CN215915744U - 一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备*** - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，包括依次连接的气源、进料组件、粗过滤组件、外泌体凝胶制备组件、分泌因子凝胶制备组件，所述的外泌体凝胶制备组件包括第一中间收集瓶、第一蠕动泵、第一循环泵、第一循环过滤膜池和固体温敏凝胶恒温孵化器，所述分泌因子凝胶制备组件包括第二中间收集瓶、第二蠕动泵、第二循环泵、第二循环过滤膜池和半流体温敏凝胶恒温孵化器，所述的第一中间收集瓶、第一循环泵、第一循环过滤膜池形成浓缩回路，所述的第二中间收集瓶、第二循环泵、第二循环过滤膜池形成浓缩回路。本发明可以一次性将干细胞来源的外泌体和分泌因子制备成相应的凝胶，其生产效率高，且结构简单，稳定可靠。

Description

一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***

技术领域

本专利发明涉及生物工程技术和整形美容及皮肤抗衰老的应用领域，特别涉及一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***。

背景技术

干细胞来源的外泌体（Exosome）是由干细胞旁分泌的重要组成部分，含有干细胞特有而重要的内含物和膜成分，具有与干细胞基本类似的生物学功能，同时可避免干细胞治疗可能造成的畸胎瘤、移植物免疫排斥等生物相容性问题。干细胞外泌体是密度范围约为1.11-1.19g/cm³，粒径大小约为30-150nm的双脂质膜性囊泡，由干细胞经内吞-组装-融合-外排的四个阶段不断产生并旁分泌的一类具有特殊生物活性的细胞分泌产物，即干细胞在生理条件下，干细胞的质膜凹陷形成细胞内小泡、细胞内小泡进一步组装并发展成多泡小体、多泡小体与细胞质膜融合之后向干细胞外释放外泌体。干细胞外泌体的主要功能是作为细胞间信使，将母细胞的重要功能物质运输到目的细胞体内，从而达到并实现调节目的细胞的特定功能。当它与细胞膜融合后，以胞吐形式释放入胞外环境中，即被吐分泌到干细胞外的外泌体通过配体-受体或者受体-配体等相互作用形式与邻近受体细胞或者靶细胞、远端受体细胞或者靶细胞接近、接触和结合，再进一步通过受体细胞或靶细胞的有效胞饮/吞噬或膜融合等作用方式逐步实现对干细胞外泌体的胞吞摄入，将其中的生物活性内含物，包括基因组、蛋白组、功能组、代谢组等mRNA和microRNA、蛋白质、多肽以及信号分子等携带到受体细胞或靶细胞之中，即干细胞外泌体的各种生物学信息和生物活性物质进入受体细胞或靶细胞后发挥并实现干细胞与受体细胞或靶细胞的细胞通讯联系和物质交换作用，从而诱导血管新生,抑制细胞凋亡,刺激细胞增殖分化,传递免疫调节信号,招募或重编程组织再生所需的细胞，从而最终发挥干细胞外泌体的各种不同的生物学效应和功能、以及对受体细胞或靶细胞的调控效应。由于干细胞外泌体中内含干细胞的诸多重要生物活性成分和功能物质(如脂质、蛋白质、mRNAs 以及 microRNAs 等)，因此，它的生物学作用和生理学功能备受关注。尤其是，当它与靶细胞相遇并直接接触后，外泌体膜上的配体或受体蛋白与靶细胞膜上的受体或配体蛋白特异性结合，之后即被靶细胞以胞吞或融合的形式将该外泌体及其携带的诸多生物活性分子接受并使之发挥相应的作用与功能。特别重要的是，被胞吞的该外泌体所携带生物分子中的微小非编码RNA(miRNAs)因其在基因表达调控上具有重要作用而受到广泛关注。不仅如此，干细胞外泌体还能够激活信号通路，促进皮肤再生，促进血管新生、胶原蛋白和弹性蛋白及网状蛋白合成，改变皮肤组织老化细胞的功能、加速损伤皮肤创面的修复与愈合。皮肤衰老的特征常常表现在皮肤组织学变化上的胶原合成减少，异常弹性纤维沉积，基质金属蛋白酶活性增强，对细胞外基质的降解增多。因此，干细胞外泌体对皮肤衰老的治疗与干预机制正好与皮肤创面愈合机制类似，从而也证明干细胞来源的外泌体在皮肤抗衰老领域也具有良好应用的价值和潜力。甚至有学者的实验研究认为，干细胞的诸多生物学作用和生理学功能实际是由干细胞外泌体在执行，这使得外泌体的应用具备极高的临床意义、商品化潜能和转化应用前景。因此，干细胞外泌体疗法目前被称之为“非干细胞的干细胞疗法”或者“来源于干细胞的无细胞疗法”。而且，确有大量研究报道，干细胞外泌体具有类似干细胞样的促进损伤组织修复再生功能、可显著促进皮肤缺损、下肢缺血、心肌损伤以及肾损伤等组织的再生修复等，移植干细胞外泌体既可发挥干细胞的功能又可回避直接移植干细胞时可能出现的风险或安全性问题，且干细胞外泌体易于保存和运输，且基本无免疫排斥反应、实际应用更安全等，已被国际同学科领域、特别是临床医学领域视为当今最具潜力、最有希望进入临床应用研究的，具有广阔应用前景和生命力。

干细胞分泌因子（Secrete factors）是由干细胞分泌的诸多具有高度生物活性的细胞因子、生长因子、趋化因子、迁移因子、聚集因子、粘附因子等，存在于体外培养干细胞的干细胞培养液中，该培养液也被称为干细胞的条件培养基。与其来源的干细胞相比，干细胞分泌因子的生物学作用也与其自身来源的干细胞具有独自的生物学功能及其作用特点，且干细胞分泌因子内无细胞成分，无需匹配供体和受体，可避免干细胞应用时的免疫排斥反应及伦理等问题、且也易于制备、冻干、包装和运输，还可制备成不同的剂型。因此，干细胞分泌因子与其来源的干细胞一样，在转化医学、再生医学、组织工程、抗衰老医学、整形美容等多学科领域同样具有广阔的应用价值和前景。目前，对干细胞分泌因子的提取制备方法最传统、最主要的制备方法还是采用在体外将干细胞从原代再传代培养至第3-6代使之达到65％-85％时，再采用无血清培养基不断培养时进行提取分离获得，即将此培养基在4℃条件下以低转速离心（2500-3500rpm/min）离心10min，再用0.22μｍ孔径过滤器去除细胞碎片，即可获得主要包括生长因子（如血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF、成纤维细胞生长因子FGF、血小板源性生长因子PDGF、胰岛样生长因子IGF、表皮生长因子EGF、角质形成细胞生长因子KGF、神经生长因子NGF、脑源性神经营养因子BDNF等）和抗炎细胞因子（如β-转化因子TGF-β、白细胞介素IL等）；此外，也存在粒细胞集落刺激因子GCFS、***素E2、神经营养素NT、单核细胞趋化蛋白-１等其中含有诸多生物活性干细胞分泌因子的干细胞培养上清液。然后，再采用超滤或透析法浓缩即可得到干细胞分泌因子。当然，也有根据环境因素对干细胞旁分泌功能影响的特性，即在体外培养干细胞时采用某些预处理的技术方法优化干细胞分泌因子产生的浓度和种类等，再按照常规方法离心、分离、浓缩、冷冻、干燥等。

然而，无论是干细胞所分泌的外泌体（干细胞外泌体），还是干细胞分泌的细胞生长因子（干细胞分泌因子），单纯应用时都会存在并同样面临着应用上的局限、不足和缺陷，其中最大的问题之一是应用干细胞外泌体或干细胞分泌因子时，不仅需要解决干细胞外泌体或分泌生长因子清除率高、易于降解等稳定性和半衰期等问题，而且尚需解决干细胞外泌体或分泌因子的缓释和控释的问题，亦即需要解决干细胞外泌体或干细胞分泌因子应用时的生物载体问题，也就是如何使干细胞外泌体或干细胞分泌因子等功能活性物质能更加牢固聚集在作用部位长时间发挥其应有的生物学作用和治疗效果的问题。而且，也面临着大规模化制备技术难度大等技术不足或缺陷问题。更重要的是，这些问题不仅影响到它们在临床治疗和实际应用的疗效，也限制了它们在多学科领域的应用。如现有干细胞外泌体制备技术中，无论是采用美国贝克曼公司的超大容量离心机的超高速梯度离心法，还是采用蔗糖溶液梯度离心法、聚乙二醇聚合沉淀法、尺寸排阻法、超滤法、免疫磁珠捕获法、液相色谱层析法、微控流芯片法、径迹蚀刻微膜滤法。还有相继研究的另外一些新的干细胞外泌体提取制备方法，包括纳米横向位移阵列，纳米定侧位移法（nano⁃deterministic lateraldisplacement，nano⁃DLD）等都不同程度存在这样或那样的局限、不足或缺陷。如美国贝克曼公司的超大容量离心机的超高速梯度离心法的局限、不足或缺陷主要表现在：第一：该设备耗时长，工作效率低；第二：获取的干细胞外泌体纯度不高，因为它通过密度离心，很容易将与外泌体密度接近的一部分成分（如非外泌体多囊泡、微泡、凋亡小体、自噬体等）也会混入获取的干细胞外泌体中，其分离不够精准，分离效果不是很好；第三：采用该设备分离外泌体，在设备高度运转的情况下，外泌体容易破溃，对外泌体损伤严重；第四：该设备耗电大；第五：该设备较大型，操作不当，容易产生安全隐患；第六：该设备获取外泌体时，处于开放式的环境，它要从离心机里拿出来，然后把离心机离心管打开，分离液体反复转移，容易被环境污染或者交叉污染，从而导致未来难以在医学研究和临床治疗应用等。而采用蔗糖密度梯度离心法制备干细胞外泌体是根据外泌体在一定浓度蔗糖密度梯度溶液中被富集的特点，具体操作时是将两种不同浓度蔗糖溶液配制成连续的梯度体系，置入超离管后，再将样品铺在溶液上，并将离心机设置4°C条件下、以离心力100000ｇ超速离心70-90min，虽可获得较高纯度干细胞外泌体，但是采用蔗糖密度梯度离心法制备干细胞外泌体，其前期准备工作较超速离心法更为繁琐，也同样耗时更长，加上添加不同浓度蔗糖溶液配制成连续的梯度体系，严重影响后续对干细胞旁分泌因子的制备，且也不适用较大规模制备干细胞外泌体。聚合沉淀法是以聚乙二醇为主的化学提取制备干细胞外泌体的方法，该法使用的聚乙二醇就是根据体积排阻的聚合物会劫持水分子，使外泌体溶解度降低，从而可通过普通离心机的离心速度沉降干细胞外泌体。该法提取分离的干细胞外泌体粒径更小，分离时间短，蛋白含量也更高，但该法提取制备干细胞外泌体的量非常少、纯度也不高，且以此商品化的试剂盒处理干细胞培养液的成本非常高，提取制备干细胞外泌体也十分昂贵；此外，由于蛋白质聚合沉淀以及无法充分洗涤，因此以该法提取制备的外泌体可能还会存在较多杂蛋白干扰和影响，而且，该法获得的干细胞外泌体因为聚乙二醇的存在可能还会存在聚集成块，导致后续对干细胞外泌体的分析与鉴定受到影响。此外，在实际生物学和医学研究和应用中，有时候需要从体外干细胞培养液中提取、分离、纯化和浓缩干细胞外囊泡中的外泌体直径范围区的这部分亚细胞结构成分。中国实用新型专利ZL202020968303.3公开了一种“快速提取分离干细胞外泌体的仪器”，它是采用串联的四个第一平板式过滤膜池和第二平板式过滤膜池，最后需要提取的功效成分截留于第二平板式过滤膜池内的过滤膜片上，目前技术很难将该超滤膜片上的目的功效成分（外泌体）完全洗下来，即使能洗下来，冲洗试剂选择以及操作程序会较为繁琐，且也会有很多目的功效成分（外泌体）会残留于该超滤膜片上，而且外泌体为囊泡结构，在冲洗的过程中，外泌体很容易破溃，不仅损失大、收率低，而且外泌体的纯度和质量也很难达到要求；且通过该专利最终得到的外泌体功效成分的浓度不足，甚至难以控制和掌握终产物的使用剂量。虽然，有可能将单一的干细胞外泌体提取方法和其它方法联合应用提高获取干细胞外泌体的效率和纯度，如将超滤离心法和色谱法联用获得高纯度的外泌体，但操作更繁琐，设备要求更高，消耗时间更长，成本更大，且一般实验室几乎难以实现，即使可以实现，也几乎无法批量和规模化制备。

另外，干细胞不仅释放和分泌外泌体，也同时释放和分泌多种生长因子和细胞因子等干细胞分泌因子，而在前述中国实用新型专利（ZL202020968303.3）公开的一种“快速提取分离干细胞外泌体的仪器”中在最后膜片上截留获得了干细胞外泌体后，其作为终末端产物中的诸多种类干细胞分泌因子等生物活性成分被丢弃和浪费。

发明内容

本发明的目的针对背景技术中存在的缺点、不足和问题加以改进和创新，提供能同时快速制备干细胞外泌体和干细胞分泌因子两类凝胶的智能化制备***。

本发明的技术方案是构造一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，包括依次连接的气源、进料组件、粗过滤组件、外泌体凝胶制备组件、分泌因子凝胶制备组件，所述的进料组件包括料液瓶和串联设置在料液瓶上游的进气阀和压缩空气滤菌器，所述的进气阀连接气源；所述的粗过滤组件包括若干个串联的全流过滤膜池，前端连接料液瓶的底部；所述的外泌体凝胶制备组件包括第一中间收集瓶、第一蠕动泵、第一循环泵、第一循环过滤膜池和固体温敏凝胶恒温孵化器，所述分泌因子凝胶制备组件包括第二中间收集瓶、第二蠕动泵、第二循环泵、第二循环过滤膜池和半流体温敏凝胶恒温孵化器，所述的第一中间收集瓶、第一循环泵、第一循环过滤膜池形成浓缩回路，所述的第二中间收集瓶、第二循环泵、第二循环过滤膜池形成浓缩回路，所述固体温每凝胶恒温孵化器和半流体温敏凝胶恒温孵化器均包括水浴槽、设置在水浴槽内底部的海绵，固体温每凝胶恒温孵化器的海绵上部设置固体温敏凝胶孵化容器支架，半流体温敏凝胶恒温孵化器的海绵上部设置半流体温敏凝胶孵化容器支架，所述的第一蠕动泵和第二蠕动泵均设置有一个进液管和若干分装出液管，所述的进液管分别连接第一中间收集瓶和第二中间收集瓶，若干分装出液管分别连接设置在固体温敏凝胶孵化容器支架和半流体温敏凝胶孵化容器支架的分装容器，所述第一循环过滤膜池和第二循环过滤膜池均包括第一入口、第一出口和第二出口，其中第一入口与第一出口连通，该连通空间与第二出口之间设置有过滤膜，第一入口、第一出口为浓缩回路的组成部分，第一循环过滤膜池的第二出口连接第二中间收集瓶，第二循环过滤膜池的第二出口连接终末收集瓶；

所述若干全流过滤膜池的过滤精度从上游到下游依次减小，且最小的精度为0.1μm～0.2μm；所述第一循环过滤膜池的过滤精度为0.01μm～0.05μm；所述第二循环过滤膜池的过滤精度为1000～10000道尔顿；

所述第一中间收集瓶和第二中间收集瓶均设置有搅拌装置和温敏凝胶加注口。

在其中一个实施例中，所述的粗过滤组件中的全流过滤膜池数量为四个，过滤精度依次为5μm、1μm、0.45μm、0.15μm。

在其中一个实施例中，所述外泌体凝胶制备组件和分泌因子凝胶制备组件中的浓缩回路均设置有浓度调节阀，所术浓度调节阀分别设置在第一中间收集瓶与第一循环过滤膜池、第二中间收集瓶与第二循环过滤膜池之间，所述第一循环泵和第二循环泵分别连通第一中间收集瓶和第二中间收集瓶的底部，第一循环泵与第一循环过滤膜池、第二循环泵与第二循环过滤膜池之间均设置有进口阀。

在其中一个实施例中，所述的进气阀的前端还设置有调压阀，调压阀与进气阀均带压力表，调压阀的调压范围包括0.2~0.4MPa。

在其中一个实施例中，所述的第一循环过滤膜池的过滤精度为0.03μm，所述第二循环过滤膜池的过滤精度为1000道尔顿。

在其中一个实施例中，所述固体温敏凝胶孵化支架相应的分装容器为培养皿。

在其中一个实施例中，所述的半流体温敏凝胶孵化容器支架相应的分装容器为试管。

在其中一个实施例中，所述粗过滤组件中相邻的全流过滤膜池通过管线依次串联，每根管线上都旁接有排气阀。

在其中一个实施例中，所述的水浴槽为上部开口的恒温水浴仪器。

本发明的优点和有益效果

第一，本专利发明不仅能在这台仪器上同时快速制备干细胞来源或非干细胞来源的多种细胞分泌的外泌体和分泌因子，而且还可同时在这台仪器上一体化快速制备干细胞或非干细胞来源的多种细胞分泌的外泌体和分泌因子两类凝胶，并且，还可以根据实际应用需要同时制备干细胞或非干细胞来源的细胞分泌外泌体和分泌因子的固体凝胶或半流体凝胶。

第二，以分离10L干细胞上清培养液样本为例，本发明的这种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***同时制备外泌体和分泌因子两类凝胶的时间约3h左右，工艺更优、效率更高、时间更省，更加省力、节能、降耗、减排、环保等。而目前国际上公认的差速超速离心法仅处理10L干细胞上清培养液分离制备干细胞来源外泌体，即使采用美国贝克曼最大容量超速冷冻离心机则需要至少30h左右的时间。另外，美国贝克曼最大容量超速冷冻离心机每台价格至少超过50万元以上，而本发明仪器制造成本仅为它的1/10；而且，所有主机和零配件均为国产，不仅可节省大量外汇，而且维护保养更加简单、方便和快捷。

第三，采用美国贝克曼最大容量超速冷冻离心机的差速超速离心法在分别获得干细胞外泌体和干细胞分泌因子后，还需要再采用其它工艺技术和时间分别制备其凝胶，需要花费人力、物力、财力、时间更多。

第四，本发明基本是在封闭的情况下操作不易污染，这也是目前其它方法或仪器难以做到的。

第五，本专利发明所获干细胞来源的干细胞外泌体凝胶和干细胞分泌因子凝胶具有更好的缓释/控释效应，且对干细胞外泌体和干细胞分泌因子而言，其稳定性更高，保存期更长，应用更加科学合理、使用效果更好，安全性更佳，等等。

第六，相比美国贝克曼设备，本发明结构简单、成本低，且内部无离心机械结构，最终所获取的功效成分不易破溃，损伤很小，稳定可靠。而且，外部气源提供的压缩气体在进入本发明***内部前先经过压缩气体滤菌器过滤处理，保证***内的无菌环境，防止了污染。此外，本发明采用蠕动泵进行分装，可以采用定量方式运行，设置好转速和时间后，启动运行加入预设体积料液后即可自动停止，自动化程度较高。

附图说明

图1是本发明的整体结构示意图。

图2是固体温每凝胶恒温孵化器的使用状态示意图。

图3是图2的***图。

图4是图2中固体温敏凝胶孵化容器支架的结构示意图。

图5是半流体温敏凝胶恒温孵化器的使用状态示意图。

图6是图5中半流体温敏凝胶孵化容器支架的结构示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的首选实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被认为是“设置”在另一个元件上，它可以是直接设置或连接在另一个元件上或者可能同时存在居中元件。术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作。

除非另有定义，本文中所使用的所有的技术和科学术语与本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施目的，不是旨在限制本发明。

实施例1

请参阅图1至图6，一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，包括依次连接的气源c、进料组件1、粗过滤组件2、外泌体凝胶制备组件3、分泌因子凝胶制备组件4，所述的进料组件1包括料液瓶5和串联设置在料液瓶5上游的进气阀6和压缩空气滤菌器7，所述的进气阀6连接气源c；所述的粗过滤组件2包括四个串联的全流过滤膜池8，前端连接料液瓶5的底部；所述的外泌体凝胶制备组件3包括第一中间收集瓶9、第一蠕动泵10、第一循环泵11、第一循环过滤膜池12和固体温敏凝胶恒温孵化器13，所述分泌因子凝胶制备组件4包括第二中间收集瓶14、第二蠕动泵15、第二循环泵16、第二循环过滤膜池17和半流体温敏凝胶恒温孵化器18，所述的第一中间收集瓶9、第一循环泵11、第一循环过滤膜池12形成浓缩回路，所述的第二中间收集瓶14、第二循环泵16、第二循环过滤膜池17形成浓缩回路，所述固体温每凝胶恒温孵化器13和半流体温敏凝胶恒温孵化器18均包括水浴槽19、设置在水浴槽19内底部的海绵20，固体温每凝胶恒温孵化器13的海绵20上部设置固体温敏凝胶孵化容器支架21，半流体温敏凝胶恒温孵化器18的海绵20上部设置半流体温敏凝胶孵化容器支架22，所述的第一蠕动泵10和第二蠕动泵15均设置有一个进液管和若干分装出液管，所述的进液管分别连接第一中间收集瓶9和第二中间收集瓶14，若干分装出液管分别连接设置在固体温敏凝胶孵化容器支架21和半流体温敏凝胶孵化容器支架18的分装容器，在本实施例中，所述的分装容器分别为培养皿a和试管b，所述第一循环过滤膜池12和第二循环过滤膜池17均包括第一入口23、第一出口24和第二出口25，其中第一入口23与第一出口24连通，该连通空间与第二出口25之间设置有过滤膜，第一入口23、第一出口24为浓缩回路的组成部分，第一循环过滤膜池12的第二出口25连接第二中间收集瓶14，第二循环过滤膜池17的第二出口25连接终末收集瓶26；

本实施例中，所述的四个全流过滤膜池8的过滤精度从上游到下游依次减小，其精度依次为5μm、1μm、0.45μm、0.15μm；所述第一循环过滤膜池12的过滤精度为0.03μm；所述第二循环过滤膜池17的过滤精度为1000道尔顿；

所述第一中间收集瓶9和第二中间收集瓶14均设置有搅拌装置27和温敏凝胶加注口33。

所述外泌体凝胶制备组件3和分泌因子凝胶制备组件4中的浓缩回路均设置有浓度调节阀28，所术浓度调节阀28分别设置在第一中间收集瓶9与第一循环过滤膜池12、第二中间收集瓶14与第二循环过滤膜池17之间，所述第一循环泵11和第二循环泵16分别连通第一中间收集瓶9和第二中间收集瓶14的底部，第一循环泵11与第一循环过滤膜池12、第二循环泵16与第二循环过滤膜池17之间均设置有进口阀29。这种结构可以实现浓度可调。

更优地，所述的进气阀6的前端还设置有调压阀30，调压阀30与进气阀6均带压力表，调压阀30的调压范围包括0.2~0.4MPa。

进一步地，所述粗过滤组件2中相邻的全流过滤膜池8通过管线依次串联，每根管线上都旁接有排气阀32。

本实施例中所述的水浴槽19为上部开口的恒温水浴仪器，可以使用现有恒温水浴仪器。本发明中使用的全流过滤膜池8第一循环过滤膜池12、第二循环过滤膜池17均为现有设备。

利用实施例制备外泌体和分泌因子凝胶的过程包括以下几个阶段：

第一阶段：组装设备并将待处理料液（包含外泌体、分泌因子的干细胞培养液的上清液）装入料液瓶5后，由气源c提供压缩气体（优选氮气，由进气阀与调压阀操作控制压力范围为0.2~0.4MPa），压缩气体经过压缩空气滤菌器去除气体中的细菌，将料液压入并通过粗过滤组件2中的四个全流过滤膜池（过滤精度从上游到下游依次为5μm、1μm、0.45μm、0.15μm），去除杂细胞、细胞碎片等非外泌体成分，还保留了尺寸更小的分泌因子，经过滤后的料液进入第一中间收集瓶9，第一中间收集瓶9收集到足够量的物料后关闭气源。

第二阶段：启动第一循环泵11，使第一中间收集瓶9中的料液在外泌体凝胶制备组件3中的循环回路中循环流动，其中分子量或体积较小的组分（含分泌因子等）通过第一循环过滤膜池12（过滤精度为0.01μm～0.05μm的超滤膜池，优选0.03μm）的过滤作用，从第一循环过滤膜池12的第二出口25流入第二中间收集瓶14，分子量或体积较小的组分流回第一中间收集瓶9，在不断地循环过程中，第一中间收集瓶9内的料液中所需组分（即外泌体）进行了浓缩，当组分达到所需浓度后，关闭第一循环泵11。

第三阶段：启动第二循环泵16，使第二中间收集瓶14中的料液（含分泌因子等）在外泌体凝胶制备组件3中的循环回路中循环流动，其中分子量或体积较小的组分通过第二循环过滤膜池17（过滤精度为1000～10000道尔顿的超滤膜池，优选1000道尔顿）的过滤作用，从第一循环过滤膜池12的第二出口25排出（本实施例中用终末收集瓶26收集，也可以丢弃和作其他处理），分泌因子流回第二中间收集瓶14，在不断地循环过程中，第二中间收集瓶14内的料液中所需组分(分泌因子等)进行了浓缩，当组分达到所需浓度后，关闭第二循环泵16。

可以分别在第二阶段通过温敏凝胶加注口33向收集了高浓度外泌体的第一中间收集瓶9加注温敏凝胶并搅拌、第三阶段通过温敏凝胶加注口33向收集了高浓度生长因子的第二中间收集瓶14加注温敏凝胶并搅拌；也可以在第三阶段向第一中间收集瓶9和第二中间收集瓶14加注温敏凝胶并搅拌。

第四阶段：启动第一蠕动泵10和第二蠕动泵15（实施例中均为六通道蠕动泵），分别将第一中间收集瓶9和第二中间收集瓶14内的物料抽取分装到各自的分装容器（培养皿a和试管b），并放入相应的水浴槽进行恒温水浴处理，分别孵化形成干细胞外泌体凝胶和分泌因子凝胶。

当然，分装容器并不需要特定为本发明实施例中的培养皿和试管。

参数不同的温敏凝胶在不同温度下程现不同的状态，存在由液体转变为半流体、由半流体转变为胶状的临界温度。显然，本发明在水浴过程之前应当保证料液为液体状态。水浴槽可以提供温敏凝胶固化所需的温度环境。水浴槽内底部设置海绵是在保证温度的同时，防止分装容器取放时溅起水花，污染结果。

水凝胶是一种稳定的亲水性网格状三维结构，负载的干细胞外泌体和干细胞分泌因子均可分布在网格之中，具有良好的生物相容性、可降解性和保水性等，而且水凝胶的网格结构可调控干细胞外泌体和分泌因子的释放速率，也可有效缓解或延长它们的降解速率，这样既可避免单纯使用干细胞外泌体或分泌因子后被机体快速清除或降解，也可延长其功效作用的稳定性、持久性及半衰期、还可同时发挥凝胶制剂的载体功能及缓释/控释效应以及细胞支架功能，特别是，采用凝胶负载干细胞分泌的外泌体和分泌因子联合应用，可最大限度发挥干细胞外泌体和分泌因子与凝胶的共济协同和联合增效作用，凝胶所负载的干细胞或生物活性分子的结构和功能可保持更长时间，产生和发挥更好的生物学作用和临床效果，具有更重要的应用价值。

本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (9)

1.一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：包括依次连接的气源、进料组件、粗过滤组件、外泌体凝胶制备组件、分泌因子凝胶制备组件，所述的进料组件包括料液瓶和串联设置在料液瓶上游的进气阀和压缩空气滤菌器，所述的进气阀连接气源；所述的粗过滤组件包括若干个串联的全流过滤膜池，前端连接料液瓶；所述的外泌体凝胶制备组件包括第一中间收集瓶、第一蠕动泵、第一循环泵、第一循环过滤膜池和固体温敏凝胶恒温孵化器，所述分泌因子凝胶制备组件包括第二中间收集瓶、第二蠕动泵、第二循环泵、第二循环过滤膜池和半流体温敏凝胶恒温孵化器，所述的第一中间收集瓶、第一循环泵、第一循环过滤膜池形成浓缩回路，所述的第二中间收集瓶、第二循环泵、第二循环过滤膜池形成浓缩回路，所述固体温每凝胶恒温孵化器和半流体温敏凝胶恒温孵化器均包括水浴槽、设置在水浴槽内底部的海绵，固体温每凝胶恒温孵化器的海绵上部设置固体温敏凝胶孵化容器支架，半流体温敏凝胶恒温孵化器的海绵上部设置半流体温敏凝胶孵化容器支架，所述的第一蠕动泵和第二蠕动泵均设置有一个进液管和若干分装出液管，所述的进液管分别连接第一中间收集瓶和第二中间收集瓶，若干分装出液管分别连接设置在固体温敏凝胶孵化容器支架和半流体温敏凝胶孵化容器支架的分装容器，所述第一循环过滤膜池和第二循环过滤膜池均包括第一入口、第一出口和第二出口，其中第一入口与第一出口连通，该连通空间与第二出口之间设置有过滤膜，第一入口、第一出口为浓缩回路的组成部分，第一循环过滤膜池的第二出口连接第二中间收集瓶，第二循环过滤膜池的第二出口连接终末收集瓶；

若干个所述的全流过滤膜池的过滤精度从上游到下游依次减小，且最小的精度为0.1μm～0.2μm；所述第一循环过滤膜池的过滤精度为0.01μm～0.05μm；所述第二循环过滤膜池的过滤精度为1000～10000道尔顿；

所述第一中间收集瓶和第二中间收集瓶均设置有搅拌装置和温敏凝胶加注口。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述的粗过滤组件中的全流过滤膜池数量为四个，过滤精度依次为5μm、1μm、0.45μm、0.15μm。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述外泌体凝胶制备组件和分泌因子凝胶制备组件中的浓缩回路均设置有浓度调节阀，所术浓度调节阀分别设置在第一中间收集瓶与第一循环过滤膜池、第二中间收集瓶与第二循环过滤膜池之间，所述第一循环泵和第二循环泵分别连通第一中间收集瓶和第二中间收集瓶的底部，第一循环泵与第一循环过滤膜池、第二循环泵与第二循环过滤膜池之间均设置有进口阀。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述的进气阀的前端还设置有调压阀，调压阀与进气阀均带压力表，调压阀的调压范围包括0.2~0.4MPa。

5.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述的第一循环过滤膜池的过滤精度为0.03μm，所述第二循环过滤膜池的过滤精度为1000道尔顿。

6.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述固体温敏凝胶孵化支架相应的分装容器为培养皿。

7.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述的半流体温敏凝胶孵化容器支架相应的分装容器为试管。

8.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述粗过滤组件中相邻的全流过滤膜池通过管线依次串联，每根管线上都旁接有排气阀。

9.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体和分泌因子凝胶的一体化智能制备***，其特征在于：所述的水浴槽为上部开口的恒温水浴仪器。

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