CN115746086A - 一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺 - Google Patents
一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115746086A CN115746086A CN202211492258.9A CN202211492258A CN115746086A CN 115746086 A CN115746086 A CN 115746086A CN 202211492258 A CN202211492258 A CN 202211492258A CN 115746086 A CN115746086 A CN 115746086A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- filtration
- solid
- membrane package
- clarification
- flow rate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺，属于细胞培养和蛋白纯化领域。本发明提供了一种处理高固含量细胞液的澄清收获方法，可以针对固含量15％及以上的细胞培养液进行澄清收获。本发明可以在不提高生产成本的情况下，有效提高深层过滤膜包载量，进一步提高细胞液的收获以及膜包过滤收率。本发明所提供的方法所涉及的材料简单，易于推广，具有重大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺，属于细胞培养和蛋白纯化领域。
背景技术
对于蛋白类生物药来说，主要分为上游细胞培养和下游蛋白纯化两部分。细胞培养一般可分为分批培养(Batch)、分批补料培养(Fed-batch)和灌流培养(Perfusion)等模式。其中，浓缩补料培养(Concentrated Fed-Batch,CFB)是基于中空纤维切向流过滤的细胞截留装置(Alternating Tangential Flow Cellular Intercept System，ATF)，使用有限的反应器容量，极大的增强了细胞培养滴度和目标蛋白的产量，使其蛋白产出可以匹敌一个较大的设施，不但显著提高生产效率，还节约制造成本，具有广泛的发展和运用前景。
在ATF控制***的作用下，通过隔膜泵交替式的“抽气”和“充气”，不断地将部分培养液排出，又能将细胞和目标蛋白“反冲”回细胞培养袋。与此同时，连续不断地灌注新的培养基，就可以使细胞处于良好的生长环境中，使得细胞密度和蛋白浓度不断增加。当目标蛋白在反应器内逐渐积累到较高浓度，即可在培养结束后一次性收获。浓缩补料培养(CFB)工艺在不增加细胞培养时长和更多细胞培养相关的设备的情况下，大大提高了细胞密度和产品收率。该工艺优势显著，有望在国内市场得到广泛的运用。但由于该工艺细胞密度很高，收获时固含量也非常高，高达40％，给澄清收获步骤带来极大的挑战，而传统的分批补料培养(Fed-batch)工艺的固含量通常低于15％，现有的澄清收获工艺不太适用于固含量高于15％的细胞液的澄清收获。
细胞培养完成后所获得的发酵液除了目标产物外，还有细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、DNA以及培养基成分等。这些杂质会影响产品的纯度和稳定性。收获工艺的澄清效果对于后续的抗体分离纯化及收率有重要影响。业界常用的细胞培养液澄清收获方法有深层过滤、离心、絮凝沉淀等。其中深层过滤是业界最常用的方法，但是该方法在处理高固含量细胞液时易堵塞、载量低、收率低、所需膜包数量大、成本高，且难以进行工艺放大，无法满足CFB类型项目的收获需求。因此开发能够高效处理高固含量细胞液的澄清收获工艺很有必要，且具有重大市场价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种处理高固含量细胞液的澄清收获方法，可以针对固含量15％及以上的细胞培养液进行澄清收获。
本发明的第一个目的是提供一种处理高固含量细胞液的澄清收获方法，所述方法具体步骤如下：
(1)在固含量15％及以上的细胞培养液中加入絮凝剂，混合孵育；
(2)将步骤(1)中孵育结束的细胞培养液进行固液分离，并收集上清液；
(3)利用过滤膜包对步骤(2)中的上清液进行深层过滤；
(4)使用缓冲液冲洗步骤(3)中的过滤膜包，并回收缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，以质量比1～2％的添加量加入5～20％絮凝剂。
在本发明的一种实施方式中，所述絮凝剂包括强阳离子聚电解质。
在本发明的一种实施方式中，所述强阳离子聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵或丁基溴聚乙烯。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，利用离心实现固液分离。
在本发明的一种实施方式中，所述离心的条件为1500～3500g，3～15min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述深层过滤的通量为20～100LMH，细胞液澄清过滤终点压力差为3-30psi。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，所述过滤膜包按照蠕动泵、D0HC膜包和A1HC膜包的顺序串联。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤膜包进行过滤之前，先依次进行漂洗和平衡；
所述漂洗的步骤为，采用注射用水对过滤膜包进行预冲洗和湿润，目标流速为100-600LMH，目标载量100–150L/m2；
所述平衡的步骤为：采用缓冲液对过滤膜包进行平衡，目标流速为≤600LMH，目标载量为60-80L/m2。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，目标流速为20-100LMH。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液含有50mM Tris-HAc，150mM Nacl，pH7.4。
本发明还提供上述方法在蛋白纯化领域中的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供的方法可以针对固含量15％及以上的细胞培养液进行澄清收获，在不提高生产成本的情况下，有效提高深层过滤膜包载量，进一步提高细胞液的收获以及膜包过滤收率。
附图说明
图1细胞液澄清效果对比图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1传统两级深层过滤的收获工艺表现
(一)膜包的安装：使用硅胶管按照过滤顺序串联蠕动泵、D0HC(购自Merck公司，货号：MD0HC23CL3，面积为23cm2)膜包和A1HC(购自Merck公司，货号：MA1HC23CL3,面积为23cm2)膜包，由蠕动泵泵入样品，从A1HC膜包流出。
(二)漂洗：采用细胞培养用超纯水(由购自Millipore公司的纯水仪制备)对膜包进行预冲洗和湿润，漂洗目标流速为100-600LMH，目标载量100–150L/m2。实际漂洗流速是600LMH。D0HC的实际漂洗体积为285.54mL，A1HC的实际漂洗体积为295.95mL。
(三)平衡：使用50mM Tris-HAc，150mM Nacl，pH 7.4的平衡缓冲液进行膜包的平衡，平衡目标流速为≤600LMH，目标载量为60L/m2。实际平衡流速为500LMH，实际平衡体积为145.41mL。
(四)过滤：用蠕动泵将固含量为40％，细胞密度为60*106cells/mL的CHO细胞培养液(浊度为21960NTU)输送至深层过滤膜包中进行过滤。过滤进口目标流速为20-100LMH，实际进口流速为44.9LMH，过滤终点压差为27.4psi，实际过滤体积为47.72mL。
(五)淋洗：使用平衡缓冲液对过滤膜包进行冲洗并回收缓冲液，淋洗目标流速为20-100LMH，实际流速为44.9LMH，淋洗体积为10.75mL，总收获液体积为37.16mL。检测最终产品蛋白含量，浊度等(表1)。
实施例2絮凝与深层过滤结合的收获工艺表现
(一)絮凝：在固含量为40％，细胞密度为60*106cells/mL的CHO细胞培养液(浊度为21960NTU)中以1.5％(m/m)的添加量加入10％絮凝剂(购自Merck公司，货号：1.37069)，用搅拌子进行搅拌，室温孵育1h。
(二)膜包的安装：使用硅胶管按照过滤顺序串联蠕动泵、D0HC膜包和A1HC膜包，由蠕动泵泵入样品，从A1HC膜包流出。
(三)漂洗：采用超纯水对膜包进行预冲洗和湿润，漂洗目标流速为100-600LMH，目标载量100–150L/m2。实际漂洗流速是600LMH。D0HC的实际漂洗体积为233.39mL，A1HC的实际漂洗体积为241.50mL。
(四)平衡：使用50mM Tris-HAc，150mM Nacl，pH7.4的平衡缓冲液进行膜包的平衡。平衡目标流速为≤600LMH，目标载量为60L/m2。平衡实际流速为500LMH，实际平衡体积为147.86mL。
(五)过滤：用蠕动泵将步骤(1)中絮凝后的细胞培养液(浊度为38080NTU)输送至深层过滤膜包中进行过滤。过滤进口目标流速为20-100LMH，实际进口流速为44.9LMH，过滤终点压差为18.2psi，实际过滤体积为33.66mL。
(六)淋洗：使用平衡缓冲液对过滤膜包进行冲洗并回收缓冲液，淋洗目标流速为20-100LMH。实际流速为44.9LMH，实际淋洗体积为69.31mL，总收获液体积为87.75mL。检测最终产品蛋白含量，浊度等(表1)。
实施例3絮凝、离心与深层过滤组合的收获工艺表现
(一)絮凝：在固含量为40％，细胞密度为60*106cells/mL的CHO细胞培养液(浊度为21960NTU)中以1.5％(m/m)的添加量加入10％絮凝剂，用搅拌子进行搅拌，室温孵育1h。
(二)离心：取步骤(1)中孵育结束的细胞培养液在室温下进行离心，离心条件为2800g*10min。离心结束后收集上清执行过滤操作。
(二)膜包的安装：使用硅胶管按照过滤顺序串联蠕动泵和A1HC膜包，由蠕动泵泵入样品，从A1HC膜包流出。
(三)漂洗：采用超纯水对膜包进行预冲洗和湿润，漂洗目标流速为100-600LMH，目标载量100–150L/m2。实际漂洗流速为600LMH，A1HC的实际漂洗体积为234.75mL。
(四)平衡：使用50mM Tris-HAc，150mM Nacl，pH7.4的平衡缓冲液进行膜包的平衡。平衡目标流速为≤600LMH，目标载量为60-80L/m2。实际平衡流速为500LMH，实际平衡体积为140.07mL。
(五)过滤：用蠕动泵将步骤(2)中的上清(浊度为289NTU)输送至深层过滤膜包中进行过滤，过滤进口目标流速为20-100LMH，实际进口流速为44.9LMH，过滤终点压差为4.1psi，实际过滤体积为227.98mL。
(六)淋洗：使用平衡缓冲液对过滤膜包进行冲洗并回收缓冲液，淋洗目标流速为20-100LMH。实际淋洗速度为44.9LMH，实际淋洗体积为69.24mL，总收获液体积为289.96mL。检测最终产品蛋白含量，浊度等(表1)。
表1.澄清收获实验结果
*载量的计算：实际过滤体积/膜包面积＝膜包载量
*膜包过滤收率的计算：(收获液蛋白浓度*收获液体积)/(上样蛋白浓度*上样体积)*100％＝膜包收率
从图1可以看出，利用实施例1-3不同的方法对浑浊的细胞液澄清后，都可以达到十分澄清的状态。但与实施例1传统的直接过滤的澄清收获方法相比，采用实施例2的方法的蛋白收率更高，可见絮凝剂的添加可以显著增加高固含量细胞液澄清收获的收率。
与实施例2的方法相比，实施例3的方法通过引入离心以后可获得更高载量和收率。即在处理高固含量的细胞液时，先进行絮凝剂孵育，然后离心，最后再用一级膜包进行过滤，可高效完成高固含量细胞液的澄清收获。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种处理高固含量细胞液的澄清收获方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
(1)在固含量15％及以上的细胞培养液中加入絮凝剂，混合孵育；
(2)将步骤(1)中孵育结束的细胞培养液进行固液分离，并收集上清液；
(3)利用过滤膜包对步骤(2)中的上清液进行深层过滤；
(4)使用缓冲液冲洗步骤(3)中的过滤膜包，并回收缓冲液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，以质量比1～2％的添加量加入5～20％絮凝剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂包括强阳离子聚电解质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述强阳离子聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵或丁基溴聚乙烯。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，利用离心实现固液分离。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述深层过滤的通量为20～100LMH，细胞液澄清过滤终点压力差为3-30psi。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述过滤膜包按照蠕动泵、D0HC膜包和A1HC膜包的顺序串联；
所述过滤膜包进行过滤之前，先依次进行漂洗和平衡；
所述漂洗的步骤为，采用注射用水对过滤膜包进行预冲洗和湿润，目标流速为100-600LMH，目标载量100–150L/m2；
所述平衡的步骤为：采用缓冲液对过滤膜包进行平衡，目标流速为≤600LMH，目标载量为60-80L/m2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，目标流速为20-100LMH。
9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述缓冲液含有50mM Tris-HAc，150mMNacl，pH7.4。
10.权利要求1～9任一所述方法在蛋白纯化领域中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211492258.9A CN115746086A (zh) | 2022-11-25 | 2022-11-25 | 一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211492258.9A CN115746086A (zh) | 2022-11-25 | 2022-11-25 | 一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115746086A true CN115746086A (zh) | 2023-03-07 |
Family
ID=85338168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211492258.9A Pending CN115746086A (zh) | 2022-11-25 | 2022-11-25 | 一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115746086A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116199735A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-06-02 | 无锡药明生物技术股份有限公司 | 一种高效处理高固含量细胞液的澄清收获方法 |
-
2022
- 2022-11-25 CN CN202211492258.9A patent/CN115746086A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116199735A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-06-02 | 无锡药明生物技术股份有限公司 | 一种高效处理高固含量细胞液的澄清收获方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109689191B (zh) | 交替切向流快速收获 | |
| US8668886B2 (en) | Separative bioreactor | |
| CA2861270C (en) | Perfusion bioreactor systems comprising a cell aggregate trap and methods of operating the same | |
| CN115746086A (zh) | 一种处理高固含量细胞液的澄清收获工艺 | |
| CN110241012B (zh) | 一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法、生产模块及在生产中的应用 | |
| Kendall et al. | Purification of plasmid DNA by an integrated operation comprising tangential flow filtration and nitrocellulose adsorption | |
| US20230151056A1 (en) | Exosome purification method and integrated device thereof | |
| CN103772086B (zh) | 一种海洋微生物小分子代谢产物馏分制备的前处理工艺 | |
| CN102603814B (zh) | 一种提高木糖母液中木糖结晶效率的方法 | |
| CN218058999U (zh) | 用于重组大肠杆菌表达***的蛋白发酵液预处理装置 | |
| CN101633900A (zh) | 产大环糊精4-α-糖基转移酶的制备方法 | |
| CN115475525B (zh) | 一种双级超滤提纯生物抑尘剂的方法 | |
| CN113480632B (zh) | 一种在CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG纯化工艺 | |
| CN109852591A (zh) | 一种大豆乳清废水逆pH梯度提取脂肪氧合酶的方法 | |
| CN111318077A (zh) | 一种复用对流色谱***及其用于纯化蛋白的方法 | |
| CN114874884A (zh) | 一种细胞外囊泡连续分离纯化装置及应用方法 | |
| CN116199735A (zh) | 一种高效处理高固含量细胞液的澄清收获方法 | |
| CN111218494B (zh) | 一种处理cho细胞发酵液的方法 | |
| CN103555682B (zh) | 葡萄糖氧化酶的分离纯化方法 | |
| Su et al. | Crossflow membrane filtration | |
| CN1528909A (zh) | 乳酸菌固定化细胞原位分离发酵生产乳酸工艺 | |
| CN115779683B (zh) | 除病毒过滤方法 | |
| CN109371050B (zh) | 一种犬干扰素的制备方法 | |
| CN216663072U (zh) | 一种外泌体纯化装置 | |
| Zhang et al. | Factors affecting membrane fouling in filtration of Saccharomyces cerevisiae in an internal ceramic filter bioreactor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |