CN107858324A - 一种基于阴离子交换树脂吸附分离细胞向培养基分泌的包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于阴离子交换树脂分离细胞培养液中包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法、通过所述方法产生的包括外泌体在内的细胞外囊泡及其用途。本发明的方法操作简单、便捷，只需要使用层析管/柱和移液枪及其他常见实验室耗材即可，不需要使用超速离心机，节省费用和时间；获得的细胞外囊泡纯度高、浓度大、且可大规模生产，易于临床上进一步的应用。

Description

一种基于阴离子交换树脂吸附分离细胞向培养基分泌的包括 外泌体在内的细胞外囊泡的方法

技术领域

本发明涉及通过阴离子交换树脂吸附细胞向培养基分泌的包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法、通过所述方法产生的外泌体以及包含外泌体的细胞外囊泡的应用及治疗产品。

背景技术

外泌体由细胞往外分泌，属于一种细胞外囊泡，囊泡直径约为30-150nm，既往发现在多种生物状态与疾病中发挥着重要的生理病理学功能。外泌体结构与细胞膜结构相似，由厚度约为5nm的磷脂双分子层构成，其成分主要包含神经酰胺、胆固醇、鞘脂以及含有长饱和脂肪链的甘油磷脂。外泌体在囊泡表面及内部富含各种蛋白质，并且含有多重核酸等重要的生物大分子物质，这些生物大分子物质可以被用来检测反映包括肿瘤在内等疾病的状态。目前外泌体的生物学功能的了解还不是很充分，但是众多的实验数据表明，外泌体在生命活动中发挥重要的作用，如细胞间通讯、抗原呈递以及蛋白质核酸物质交换等。尤其是外泌体参与的细胞通讯方面尤为重要，外泌体通过参与细胞间免疫信号、血管生成、增殖和分化等功能，直接影响了诸如癌症、神经退行性疾病等的发生。越来越多的证据表明，外泌体直接参与了肿瘤的发生，包括血管生成，免疫抑制，转移等。因此可以通过对外泌体内容物的检测，实现微创或者无创的疾病生物靶标信号的早期诊断及预后评估等。其中，干细胞分泌的外泌体已经在多个疾病领域发现有治疗效果，甚至有研究者认为干细胞主要通过外泌体为载体向外分泌具有治疗作用的细胞因子和非编码核酸等发挥其治疗作用。综上所述，如何能够分离得到足量且纯度高的外泌体成为目前对其研究和临床应用的首要面临问题。

间充质干细胞是一种多效干细胞，能够在一定的细胞因子环境下定向分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、胰岛β细胞等多种细胞，而且可以通过分泌蛋白质或细胞因子和免疫抑制间接发挥作用，因此一直成为再生医学中的热点。间充质干细胞能分化为成骨细胞，同种异体的骨髓进行移植治疗成骨发育不全疾病的临床试验已经开展。而归功于间充质干细胞的免疫调节能力，在临床前试验和治疗心血管病、退化性神经疾病、克罗恩病、移植物抗宿主疾病和自体免疫疾病的临床试验上已广泛地应用。目前发现在移植治疗后不会形成肿瘤，证明间充质干细胞的细胞治疗是有效而安全的。此外在心肌梗死、糖尿病、脊椎损伤、骨关节炎、多发性硬化、再生障碍性贫血、帕金森综合征、脑损伤及其他疾病领域也开展了相关临床试验，前景值得期待。

现有技术中的细胞外囊泡及外泌体最常用的分离方法是超高速离心或者是密度梯度离心法，然而这些方法需要配备各种的超高速高心机，而这种设备以及配套的超速离心管的价格是非常昂贵的，离心的时间也很长，需要损耗研究者大量的时间；超速离心机的使用需要对使用者进行单独的训练，并有很严格的操作程序，使用不当可导致样品甚至仪器的损坏；另外，单纯的超滤方法收集的外泌体浓度往往不能达到很高，对于需要较高浓度外泌体的检测与治疗等应用也是一种限制。因此，还需要寻求新型的低成本高效率的分离纯化细胞外囊泡及外泌体的方法，来克服现有技术中存在的缺陷。

离子交换层析法的基本原理如下所示：离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。

阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。

本发明希望能通过阴离子层析法作为新型的低成本便捷的分离纯化细胞外囊泡及外泌体的方法，提高外泌体的分离浓度及进一步规模化生产外泌体，以为下一步的外泌体功能实验及可能的临床应用提供帮助。

发明内容

一方面，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了分离包括间充质干细胞在内的细胞向培养基分泌的包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法，本发明的方法能够更便捷的将不同来源的细胞在无血清培养基中分泌的细胞外囊泡提取分离。其中，不同来源的细胞包括但不限于各类间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及成体细胞中的至少一种。

本发明采用的技术方案为：一种基于阴离子交换树脂吸附分离细胞向培养基分泌的包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：

1)采用细胞完全培养基培养分泌细胞外囊泡的细胞，细胞生长密度达到50-90％时，将培养基换为无血清培养基，收集富含细胞外囊泡的无血清培养基；

2)使用平衡液清洗层析管，将阴离子交换树脂加入层析管，在底部形成带有正电荷的沉淀层；使用平衡液平衡树脂；使用清洗液清洗树脂；将收集的无血清培养基加入层析柱；采用洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；

3)将收集的洗脱液透析，得到纯化的细胞外囊泡。

优选地，所述步骤(1)中细胞完全培养基为添加有0.1-20％的血清，0.1-20mmol/L的L-谷氨酰胺及50-1000000单位/L青霉素和50-1000000单位/L链霉素的α-MEM培养基；所述血清为牛胎儿血清。

优选地，所述步骤(1)中分泌细胞外囊泡的细胞包括多能诱导干细胞来源的间充质干细胞、人胚胎干细胞来源的间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞及人脐带间充质干细胞、人脂肪干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及成体细胞中的至少一种。

优选地，所述步骤(1)中的细胞的种植密度为50-10000/cm²，使用完全培养基培养的时间为1-10天。

优选地，所述步骤(1)中无血清培养基的配方为含有HT添加剂，0.1-10mmol/L的L-谷氨酰胺，0.1-10g/L的D-(+)-葡萄糖，0.1-100mL/L的100×MEM非必须氨基酸，0.1-1000mL/L的100×MEM维他命溶液的CD-CHO培养基。

优选地，所述步骤(1)中细胞生长密度达到50-90％时，用磷酸盐平衡液清洗，加入无血清培养基，1-24小时后，加入新的的无血清培养基，12-48小时后收集无血清培养基，此为富含细胞外囊泡的培养基。

优选地，所述步骤(1)中获取的无血清培养基在生物安全柜内操作，分装于高速离心管。离心力设置为0.1-169000×G，离心时长为0.1-100分钟，离心后收集上清液，弃去细胞及细胞碎片形成的沉淀，收集无血清培养基用于后续实验。

优选地，所述步骤(2)中平衡液为含有0.1-500mM磷酸盐、0.1-500mM氯化钠的水溶液。更优选地，所述步骤(2)中平衡液为含有50mM磷酸盐、50mM氯化钠的水溶液。

优选地，所述步骤(2)中清洗液为含有0.1-500mM磷酸盐、1-1000mM氯化钠的水溶液。更优选地，所述步骤(2)中清洗液为含有50mM磷酸盐、100mM氯化钠的水溶液。优选地，本发明使用的水为超纯水，所述超纯水为收集蒸发后的水并通过0.1-2μm滤膜以达到无菌及无大颗粒物质。

优选地，所述步骤(2)中使用平衡液清洗层析管：将层析管下端口掰短，悬空滴加0.1-100mL平衡液,待液体滴完。

优选地，所述步骤(2)中层析管为Econo-Pac层析管，高0.1-100cm，0.1-10*0.1-100cm大小的聚丙烯柱，柱床体积约0.1-200mL。

优选地，所述步骤(2)中将阴离子交换树脂加入层析管之前，树脂用0.1-100％乙醇溶解，使用前缓慢摇晃，避免破坏树脂间连接，使用树脂悬浊液0.1-10mL，其中含有树脂0.1-10mL，待液体流完，可见层析管下层形成树脂层。

优选地，所述步骤(2)中使用0.1-1000mL平衡液平衡树脂。

优选地，所述步骤(2)中使用0.1-1000mL清洗液清洗树脂。

优选地，所述步骤(2)中所述洗脱液为含有0.1-500mM磷酸盐、10-5000mM氯化钠的水溶液。本申请发明人经过进一步研究发现，当所述步骤(2)中所述洗脱液为含有50mM磷酸盐、500mM氯化钠的水溶液时，其洗脱效果比上述配方范围内的其他洗脱液更好，得到的外泌体浓度最大，纯度最高。

优选地，所述步骤(2)中形成树脂层后的滴加液体的操作，需要悬空操作，且动作轻柔，避免影响树脂层。

优选地，所述步骤(2)中每次使用0.1-100mL洗脱液，并在层析管下端用0.2-50mL离心管收集洗脱液，并通过0.1-2μm滤膜以达到无菌及无大颗粒物质。

本发明提供了采用上述所述的方法得到的细胞外囊泡。

本发明提供了上述所述的细胞外囊泡在制备治疗炎症、调节免疫的药物或产品中的用途。所述包括外泌体在内的细胞外囊泡制剂可应用于包括但不限于免疫调节、组织修复再生、美容和护肤相关产品或任何急性或慢性炎症及与免疫有关的损伤和过敏等。

根据本发明的实施例，所述细胞外囊泡可通过检测囊泡直径，蛋白定量，检测到特定表面抗原表达，和/或通过不存在的特定表面抗原表达来鉴定。例如本发明中的细胞外囊泡可检测到CD63和CD81抗原表达，但其表面不表达CD9抗原。

本发明阴离子层析柱组合包括属于聚丙烯材料的Econo-Pac层析管，0.1-100cm，0.1-10*0.1-100cm大小，以及带有正电荷的树脂。

本发明使用阴离子层析法可以大大减少在分离过程中由于使用超速离心机的高昂费用以及操作难度。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的基于阴离子交换树脂吸附分离细胞向培养基分泌的包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法操作简单、便捷，只需要应用阴离子层析管、柱及简单实验室用品即可操作，不需要使用超速离心技术，节省费用和时间；获得的细胞分泌的细胞外囊泡纯度高、浓度大、且可大规模生产，易于进一步的临床应用。

附图说明

图1为本发明阴离子交换树脂吸附分离间充质干细胞向培养基分泌的外泌体的方法的一个实施例的技术路线示意图；

图2为本发明阴离子层析法的基本原理示意图；

图3为本发明实施例1中尿道上皮来源的多能诱导干细胞分化的间充质干细胞的显微镜照片，是正常形态的间充质干细胞；

图4为本发明实施例1中所取第4次洗脱液经过稀释100倍后做纳米颗粒直径检测(Nanosight)以及电镜鉴定结果。图4A可见所分离的外泌体颗粒直径高峰为115nm，且单峰分布，符合外泌体预期结果。图4B为放大46000倍电镜下外泌体整体状态，电镜下可观察外泌体囊泡状结构，可见大小均一的囊泡分部在视野中，大小约为直径100nm，符合外泌体电镜结果预期；

图5为本发明实施例1中收集的样本中外泌体直径分部、蛋白定量以及表面标记物CD63的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果展示。图5A可见样品外泌体颗粒直径分部集中在120nm附近；图5B中可见蛋白含量的高峰和CD63表达量高峰在第4次洗脱液中，综上所述，我们选择第4次洗脱液中所包含的外泌体完成后续的功能实验；

图6为本发明实施例2中利用卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导的急性炎症小鼠模型初步验证外泌体的功能。图6A：OVA诱导的急性炎症模型小鼠的标本提取方法。图6B中可见外泌体可显著降低Th1主导的急性炎症反应。图6C中可见外泌体可显著降低Th2主导的急性炎症反应。EVs:外泌体。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

如图1所示，其为本发明基于阴离子交换树脂吸附分离间充质干细胞向培养基分泌的细胞外囊泡的方法一个实施例的流程示意图，本发明阴离子层析法的基本原理示意图如图2所示，该方法包括以下步骤：

步骤S1：按照一定细胞密度种植间充质干细胞，用间充质干细胞完全培养基培养至一定密度；

优选地，利用间充质干细胞完全培养基以大量扩增性的方式培养多种来源的间充质干细胞，种植密度为50-10000/cm²，使用间充质干细胞完全培养基培养的时间为4-6天，观察细胞生长密度直至60-70％；

步骤S2：更换无血清培养基，一定时间后再次更换无血清培养基，而后收获富含外泌体的培养基；

优选地，所述步骤1)所述无血清培养基的配方为添加有HT添加剂(100μM次黄嘌呤钠,16μM胸腺嘧啶)，4-8mmol/L的L-谷氨酰胺，2g/L的D-(+)-葡萄糖，10mL的100×MEM非必须氨基酸，10mL的100×MEM维他命溶液的CD-CHO培养基；显微镜下的细胞密度达60-70％时，加入30-40mL/175cm²的无血清培养基。6小时后，收获第一次添加的无血清培养基，加入新的40mL/175cm²的无血清培养基，42小时后收获第二次添加的无血清培养基，此为富含外泌体的培养基。

步骤S3：使用平衡液清洗层析管；

经过优化，平衡液选择含有50mM磷酸盐、50mM氯化钠的水溶液，轻柔加液4mL，避免形成气泡。

步骤S4：将树脂悬浊液加入层析管，在底部形成带有正电荷的沉淀层，最终形成树脂层；

优选地，步骤S4中需要轻柔加液6mL，避免破坏树脂层或形成气泡。

步骤S5：使用平衡液平衡树脂。

经过优化，平衡液选择含有50mM磷酸盐、50mM氯化钠的水溶液，步骤S5中需要轻柔加液12mL，避免破坏树脂层或形成气泡。

步骤S6：使用清洗液清洗层析柱；

经过优化，清洗液选择含有50mM磷酸盐、100mM氯化钠的水溶液，步骤S6中需要轻柔加液40mL，避免破坏树脂层或形成气泡。

步骤S7：将富含外泌体的培养基加入层析柱；

优选地，步骤S7中需要轻柔加液160mL，避免破坏树脂层或形成气泡。

步骤S8：逐次加入洗脱液1和洗脱液2，并用离心管分别收集洗脱液。

经过优化，洗脱液选择含有50mM磷酸盐、500mM氯化钠的水溶液，逐次加入1mL洗脱液1(8管)和洗脱液2(4管)，并用1.5mL离心管分别收集洗脱液。

步骤S9：对洗脱液样品进行透析

优选地，将透析管剪切为10cm长，经过灭菌处理后连接于足量磷酸盐缓冲液(PBS)和样品之间，并置于搅拌器平板4℃过夜，回收样品。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)基于阴离子交换树脂吸附分离间充质干细胞向培养基分泌的外泌体的方法

本实施例的基于阴离子交换树脂吸附分离间充质干细胞向培养基分泌的细胞外囊泡的方法，包括以下步骤：

①利用间充质干细胞完全培养基以大量扩增性的方式培养多种来源的间充质干细胞，种植密度为50-10000/cm²，使用间充质干细胞完全培养基培养的时间为4-6天，观察细胞生长密度直至60-70％；尿道上皮来源的多能诱导干细胞分化的间充质干细胞的显微镜照片如图3所示；

②显微镜下的细胞密度达60-70％时，加入30-40mL/175cm²的无血清培养基。6小时后，收获第一次添加的无血清培养基，加入新的40mL/175cm²的无血清培养基，42小时后收获第二次添加的无血清培养基，此为富含外泌体的培养基，收集1mL无血清培养基(命名为IP)；

③使用4mL平衡液清洗层析管，轻柔加液，避免形成气泡；

④将6mL树脂悬浊液加入层析管，在底部形成带有正电荷的沉淀层，最终形成4mL的树脂层；

⑤使用12mL平衡液平衡树脂。

⑥将160mL富含外泌体的培养基加入层析柱，在滴注过程中途收集1mL液体(命名为FT)；

⑦使用40mL清洗液清洗层析柱在滴注过程中途收集1mL液体(命名为W)；

⑧逐次加入1mL洗脱液1(8管)和洗脱液2(4管)，并用1.5mL离心管分别收集洗脱液。

⑨将需要用于下一步功能实验的第4次洗脱液进行透析。将透析管剪切为10cm长，经过灭菌处理后连接于足量磷酸盐缓冲液(PBS)和样品之间，并置于搅拌器平板4℃过夜，回收样品并电镜鉴定(图4)，图4A可见所分离的外泌体颗粒直径高峰为115nm，且单峰分布，符合外泌体预期结果。图4B为放大46000倍电镜下外泌体整体状态，电镜下可观察外泌体囊泡状结构，可见大小均一的囊泡分部在视野中，大小约为直径100nm，符合外泌体电镜结果预期。

(2)外泌体的蛋白定量以及表面抗原CD63的ELISA鉴定

外泌体的蛋白定量：

1).配制工作液:根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

2).稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100微升，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20微升。

3).加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20微升。

4).各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分钟。

5).冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。MSC的表面marker CD63 ELISA鉴定方法：

1)将CD63一抗(种属为兔抗鼠)稀释1000倍，于每个孔加入200μL在37℃孵育半个小时；

2)空白孔加标本或标准品稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90分钟；

3)洗板5次。

4)空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μ/l孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60分钟；

5)洗板5次。

6)空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μ/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育30分钟；

7)洗板5次。

8)加入显色底物100μ/孔，避光37℃孵育15分钟；

9)加入终止液100μ/孔，混匀后即刻检测OD450值，得到结果(图5)，图5A可见样品外泌体颗粒直径分部集中在120nm附近；图5B中可见蛋白含量的高峰和CD63表达量高峰在第4次洗脱液中，此时所用的洗脱液为含有50mM磷酸盐、500mM氯化钠的水溶液，综上所述，我们选择第4次洗脱液中所包含的外泌体完成后续的功能实验。

实施例2

(1)巨噬细胞功能检测

1.1实验分组(共5组)：

A.正常对照组：完全培养基(DMEM+10％FBS，300μL/well，下同)

B.阳性对照组：完全培养基+10ng/mL Ovalbumin(OVA)

C.***(DEX)治疗组：完全培养基+10ng/mL OVA+1μM DEX

D.外泌体治疗组(5×10⁸/mL外泌体)：完全培养基+10ng/mL OVA+5×10⁸/mL外泌体

E.外泌体治疗组(2.5×10⁹/mL外泌体)：完全培养基+10ng/mL OVA+2.5×10⁹/mL外泌体

1.2细胞种板：复苏RAW 264.7细胞，将细胞按照1×10⁵种植在48孔培养板，每组设3个复孔，共种植15个孔，每孔加入300μL完全培养基，放置于细胞培养箱培养隔夜。

1.3外泌体抗炎功能实验：用1.5mL EP管按照步骤2.1为每个组配制1mL培养液，然后将原来各孔中的完全培养基吸除，再将配置好的培养液均分到每组的3个复孔中，每孔300μL，放置于细胞培养箱培养4h后收取细胞培养上清，用ELISA检测小鼠IL-6的表达水平，外泌体在体外可抑制巨噬细胞分泌IL-6。

(2)OVA诱导小鼠全身炎症模型

图6A中可见OVA诱导的急性炎症模型小鼠的标本提取方法。

2.1 Th1主导炎症模型

实验分组(每组4-6只)：

A.正常对照组：PBS致敏+PBS雾化激发(可选择性)

B.阳性对照组：40μg OVA致敏+0.5％OVA雾化激发

C.外泌体治疗组(外泌体)：40μg OVA致敏+0.5％OVA雾化激发+200μL(10ⅹ10⁹)外泌体治疗

于第0和第7天利用皮下注射OVA及弗式完全佐剂致敏小鼠，并于第18、19、20、21天利用雾化的0.5％OVA激发小鼠气道炎症；每只小鼠于激发前一天(第17天)通过尾静脉注射200μL含外泌体溶液，最后一天激发后4小时麻醉取材。

A.小鼠麻醉方法：腹腔注射1％戊巴比妥钠；

B.小鼠取材标本：肺泡灌洗液(BALF)或其他。

C.用细胞染色检测BALF中炎症细胞数量，并利用ELISA方法检测BALF中促炎因子IFN-γ等的表达水平，图6B中可见外泌体可显著降低Th1主导的急性炎症反应。

2.2 Th2主导炎症模型：

实验分组(每组4-6只)：

A.正常对照组：PBS致敏+PBS雾化激发(可选择性)

B.阳性对照组：40μg OVA致敏+0.5％OVA雾化激发

C.外泌体治疗组(外泌体)：40μg OVA致敏+0.5％OVA雾化激发+200μL(10ⅹ10⁹)外泌体治疗

于第0、第7和第14天腹腔注射OVA及氢氧化铝致敏小鼠，并于第21、22、23、24天利用雾化的0.5％OVA激发小鼠气道炎症；每只小鼠于激发前一天(第20天)通过尾静脉注射200μL含外泌体溶液，最后一天激发后4小时麻醉取材。

A.小鼠麻醉方法：腹腔注射1％戊巴比妥钠；

B.小鼠取材标本：肺泡灌洗液(BALF)或其他。

C.用细胞染色检测BALF中炎症细胞数量，并利用ELISA方法检测BALF中促炎因子IL-4等的表达水平，图6C中可见外泌体可显著降低Th2主导的急性炎症反应。

Claims (10)

1.一种基于阴离子交换树脂吸附分离细胞向培养基分泌的包括外泌体在内的细胞外囊泡的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)采用细胞完全培养基培养分泌细胞外囊泡的细胞，细胞生长密度达到50-90％时，将培养基换为无血清培养基，收集富含细胞外囊泡的无血清培养基；

2)使用平衡液清洗层析管，将阴离子交换树脂加入层析管，在底部形成带有正电荷的沉淀层；使用平衡液平衡树脂；使用清洗液清洗树脂；将收集的无血清培养基加入层析柱，采用洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；

3)将收集的洗脱液透析，得到纯化的细胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中细胞完全培养基为添加有0.1-20％的血清，0.1-20mmol/L的L-谷氨酰胺及50-1000000单位/L青霉素和50-1000000单位/L链霉素的α-MEM培养基；所述血清为牛胎儿血清。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中分泌细胞外囊泡的细胞包括多能诱导干细胞来源的间充质干细胞、人胚胎干细胞来源的间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞及人脐带间充质干细胞、人脂肪干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞及成体细胞中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的细胞的种植密度为50-10000/cm²，使用完全培养基培养的时间为1-10天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中无血清培养基的配方为含有HT添加剂，0.1-10mmol/L的L-谷氨酰胺，0.1-10g/L的D-(+)-葡萄糖，0.1-100mL的100×MEM非必须氨基酸，0.1-1000mL的100×MEM维他命溶液的CD-CHO培养基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：细胞生长密度达到50-90％时，用磷酸盐平衡液清洗，加入无血清培养基，1-24小时后，加入新的的无血清培养基，12-48小时后收集无血清培养基，此为富含细胞外囊泡的培养基。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中平衡液为含有0.1-500mM磷酸盐、0.1-500mM氯化钠的水溶液；所述步骤(2)中清洗液为含有0.1-500mM磷酸盐、1-1000mM氯化钠的水溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述洗脱液为含有0.1-500mM磷酸盐、10-5000mM氯化钠的水溶液。

9.采用如权利要求1-8任一所述的方法得到的细胞外囊泡。

10.如权利要求9所述的细胞外囊体在制备治疗炎症的药物中的用途。