CN111318077A - 一种复用对流色谱***及其用于纯化蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复用对流色谱***及其用于纯化蛋白的方法,属于蛋白纯化技术领域。该复用对流色谱***包括进料储液罐,蠕动泵I,切向流过滤装置,循环液储液罐,蠕动泵II,蠕动泵III,废弃滤液储液罐,蠕动泵IV,蠕动泵V,大孔连续色谱装置和中央处理器。本发明还提供了一种利用复用对流色谱***纯化蛋白的方法。该***集细胞上清液的浓缩、缓冲液置换、纯化以及最后产品的配方于一体,实现了由细胞液回收到最后产品纯化的一步操作。该***还可以进一步集成紫外光探测、pH、电导仪等实现对整个纯化过程的实时监测,最终建立高效、简便、经济的实验室、中试规模抗体生产平台,在各种蛋白纯化中试平台具有很大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种复用对流色谱***及其用于纯化蛋白的方法,属于蛋白纯化技术领域。
背景技术
切向流过滤(tangential flow filtration,简称TFF)是一种新型的浓缩过滤技术,是指液体流动方向与过滤方向相垂直的过滤形式。相比于传统的死端过滤(dead end),切向流过滤***中液体流动在过滤介质表面产生剪切力,减小了滤饼层或凝胶层的堆积,保证了稳定的过滤速度,可有效提高处理效率。该分离方法基于尺寸、分子量或其他差异使用膜来分离液体溶液或悬浮液中的组分。切向流过滤技术具有使用简单,快速、高效,规模可放大或缩小,同步进行浓缩和洗滤,经济省时等优点。切向流过滤技术可以集合封闭式循环流路,获得高效、无菌和快速的工艺,因此切向流过滤技术常用于生物活性物质的分离,生物制品、血制品及疫苗的生产。
亲和层析是一种常见的蛋白纯化技术,利用可与生物活性物质(如抗体)特异性结合的介质作为固定相,使液相中相应的生物活性物质选择性结合在固定相上,借以与液相中的其他杂质分开,达到分离提纯的目的。大孔连续色谱(affinity monolithchromatography,简称AMC)是一种新型的亲和层析技术,其固定相由一个单独的连续的多孔材料构成。常见的固定相材料包括琼脂糖(agarose)、二氧化硅(silica)、甲基丙烯酸缩水甘油酯/乙二醇二甲基丙烯酸酯(glycidyl methacrylate/ethylene dimethacrylate)以及Cryogels等。大孔连续色谱具有很多优点,例如可以制作成多种形式填充在柱子、毛细管以及微流体装置中;回压低,液相可以高速流过,达到快速分离和分析的目的;固定相可以根据需要进行修饰改性。
单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。单克隆抗体具有特异性高、均一性高的优点,已迅速应用于诸多领域,包括检验医学诊断试剂、放射免疫显像技术、蛋白质提纯以及肿瘤靶向、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等疾病治疗。现在常用的单克隆抗体纯化***为AKTA蛋白纯化***,该***具有自动化程度高的优点,可以实现自动上样、纯化、样品收集、样品分析于一体。但是该***的弊端是每次纯化时只能连接一种色谱柱,比如Protein A色谱柱、阴/阳离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱等。当单克隆抗体细胞发酵液成分复杂时,需要使用3-4种色谱柱进行纯化,利用AKTA蛋白纯化***纯化单克隆抗体则需要每一种色谱柱使用结束后,重新换上另一种色谱柱,而且每次使用新的色谱柱都需要先调整样品条件,如电导率、pH等。因此,现行的单克隆抗体制备技术复杂,费时费工,导致单克隆抗体的价格也比较高。
发明内容
为解决AKTA蛋白纯化***每次纯化时只能连接一种色谱柱,纯化成分复杂的蛋白时需要每一种色谱柱使用结束后,重新换上另一种色谱柱,还要重新调整样品条件导致该方法工序复杂费时费力的问题,本发明提供了一种复用对流色谱***(multiplexedconvective chromatography,简称MCC)及其用于蛋白纯化的方法,该***整合了下游的蛋白纯化步骤,实现了由细胞液回收到最后产品纯化的一步操作,可应用于实验室以及中试规模的抗体生产平台。采用的技术方案如下:
本发明的目的在于提供一种复用对流色谱***,该复用对流色谱***包括进料储液罐1,蠕动泵I2,切向流过滤装置3,循环液储液罐4,蠕动泵II5,蠕动泵III6,废弃滤液储液罐7,蠕动泵IV8,大孔连续色谱装置9,蠕动泵V13和中央处理器;其中:所述进料储液罐1通过蠕动泵I2与切向流过滤装置3的进料口相连;所述切向流过滤装置3设有两个出料口,分别为回收滤液出料口和废弃滤液出料口;所述废弃滤液出料口通过蠕动泵III6与废弃滤液储液罐7相连;所述回收滤液出料口分成两个支路,一个支路通过蠕动泵V13与循环液储液罐4的进料口相连,另一个支路通过蠕动泵IV8与大孔连续色谱装置9的总进料口相连;所述循环液储液罐4的出料口通过蠕动泵II5与切向流过滤装置3的进料口相连;所述大孔连续色谱装置9的总出料口与循环液储液罐4的进料口相连;所述中央处理器控制蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6、蠕动泵IV8和蠕动泵V13的启动和停止。
优选地,所述复用对流色谱***为单通道复用对流色谱***,其中大孔连续色谱装置9包括一个大孔连续色谱柱。
更优选地,所述大孔连续色谱柱选自疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱和复合色谱层析柱中的任意一种。
优选地,所述复用对流色谱***为多通道复用对流色谱***,其中大孔连续色谱装置9包括多个并联连接的大孔连续色谱柱。
更优选地,所述多个并联连接的大孔连续色谱柱选自疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱和复合色谱层析柱中的任意一种并联连接或任意多种并联连接。
优选地,所述进料储液罐1用于储存待纯化处理的粗蛋白溶液、缓冲液和蛋白的存储液。
优选地,在蠕动泵I2与切向流过滤装置3进料口之间的管路上设有压力传感器10,和/或在蠕动泵II5与切向流过滤装置3进料口之间的管路上设有压力传感器10,和/或在蠕动泵IV8与大孔连续色谱装置9的总进料口之间设有压力传感器10,和/或在切向流过滤装置3的废弃滤液出料口和蠕动泵III6之间设有压力传感器10,所有压力传感器10与中央处理器数据相连,将采集的压力信号传送至中央处理器。
优选地,在蠕动泵I2与进料储液罐1之间设有pH和电导率传感器12,和/或在蠕动泵II5与循环液储液罐4的出料口之间设有pH和电导率传感器12;所述pH和电导率传感器12与中央处理器数据连接,pH和电导率传感器12将其所采集的信号传送至中央处理器。
优选地,所述复用对流色谱***还包括称重装置11,所述称重装置11与循环液储液罐4连接,用于称量循环液储液罐4和/或其所存储的溶液的重量。
更优选地,所述称重装置11为电子秤。
更优选地,所述称重装置11为重量传感器,所述重量传感器采集循环液储液罐4与其所存储的溶液的重量信息,将其所采集的重量信号传送至中央处理器。
本发明还提供了一种利用上述复用对流色谱***纯化蛋白的方法,该方法包括如下步骤:
1)将待纯化处理的粗蛋白溶液输送至切向流过滤装置3中进行过滤,废弃滤液由蠕动泵III6输送至废弃滤液储液罐7中,回收滤液流动至循环液储液罐4中,循环液储液罐4中回收滤液经称重后由蠕动泵II5输送回切向流过滤装置3中,重复上述过滤过程至达到既定浓缩程度,完成第一阶段的浓缩;
2)将进料储液罐1中的溶液替换为缓冲液,由蠕动泵I2将进料储液罐1中的缓冲液输送至切向流过滤装置3中进行缓冲液置换,在置换过程中将经过置换后的废弃液由蠕动泵III6输送至废弃滤液储液罐7中,置换后的回收液输送至循环液储液罐4中,经称重后由蠕动泵II5输送回切向流过滤装置3中,重复上述置换过程完成缓冲液置换至既定的pH及电导率;
3)将切向流过滤装置3和循环液储液罐4中的溶液输送至大孔连续色谱装置9进行除杂;
4)将进料储液罐1中的溶液替换为蛋白的存储液,将经过大孔连续色谱装置9除杂后的溶液重新输送至切向流过滤装置3中进行重复循环以完成二次浓缩和蛋白的存储液的置换;
5)完成二次浓缩后,收集溶液即得纯化后的蛋白溶液。
更优选地,所述方法包括如下步骤:
1)将待纯化处理的粗蛋白溶液储存于进料储液罐1中,通过中央处理器启动蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6和蠕动泵V13,关闭蠕动泵IV8,将进料储液罐1中的待纯化处理的粗蛋白溶液输送至切向流过滤装置3中进行过滤,在过滤过程中将废弃滤液由蠕动泵III6输送至废弃滤液储液罐7中,回收滤液输送至循环液储液罐4中,经称重后由蠕动泵II5输送回切向流过滤装置3中,重复上述过滤过程至达到既定浓缩程度,完成第一阶段的浓缩;
2)将进料储液罐1中的溶液替换为缓冲液,由蠕动泵I2将进料储液罐1中的缓冲液输送至切向流过滤装置3中进行缓冲液置换,在置换过程中将经过置换后的废弃液由蠕动泵III6输送至废弃滤液储液罐7中,置换后的回收液输送至循环液储液罐4中,经称重后由蠕动泵II5输送回切向流过滤装置3中,重复上述置换过程完成缓冲液置换至既定的pH及电导率;
3)通过中央处理器启动蠕动泵II5和蠕动泵IV8,关闭蠕动泵V13,使得切向流过滤装置3和循环液储液罐4中的溶液进入大孔连续色谱装置9进行除杂,经过大孔连续色谱装置9除杂后的溶液进入循环液储液罐4中存储;
4)通过中央处理器启动蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6和蠕动泵V13,关闭蠕动泵IV8,将进料储液罐1中的溶液替换为蛋白的存储液,将循环液储液罐4中存储的经过大孔连续色谱装置9除杂后的溶液输送至切向流过滤装置3中进行重复循环处理以完成二次浓缩和蛋白的存储液的置换,最终处理的液体由循环液储液罐4储存;
5)通过中央处理器关闭蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6、蠕动泵V13和蠕动泵IV8,收集循环液储液罐4中的溶液,即得纯化后的蛋白溶液。
优选地,所述待纯化处理的粗蛋白溶液为单克隆抗体细胞发酵液。更优选地,步骤5)所述二次浓缩至浓缩液的浓度为1~5mg/mL。
本发明复用对流色谱***包括切向流过滤***(TFF)和大孔连续色谱(AMC),根据单克隆抗体细胞发酵液成分的复杂程度,可以开发单通道复用对流色谱***和多通道复用对流色谱***,单克隆抗体细胞发酵液成分简单的情况,使用单通道复用对流色谱***可实现由细胞液回收到最后产品纯化的一步操作;单克隆抗体细胞发酵液成分复杂的情况,使用多通道复用对流色谱***可实现由细胞液回收到最后产品纯化的一步操作。
单通道复用对流色谱***可以由一个切向流过滤装置、一个大孔连续色谱柱、五个蠕动泵、三个压力传感器、两个pH/电导率传感器、一个循环液储液罐器、一个进料储液罐、一个废弃滤液储液罐组成形成循环流路。外连一台称重装置和一台中央处理器控制循环液流动及蠕动泵开和关。
多通道复用对流色谱***可以由一个切向流过滤装置、多个大孔连续色谱柱、五个蠕动泵、三个压力传感器、两个pH/电导率传感器、一个循环液储液罐、一个进料储液罐、一个废弃滤液储液罐出口组成形成循环流路。外连一台称重装置和一台中央处理器控制循环液流动及蠕动泵开和关。
本发明复用对流色谱***可以用于纯化蛋白,尤其是适用于单克隆抗体,利用本发明复用对流色谱***处理单克隆抗体的方法为:将单克隆抗体细胞发酵液通过进料口进入复用对流色谱***,首先进入切向流过滤***进行样品浓缩;在样品浓缩至一定程度时,从进料口添加缓冲液进行缓冲液置换;经过切向流过滤***浓缩和缓冲液置换后的样品进入大孔连续色谱进行一步或多步除杂;经过大孔连续色谱处理后,样品重新进入切向流过滤***进行浓缩。二次浓缩过程中,从进料口添加单克隆抗体存储液,对样品进行存储液置换;样品经过存储液置换并浓缩到特定的浓度范围后,切向流过滤***和大孔连续色谱***下线,样品由收集管收集、存储。
本发明中缓冲液成分根据大孔连续色谱的吸附介质确定。
本发明中的待纯化处理的粗蛋白溶液是指获得的发酵细胞经离心、细胞破碎、离心、过滤后初步纯化后得到的粗蛋白溶液。
本发明中蛋白的存储液是指用于存储纯化后蛋白的溶液。
本发明中大孔连续色谱柱是指基于大孔连续色谱技术的蛋白层析柱,即该色谱柱是将大孔连续色谱技术与蛋白层析相结合的纯化柱,如疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱,复合色谱层析柱,或其他基于大孔连续色谱技术的蛋白层析柱。本发明有益效果:
本发明中切向流过滤装置起浓缩作用、缓冲溶液置换以及蛋白存储液置换的作用,大孔连续色谱装置起纯化作用,本发明***充分利用了色谱柱高通量、耐压性强,结合切向流过滤***,集细胞上清液的浓缩、缓冲液置换、纯化以及最后产品的配方于一体;同时,该***整合了下游的纯化步骤,无需更换色谱柱,重新调整条件,实现了由细胞液回收到最后产品纯化的一步操作,可以达到省时省力、经济高效的纯化目的。此外,该***可以进一步集成紫外光探测、pH、电导仪等实现对整个纯化过程的实时监测,最终建立高效、简便、经济的实验室、中试规模抗体生产平台,在各种蛋白纯化中试平台具有很大的应用前景。
本发明***具有较好的纯化效果,如处理单克隆抗体蛋白,纯化前细胞发酵液中,宿主蛋白(Host cell protein,HCP)含量为300,000ppm,DNA含量为30,000ppm。经过辛酸-尿囊素-离心-过滤预处理后,HCP含量降低至500ppm以下,经过单通道复用对流色谱***纯化后,HCP含量小于100ppm,DNA含量小于10ppm;IgG1纯度为95%以上,回收率高于85%。
附图说明
图1为单通道复用对流色谱的结构示意图;
图2为单通道复用对流色谱的纯化原理图;
图3为多通道复用对流色谱的结构示意图;
图4为多通道复用对流色谱的纯化原理图;
图中:1,进料储液罐;2,蠕动泵I;3,切向流过滤装置;4,循环液储液罐;5,蠕动泵II;6,蠕动泵III;7,废弃滤液储液罐;8,蠕动泵IV;9,大孔连续色谱装置;10,压力传感器;11,称重装置;12,pH和电导率传感器;13,蠕动泵V。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受实施例的限制。
实施例1
如图1所示,本实施例提供了一种单通道复用对流色谱***包括进料储液罐1,蠕动泵I2,切向流过滤装置3,循环液储液罐4,蠕动泵II5,蠕动泵III6,废弃滤液储液罐7,蠕动泵IV8,大孔连续色谱装置9,蠕动泵V13和中央处理器;其中:所述进料储液罐1通过蠕动泵I2与切向流过滤装置3的进料口相连;所述切向流过滤装置3设有两个出料口,分别为回收滤液出料口和废弃滤液出料口;所述废弃滤液出料口通过蠕动泵III6与废弃滤液储液罐7相连;所述回收滤液出料口分成两个支路,一个支路通过蠕动泵V13与循环液储液罐4的进料口相连,另一个支路通过蠕动泵IV8与大孔连续色谱装置9的总进料口相连;所述循环液储液罐4的出料口通过蠕动泵II5与切向流过滤装置3的进料口相连;所述大孔连续色谱装置9的总出料口与循环液储液罐4的进料口相连;所述中央处理器控制蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6、蠕动泵IV8和蠕动泵V13的启动和停止。
本实施例复用对流色谱***为单通道复用对流色谱***,其中大孔连续色谱装置9包括一个大孔连续色谱柱。大孔连续色谱柱选自疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱和复合色谱层析柱中的任意一种。切向流过滤装置3包括切向流过滤柱。
本实施例的进料储液罐1用于分别储存待纯化处理的粗蛋白溶液、缓冲液和蛋白存储液。
作为本实施例的一种优选方式,在蠕动泵I2与切向流过滤装置3进料口之间的管路上、在蠕动泵II5与切向流过滤装置3进料口之间的管路上、在蠕动泵IV8与大孔连续色谱装置9的总进料口之间以及在废弃滤液出料口和蠕动泵III6之间均设有压力传感器10;所有压力传感器10与中央处理器数据相连,将采集到的压力信号输送至中央处理器。
作为本实施例的一种优选方式,在蠕动泵I2与进料储液罐1之间、以及在蠕动泵II5与循环液储液罐4的出料口之间均设有pH和电导率传感器12;pH和电导率传感器12与中央处理器数据连接,pH/电导率传感器将其所采集的信号传送至中央处理器。
作为本实施例的一种优选方式,所述复用对流色谱***还包括称重装置11,所述称重装置11与循环液储液罐4连接,用于称量循环液储液罐4内溶液的重量。称重装置11可以为电子秤,直接称量循环液储液罐4与其所存储的溶液的的重量;称重装置11还可以是重量传感器,重量传感器采集循环液储液罐4与其所存储的溶液的重量信息,将其所采集的重量信号传送至中央处理器。
本实施例的单通道复用对流色谱***技术原理图如图2所示。
本实施例还提供了一种利用上述复用对流色谱***纯化蛋白的方法,该方法包括如下步骤:
1)将待纯化处理的粗蛋白溶液,如单克隆抗体细胞发酵液,储存于进料储液罐1中,通过中央处理器启动蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6和蠕动泵V13,关闭蠕动泵IV8,将进料储液罐1中的待纯化处理的粗蛋白溶液输送至切向流过滤装置3中进行过滤,在过滤过程中将废弃滤液由蠕动泵III6输送至废弃滤液储液罐7中,回收滤液输送至循环液储液罐4中,经称重装置11称重后由蠕动泵II5输送回切向流过滤装置3中,重复上述过滤过程至达到既定浓缩程度,完成第一阶段的浓缩;
2)将进料储液罐1中的溶液替换为缓冲液,由蠕动泵I2将进料储液罐1中的缓冲液输送至切向流过滤装置3中进行缓冲液置换,在置换过程中将经过置换后的废弃液由蠕动泵III6输送至废弃滤液储液罐7中,置换后的回收液输送至循环液储液罐4中,经称重装置11称重后由蠕动泵II5输送回切向流过滤装置3中,重复上述置换过程完成缓冲液置换至既定的pH及电导率;
3)通过中央处理器启动蠕动泵II5和蠕动泵IV8,关闭蠕动泵V13,使得切向流过滤装置3和循环液储液罐4中的溶液进入大孔连续色谱装置9进行除杂纯化,当污染物吸附趋***衡,大孔连续色谱下线,经过大孔连续色谱装置9除杂后的溶液进入循环液储液罐4中存储;
4)通过中央处理器启动蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6和蠕动泵V13,关闭蠕动泵IV8,将进料储液罐1中的溶液替换为蛋白的存储液,将循环液储液罐4中存储的经过大孔连续色谱装置9除杂后的溶液输送至切向流过滤装置3中进行重复循环处理以完成二次浓缩和蛋白的存储液的置换,最终处理的液体由循环液储液罐4储存;
5)当单克隆抗体浓度达到1mg/mL时,通过中央处理器关闭蠕动泵I2、蠕动泵II5、蠕动泵III6、蠕动泵V13和蠕动泵IV8,收集循环液储液罐4中的溶液,即得纯化后的蛋白溶液。
实施例2
如图3所示,本实施例与实施例1的区别在于:复用对流色谱***为多通道复用对流色谱***,其中大孔连续色谱装置9包括2个并联连接的大孔连续色谱柱。其中2个并联连接的大孔连续色谱柱分别为阴离子交换层析柱和疏水色谱柱。也可以是选自疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱和复合色谱层析柱中的任意组合。
本实施例的多通道复用对流色谱***技术原理图如图4所示。
本实施例的纯化方法与实施例1的区别在于:当单克隆抗体浓度达到5mg/mL时,TFF***下线,样品处理结束,最终纯化样品由收集管收集、存储。
实施例3
以单克隆抗体IgG1为例,说明单通道复用对流色谱***可完成从细胞发酵液浓缩、回收到纯化的一步操作。
细胞培养:单克隆抗体IgG1由中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)表达产生,抗体在5升B搅拌式玻璃生物反应器中生产,采用分批补料的培养方式,培养15~30天后收集细胞发酵液。细胞培养基为无蛋白培养基CD CHO(LifeTechnologies)和无蛋白培养基PF-CHO(GE Healthcare)的混合物,两者体积比为1:1。
细胞发酵液预处理:将细胞发酵液pH调至5.3,加入辛酸和尿囊素,使辛酸和尿囊素在上述混合物中的最终质量浓度分别为0.4%和1%。混合物室温搅拌2小时,然后4000×g、室温条件下离心20min,收集上清液经由0.22μm滤膜(Rapid-Flow Filters,Thermo Scientific)过滤,收集过滤液。
过滤液(约5升)置于进料储液罐1中,经由蠕动泵I进入切向流过滤装置3(切向流过滤柱,TFF),废弃滤液经蠕动泵III6废弃滤液储液罐7排出***,经过切向流过滤装置3浓缩的样品进入循环液储液罐4中称重后再次进入TFF柱进行浓缩。当循环液体积浓缩至约3升时,在进料储液罐1中添加Tris-HCl缓冲液(pH 7.5),Tris-HCl缓冲液进入TFF柱对浓缩的样品进行缓冲液置换。循环液经缓冲液置换后,由中央处理器控制大孔连续色谱装置9(单通道复用对流色谱***,大孔连续色谱柱采用阴离子交换层析柱)前端蠕动泵IV8开启,循环液进入大孔连续色谱装置9(阴离子交换柱)开始IgG1纯化,循环液全部从大孔连续色谱装置9(阴离子交换柱)流出后,纯化结束AMC***下线。纯化后IgG1进入TFF***进一步浓缩,同时在进料储液罐1中添加PBS缓冲液(pH 7.2-7.4,10mM)作为单克隆抗体存储液,对IgG1进行存储液置换。当IgG1浓度达到3mg/mL时,TFF***下线,样品处理结束,最终纯化样品由收集管收集、存储。宿主蛋白含量通过Generation III CHO HCP试剂盒检测,DNA含量通过数字型PCR仪QX100TMDroplet DigitalTMPCR System(Bio-Rad)检测。
实验结果:纯化前细胞发酵液中,宿主蛋白(Host cell protein,HCP)含量为300,000ppm,DNA含量为30,000ppm。经过辛酸-尿囊素-离心-过滤预处理后,HCP含量降低至500ppm以下。经过单通道复用对流色谱***纯化后,HCP含量小于100ppm,DNA含量小于10ppm;IgG1纯度为95%以上,回收率高于85%。符合现有美国食品和药物管理局(Food anddrug administration,FDA)对单克隆抗体蛋白产品的要求。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可以做各种改动和修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种复用对流色谱***,其特征在于,所述复用对流色谱***包括进料储液罐(1),蠕动泵I(2),切向流过滤装置(3),循环液储液罐(4),蠕动泵II(5),蠕动泵III(6),废弃滤液储液罐(7),蠕动泵IV(8),大孔连续色谱装置(9),蠕动泵V(13)和中央处理器;其中:所述进料储液罐(1)通过蠕动泵I(2)与切向流过滤装置(3)的进料口相连;所述切向流过滤装置(3)设有两个出料口,分别为回收滤液出料口和废弃滤液出料口;所述废弃滤液出料口通过蠕动泵III(6)与废弃滤液储液罐(7)相连;所述回收滤液出料口分成两个支路,一个支路通过蠕动泵V(13)与循环液储液罐(4)的进料口相连,另一个支路通过蠕动泵IV(8)与大孔连续色谱装置(9)的总进料口相连;所述循环液储液罐(4)的出料口通过蠕动泵II(5)与切向流过滤装置(3)的进料口相连;所述大孔连续色谱装置(9)的总出料口与循环液储液罐(4)的进料口相连;所述中央处理器控制蠕动泵I(2)、蠕动泵II(5)、蠕动泵III(6)、蠕动泵IV(8)和蠕动泵V(13)的启动和停止。
2.根据权利要求1所述的复用对流色谱***,其特征在于,所述复用对流色谱***为单通道复用对流色谱***,其中大孔连续色谱装置(9)包括一个大孔连续色谱柱。
3.根据权利要求2所述的复用对流色谱***,其特征在于,所述大孔连续色谱柱选自疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱和复合色谱层析柱中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的复用对流色谱***,其特征在于,所述复用对流色谱***为多通道复用对流色谱***,其中大孔连续色谱装置(9)包括多个并联连接的大孔连续色谱柱。
5.根据权利要求4所述的复用对流色谱***,其特征在于,所述多个并联连接的大孔连续色谱柱选自疏水色谱柱,亲和层析柱,分子筛,阴离子交换层析柱,阳离子交换层析柱和复合色谱层析柱中的任意一种并联连接或任意多种并联连接。
6.根据权利要求1所述的复用对流色谱***,其特征在于,所述进料储液罐(1)用于储存待纯化处理的粗蛋白溶液、缓冲液和蛋白的存储液。
7.根据权利要求1所述的复用对流色谱***,其特征在于,在蠕动泵I(2)与切向流过滤装置(3)进料口之间的管路上设有压力传感器(10),和/或在蠕动泵II(5)与切向流过滤装置(3)进料口之间的管路上设有压力传感器(10),和/或在蠕动泵IV(8)与大孔连续色谱装置(9)的总进料口之间设有压力传感器(10),和/或在切向流过滤装置(3)的废弃滤液出料口和蠕动泵III(6)之间设有压力传感器(10),所有压力传感器(10)与中央处理器数据相连,将采集的压力信号传送至中央处理器。
8.根据权利要求1所述的复用对流色谱***,其特征在于,在蠕动泵I(2)与进料储液罐(1)之间设有pH和电导率传感器(12),和/或在蠕动泵II(5)与循环液储液罐(4)的出料口之间设有pH和电导率传感器(12);所述pH和电导率传感器(12)与中央处理器数据连接,pH和电导率传感器(12)将其所采集的信号传送至中央处理器。
9.一种利用权利要求1所述复用对流色谱***纯化蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将待纯化处理的粗蛋白溶液输送至切向流过滤装置(3)中进行过滤,废弃滤液由蠕动泵III(6)输送至废弃滤液储液罐(7)中,回收滤液流动至循环液储液罐(4)中,循环液储液罐(4)中回收滤液经称重后由蠕动泵II(5)输送回切向流过滤装置(3)中,重复上述过滤过程至达到既定浓缩程度,完成第一阶段的浓缩;
2)将进料储液罐(1)中的溶液替换为缓冲液,由蠕动泵I(2)将进料储液罐(1)中的缓冲液输送至切向流过滤装置(3)中进行缓冲液置换,在置换过程中将经过置换后的废弃液由蠕动泵III(6)输送至废弃滤液储液罐(7)中,置换后的回收液输送至循环液储液罐(4)中,经称重后由蠕动泵II(5)输送回切向流过滤装置(3)中,重复上述置换过程完成缓冲液置换至既定的pH及电导率;
3)将切向流过滤装置(3)和循环液储液罐(4)中的溶液输送至大孔连续色谱装置(9)进行除杂;
4)将进料储液罐(1)中的溶液替换为蛋白的存储液,将经过大孔连续色谱装置(9)除杂后的溶液重新输送至切向流过滤装置(3)中进行重复循环处理以完成二次浓缩和蛋白的存储液的置换;
5)完成二次浓缩后,收集溶液即得纯化后的蛋白溶液。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述待纯化处理的粗蛋白溶液为单克隆抗体细胞发酵液。
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