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；
本实施例中，层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5MNaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。
S3外泌体粒径、浓度检测：先后使用1mL酒精、1mL纯水冲洗纳米颗粒追踪分析仪的检测窗，再将步骤S2得到的层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液以体积比6:4进行混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，检测外泌体浓度范围是否达到109个/ml，粒径范围30nm-150nm，若达到则进入S4步骤，若未达到则再次返回步骤S2中进行二次切向过滤处理；
S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏***由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警***。
实施例4：
本实施例提供了一种外泌体的纯化方法，包括以下步骤：
S1二次切向超滤：将含有外泌体的带提取液通入第一级切向流超滤装置中，并通过第一级超滤膜，将超滤后的目液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将继续所述渗透液流经所述第二级切向流超滤装置中，经所述第二级切向流超滤装置的超滤膜孔径小于所述外泌体，将其截留，回收过滤液得到富集液；
所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；且所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.20μm，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径为0.01μm；
S2富集液处理：将缓冲液流动相经过真空抽滤或超声15min脱气处理以除去气泡；快速蛋白液相色谱设备的进口管从20％乙醇保护液先转移至去离子水泵冲洗，后转移至缓冲液泵冲洗，其流速0.7mL/min，泵压报警0.2MPa。
将富集液通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；
本实施例中，层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5MNaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。
S3外泌体粒径、浓度检测：先后使用1mL酒精、1mL纯水冲洗纳米颗粒追踪分析仪的检测窗，再将步骤S2得到的层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液以体积比6:4进行混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果，检测外泌体浓度范围是否达到109个/ml，粒径范围30nm-150nm，若达到则进入S4步骤，若未达到则再次返回步骤S2中进行二次切向过滤处理；
S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。冻干冷藏***由一个冷冻干燥机、机械臂、低温仓储组成(图中未标示)。将层析液在冷冻干燥机里进行冻干，由机械臂分装到西林瓶里，然后再由机械臂转移到低温仓储里面。低温仓储自带仓满报警***。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种外泌体纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1二次两级切向超滤：将含有外泌体的待提取液通入第一级切向流超滤装置，将超滤后的液体回收得到渗透液，将杂质截留；之后将所述渗透液泵入第二级切向流超滤装置，进一步过滤后得到富集液；
所述第一级切向流超滤装置内超滤膜的孔径大于所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径，所述第二级切向流超滤装置内超滤膜的孔径小于所述外泌体直径；
S2待提取液前处理:将S1中得到的富集液经过滤膜超滤后通入至快速蛋白液相色谱设备中进行层析处理后得到层析后的液体；
S3外泌体粒径、浓度检测：将步骤S2得到的层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液混合后注入纳米颗粒追踪分析仪中进行粒径以及浓度的分析检测并反馈数据结果；
S4冻干:将富集液进行冻干处理后得到冻干粉，完成外泌体的纯化。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体纯化方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述第一级TFF超滤膜的孔径大于等于0.18μm，所述第二级TFF超滤膜的孔径小于等于0.03μm。
3.根据权利要求1所述的一种外泌体纯化方法，其特征在于，所述步骤S4的具体操作为：在富集液中加入赋形剂，之后将富集液装瓶后转入真空冷冻干燥机，冻干后得到冻干粉。
4.根据权利要求1所述的一种外泌体纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，层析处理的条件如下：层析柱选用亲和层析柱，平衡液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，PH7.9；洗脱液为0.06M Tris-HCl，0.5M NaCl，0.6M咪唑，PH7.9；平衡4个柱床，洗脱1个柱床，流速为4mL/min。
5.根据权利要求1所述的一种外泌体纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述层析后的液体与磷酸盐缓冲溶液的体积配比为6：4。
6.根据权利要求1所述的一种外泌体纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述含有外泌体的待提取液包括细胞上清液、血液、尿液、唾液、羊水、尿液、***中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种外泌体纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，还包括对富集液中外泌体的浓度以及粒径范围进行监测的步骤：检测外泌体浓度范围大于等于109个/ml，粒径范围为30nm-150nm，若外泌体的浓度以及粒径范围处于上述范围中，则进入步骤S4；若外泌体的浓度以及粒径范围不处于上述任一范围中，则重返步骤S2进行二次切向超滤处理。
8.一种外泌体纯化一体机装置，其特征在于：包括通过管路连通的切向流超滤***(1)、快速蛋白液相色谱***(2)、纳米颗粒示踪分析***(3)以及用于驱动的蠕动泵；所述切向流超滤***(1)包括相连通的第一级切向流超滤装置(11)与第二级切向流超滤装置(12)，所述第一级切向流超滤装置(11)与第二级切向流超滤装置(12)内均设置有超滤膜，且所述第一级切向流超滤装置(11)的超滤膜孔径大于所述第二级切向流超滤装置(12)的超滤膜孔径；所述第二级切向流超滤装置(12)与所述快速蛋白液相色谱***(2)的进口相连接，所述快速蛋白液相色谱***(2)的出口与纳米颗粒示踪分析***(3)相连接。
9.根据权利要求8所述的一种外泌体纯化一体机装置，其特征在于：所述第一级切向流超滤装置上设置有第一级进口(111)、第一级出口(112)，所述第二级切向流超滤装置上设置有第二级进口(121)、第二级出口(122)，且所述第一级出口(112)与所述第二级进口(121)相连通。
10.根据权利要求9所述的一种外泌体纯化一体机装置，其特征在于：所述纳米颗粒示踪分析***(3)还与所述第一级进口(111)相连通。
11.根据权利要求8所述的一种外泌体纯化一体机装置，其特征在于：所述快速蛋白液相色谱***(2)还与一冻干冷藏***相连接。
12.根据权利要求11所述的一种外泌体纯化一体机装置，其特征在于：所述冻干冷藏***包括机械驱动装置(5)、冷冻干燥机(4)、低温仓储空间(6)，且所述机械驱动装置(5)用于将冷冻干燥机(4)冷冻后的产品移动至低温仓储空间(6)。
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