CN113908235B - 治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂及其制备方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂，其制备方法以及用途。该中药复方制剂由以下中药制备而成：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、以及密蒙花。本发明的中药复方制剂可用于治疗糖尿病视网膜病变，并且明确其分子水平的功能为抑制糖尿病视网膜病变下视网膜组织中TGF‑β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达，促进提高糖尿病视网膜病变下视网膜组织中miR‑200b水平，从而能够精准匹配病症具体情况，利于提高诊治效果。

Description

治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂及其制备方法、用途
技术领域
本发明涉及一种治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂，以及其制备方法、用途，属于中医药技术领域。
背景技术
据发明人所知，糖尿病视网膜病变(下称DR)是糖尿病(下称DM)的主要微血管并发症之一，中医称其为“消渴目病”。最近的荟萃分析显示：DM人群中DR总发生率约34.6％，DR已成为全球中老年人视力丧失的主要原因。目前DR的发病机制仍未完全阐明，积极探寻有效的干预手段对DR防治有着极其重要的意义。
在美国眼科协会制定的最新DR临床防治指南中，仍然将严格控制血糖、血压、血脂等代谢紊乱作为主要的药物防治手段。而全视网膜光凝术、抗VEGF单抗球后注射和玻璃体切割术则是在出现严重非增殖期糖尿病视网膜病变(下称NPDR)或增殖期糖尿病视网膜病变(下称PDR)且合并相应适应症时选择性使用。同时指南中建议，对于糖尿病黄斑水肿(DME)、严重的NPDR和PDR患者，应及时转诊给富有DR临床管理经验的眼科医师。因此，在DR早期选择合适的药物以缓解及防止病变进一步加重是所有负责DR管理的内分泌科和全科医师的重要职责。
关于DR的药物干预，除了控制血糖、血压、血脂等基础治疗外，其它如改善微循环药物、自由基清除剂、抗血栓药物、二酯酰甘油-蛋白激酶C抑制剂等对DR可能有一定的疗效，但其作用相对有限，需要进一步深入研究。
中医对DR的形成和防治在长期的临床实践中积累了丰富的经验。针对DR的治疗手段包括辨证治疗、分期治疗、专方专药、中药提取物、针灸、中药离子导入等多种方式。相关研究提示，中药可通过改善氧化应激、炎症状态来减轻视网膜周细胞凋亡并改善内皮细胞功能，也可通过调节某些细胞因子如缺氧诱导因子-1α、胰岛素生长因子-1、白介素-6、肿瘤坏死因子-α等来抑制视网膜新生血管增殖以达到改善DR的目的。但目前中药复方制剂干预DR的研究多以临床观察为主，动物实验及相关机制探索的研究证据相对较少，亟待增添这方面的研究成果。
经检索发现，申请号CN20061007164.1、申请公布号CN1857531A的发明专利申请公开了一种治疗糖尿病视网膜病变的中药制剂处方及其制备方法；专利号CN201110194682.0、授权公告号CN102258709B的发明专利也公开了一种治疗糖尿病视网膜病变的中药制剂及其制备方法。这些技术方案均与本发明涉及的研究成果不同，而且它们均未在机制探索方面做相关研究，仍然存在改进的空间。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂，能抑制该病变下视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达，并能促进提高该病变下视网膜组织中miR-200b水平。同时，还提供相应的中药复方制剂制备方法、用途。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂，其特征是，由以下中药制备而成：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、以及密蒙花；所述黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、密蒙花的重量比为15-30：10-20：10-20：30-60：10-20：15-30：3-6：10-15。
在该中药复方制剂中：黄芪，味甘，性微温，可益气兼利湿通滞；生地黄，味甘，性寒，可养阴生津；石斛，味甘，性微寒，可滋阴生津，此三者相伍，为益气养阴之主药；黄蜀葵花味甘，性寒，有清利湿热之功；丹皮，苦、辛，性微寒，有凉血活血之功；丹参味苦，微寒，有祛瘀凉血之功；三七，味甘、微苦，性温，有化瘀止血之功，此四者相伍，为化湿活血之主药；密蒙花，味甘，微寒，有清热养肝明目之功。全方温凉配合、补清并用，共奏益气养阴、化湿活血之功效。
经实验验证，对于糖尿病视网膜病变下的视网膜组织，该中药复方制剂能够改善视网膜的病理改变，改善视网膜毛细血管状况，抑制视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达，促进提高视网膜组织中miR-200b水平。
上述中药复方制剂进一步完善的技术方案如下：
优选地，所述黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、密蒙花的重量比为15：15：10：30：15：15：3：10。
优选地，所述中药复方制剂由以下中药制备而成：黄芪15-30克，生地黄10-20克，石斛10-20克，黄蜀葵花30-60克，丹皮10-20克，丹参15-30克，三七粉3-6克，密蒙花10-15克。
更优选地，所述中药复方制剂由以下中药制备而成：黄芪15g、生地黄15g、石斛10g、黄蜀葵花30g、丹皮15g、丹参15g、三七粉3g、密蒙花10g。
采用以上优选方案，可进一步优化各中药的重量配比。
本发明还提供：
前文所述治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂的制备方法，其特征是，所述中药复方制剂为中药复方汤剂；所述制备方法包括以下步骤：
第一步、取处方量的黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、密蒙花，以清洁水浸泡30-60分钟，然后放入煎药机中；
第二步、向煎药机中加入预定量的水，煎煮30-60分钟；利用煎药机的机械挤压部件，将药汁挤出；
第三步、向药汁中加入处方量的三七粉，混匀，并将所得液体分装，即得成品。
优选地，第二步中，所述预定量为每剂中药复方制剂对应500-600毫升的水。
前文所述治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂的制备方法，其特征是，所述中药复方制剂为中药复方提取物；所述制备方法包括以下步骤：
第一步、取处方量的黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、密蒙花，以水煎煮至少2次，每次煎煮1-2小时；合并煎煮液，过滤取滤液；
第二步、将滤液在温度65℃-85℃下减压浓缩3-4小时，获得浸膏；将浸膏在80℃±5℃下持续搅拌30-40分钟后，加入处方量的三七粉，继续搅拌至混匀；
第三步、将所得混合物喷雾干燥，即得成品。
采用以上制备方法，可制备获得中药复方汤剂或中药复方提取物，以备患者服用。
优选地，第二步中，加入三七粉后的搅拌时间为5-10分钟。
本发明还提供：
前文所述中药复方制剂用以制备治疗糖尿病视网膜病变药物的用途。
优选地，所述药物的治疗作用包括改善糖尿病视网膜病变下视网膜的病理改变、改善糖尿病视网膜病变下视网膜毛细血管状况、抑制糖尿病视网膜病变下视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达、促进提高糖尿病视网膜病变下视网膜组织中miR-200b水平。
本发明的中药复方制剂可用于治疗糖尿病视网膜病变，并且明确其分子水平的功能为抑制糖尿病视网膜病变下视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达，促进提高糖尿病视网膜病变下视网膜组织中miR-200b水平，从而能够精准匹配病症具体情况，利于提高诊治效果。
附图说明
图1为本发明实施例各组大鼠视网膜组织的HE染色结果比较图(HE×200)。
图2为本发明实施例各组大鼠视网膜血管消化铺片的结果比较图(PAS×200)。
图3为本发明实施例各组大鼠视网膜组织中TGF-β1及VEGF蛋白免疫荧光比较图。
图4为本发明实施例各组大鼠视网膜组织中TGF-β1及VEGF蛋白表达情况比较图。
图5为本发明实施例各组大鼠视网膜组织中TGF-β1mRNA、miR-200b、VEGF mRNA表达情况比较图。
具体实施方式
发明人课题组在本项目研究中，先通过对已知方剂的研究，证实生地黄、丹皮、黄蜀葵花等中药对糖尿病视网膜病变(下称DR)具有疗效，并且为采用“滋阴化湿活血法”治疗DR提供依据。之后，在文献调研基础上，结合DR“气阴两虚、湿瘀阻络”的病机特点及既往DR诊治的临床经验，拟定中药复方制剂的配方为：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、以及密蒙花。然后对中药剂量进行摸索实验，并确定：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、密蒙花的重量比为15-30：10-20：10-20：30-60：10-20：15-30：3-6：10-15；在实验过程中，将上述中药复方制剂(汤剂)给DR合并黄斑水肿的患者服用后，视力明显改善且黄斑水肿减轻；不过，有部分患者服用后觉身体燥热，于是调整黄芪剂量降至上述范围，并且调整丹皮提高至上述范围，其余不变，患者燥热症状好转。最后，在上述确定的剂量配比下，开展动物及临床研究。
具体实施时，本发明治疗糖尿病视网膜病变的中药复方制剂，由以下中药制备而成：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、以及密蒙花；其中，黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、密蒙花的重量比为15-30：10-20：10-20：30-60：10-20：15-30：3-6：10-15。
上述重量比优选为：15：15：10：30：15：15：3：10。
剂量组成优选为：黄芪15-30克，生地黄10-20克，石斛10-20克，黄蜀葵花30-60克，丹皮10-20克，丹参15-30克，三七粉3-6克，密蒙花10-15克。进一步优选为：黄芪15g、生地黄15g、石斛10g、黄蜀葵花30g、丹皮15g、丹参15g、三七粉3g、密蒙花10g。
剂量组成的具体实例如下：
实例1，黄芪15g、生地黄15g、石斛10g、黄蜀葵花30g、丹皮15g、丹参15g、三七粉3g、密蒙花10g。
实例2，黄芪30g、生地黄10g、石斛20g、黄蜀葵花60g、丹皮10g、丹参30g、三七粉6g、密蒙花15g。
实例3，黄芪21g、生地黄20g、石斛17g、黄蜀葵花44g、丹皮20g、丹参19g、三七粉5g、密蒙花13g。
本发明的中药复方制剂可为中药复方汤剂，具体制备方法为：
第一步、取处方量的黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、密蒙花，以清洁水浸泡30-60分钟，然后放入煎药机中；
第二步、向煎药机中加入预定量的水，煎煮30-60分钟；利用煎药机的机械挤压部件，将药汁挤出；预定量为每剂中药复方制剂对应500-600毫升的水；
第三步、向药汁中加入处方量的三七粉，混匀，并将所得液体分装，即得成品。
本发明的中药复方制剂还可为中药复方提取物，具体制备方法为：
第一步、取处方量的黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、密蒙花，以水煎煮至少2次，每次煎煮1-2小时；合并煎煮液，过滤取滤液；
第二步、将滤液在温度65℃-85℃下减压浓缩3-4小时，获得浸膏；将浸膏在80℃±5℃下持续搅拌30-40分钟后，加入处方量的三七粉，继续搅拌至混匀(搅拌5-10分钟)；
第三步、将所得混合物喷雾干燥，即得成品。
本发明的中药复方制剂可用于制备治疗糖尿病视网膜病变的药物。该药物的治疗作用包括抑制糖尿病视网膜病变下视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达，促进提高糖尿病视网膜病变下视网膜组织中miR-200b水平。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例
本实施例为本发明中药复方制剂的药效学资料。
(1)实验材料：
①动物：SPF级健康雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，6周龄，体质量180g左右。
②中药复方制剂：处方剂量组成：黄芪15g、生地黄15g、石斛10g、黄蜀葵花30g、丹皮15g、丹参15g、三七粉3g、密蒙花10g(即前文的实例1)。以此处方按前文所述方法制备出中药复方提取物(干燥颗粒粉剂)，备用。
(2)实验方法：
40只雄性SD大鼠中，随机选取8只作为正常对照组，另外32只大鼠制备DR模型。DR大鼠建模成功后随机分配到以下4组：DR组、DR+中药复方低剂量(FFE-L)组、DR+中药复方高剂量(FFE-H)组、DR+羟苯磺酸钙(CD)组。
DR+FFE-L组及DR+FFE-H组分别将中药复方提取物的粉剂按1.0g/kg/d及3.0g/kg/d剂量以0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制后给大鼠灌胃。DR+CD组，将羟苯磺酸钙按照135mg/kg/d剂量与0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制后给大鼠灌胃。正常对照组及DR组每日给予同量0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃。
各组均正常饮食、进水、灌胃，持续8周后，用3％戊巴比妥钠过量麻醉处死所有大鼠，迅速摘除双侧眼球，用眼科剪沿角巩膜缘剪去角膜，去除前节和玻璃体，制成视杯。各组随机抽取3只鼠的双侧视杯，一侧行HE染色，另一侧行视网膜血管消化铺片。其余视杯全部分离视网膜组织，分别行TGF-β1及VEGF的免疫荧光、PCR及Wb检测，miR-200b的PCR检测。
(3)实验结果：
①中药复方制剂对DR大鼠视网膜组织病理改变的影响
如图1所示，HE染色结果显示：对照组大鼠视网膜结构正常，节细胞层细胞较为整齐，内核以及外核层细胞排列紧密；DR组大鼠节细胞层细胞排列较为紊乱，内核层与外核层排列较空白组相比稀疏，排列不紧密。与DR组相比，DR+FFE-L组节细胞紊乱有所减轻，而DR+FFE-H组及DR+CD组的病理改变则有明显进一步改善。
②中药复方制剂对DR大鼠视网膜毛细血管改变的影响
如图2以及表1所示，血管消化铺片显示：对照组大鼠视网膜毛细血管分布规则，血管管径粗细均匀一致，走向较直，可见极少数无细胞毛细血管，未见周细胞鬼影；微血管密度(14.83±2.04)/HPD，E/P比值(1.03±0.12)。
DR组大鼠视网膜毛细血管网明显变密，行走紊乱，管径粗细不均，扭曲扩张，管壁边缘不规则，多根毛细血管扭聚成丛，可见较多无细胞毛细血管、周细胞鬼影，内皮细胞明显增生；微血管密度(30.33±3.83)/HPD和E/P比值(2.43±0.22)较对照组均显著升高(P<0.001)。
DR+FFE-L组的微血管改变较DR组有所减轻，微血管密度(24.50±2.88)/HPD和E/P比值(1.83±0.13)较DR组均显著下降(P<0.01，P<0.001)。
而DR+FFE-H组及DR+CD组微血管改变有进一步改善，微血管密度及E/P比值较DR组均显著下降(P<0.001)。
表1.各组视网膜血管消化铺片微血管密度及E/P比值比较
*vs对照，P<0.01；**vs对照，P<0.001；#vs DR，P<0.01；##vs DR，P<0.001
③中药复方制剂对DR大鼠视网膜组织中TGF-β1及VEGF蛋白表达的影响
如图3所示，视网膜组织免疫荧光显示：DR组TGF-β1以及VEGF较对照组表达明显增强，DR+FFE-L组较DR组有所降低，DR+FFE-H组较DR组显著降低，DR+CD组降低最明显。
如图4所示，视网膜组织Western blot检测显示：DR组TGF-β1及VEGF蛋白表达较对照组明显升高(P<0.01)，DR+FFE-L组较DR组有显著下降(P<0.05)，DR+FFE-H组VEGF较DR+FFE-L组有显著下降(P<0.05)，DR+CD组TGF-β1及VEGF较DR组均有显著下降(P<0.01)。
④中药复方制剂对DR大鼠视网膜组织中miR-200b及TGF-β1、VEGF mRNA表达的影响
如图5所示，视网膜组织qRT-PCR检测显示：DR组TGF-β1及VEGF mRNA表达较对照组显著升高(P<0.01)，miR-200b表达较对照组显著降低(P<0.01)。
DR+FFE-L组TGF-β1及VEGF mRNA表达较DR组明显下降(P<0.01)，miR-200b较DR组显著上升(P<0.05)。
DR+FFE-H组VEGF mRNA表达较DR+FFE-L组有进一步下降(P<0.01)，miR-200b较DR+FFE-L组有进一步上升(P<0.01)。
DR+CD组TGF-β1及VEGF mRNA表达较DR组均明显下降(P<0.01)，miR-200b较DR组表达显著升高(P<0.01)。
需要说明的是，前文的实例2、实例3也具备与实例1上述各方面基本一致的作用或效果。
以上实验结果通过干预DR模型的体内实验证实了本发明中药复方制剂对DR的有效性。其对DR大鼠视网膜组织及微血管(毛细血管)损伤有明显减轻作用，可抑制DR大鼠视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达，促进miR-200b水平的提高。因此，本发明中药复方在DR防治上具有较好的应用前景。
在分子机制功能方面：
(1)TGF-β1/miR-200b/VEGF通路激活是DR发生的重要分子机制。
高糖可使视网膜内皮细胞及上皮细胞等表达TGF-β1的水平及活性明显上升，而TGF-β1可抑制miR-200b启动子的活性而降低miR-200b表达水平。miR-200b可特异性地与VEGF mRNA结合，从而抑制VEGF蛋白合成。视网膜组织中VEGF高表达可特异性损伤BRB(血-视网膜屏障)导致DR发生。因此，高糖使视网膜中TGF-β1高表达而降低miR-200b水平，进而使VEGF水平升高而损伤BRB，这条通路被视作DR发生的重要分子机制。
(2)本发明中药复方制剂可显著抑制TGF-β1/miR-200b/VEGF通路激活。
由前文可知：本发明中药复方制剂可显著抑制DR大鼠视网膜组织中TGF-β1和VEGFmRNA及蛋白的表达，同时可显著提高miR-200b的表达，因此对DR大鼠视网膜组织中TGF-β1/miR-200b/VEGF通路的激活有显著抑制作用。由此可知，本发明中药复方制剂正是因具备该机制功能从而发挥了治疗DR的作用。
以上实施例中采用羟苯磺酸钙作为阳性对照。与羟苯磺酸钙相比，本发明中药复方制剂治疗DR的疗效相当，且还具有以下优势：
(1)依从性好
中医药在国内拥有悠久的历史、良好的体验感和众多的患者群，甚至在国际上也享有较高的知名度。很多患者信任并坚持使用中医药治疗，因此具有很好的服药依从性。
(2)剂型多样
本发明中药复方制剂除可制作成汤剂、颗粒剂外，还可制作成膏剂、丸剂等多种剂型，可适应不同患者的不同需求。
(3)作用机制独特
本发明中药复方制剂通过抑制TGF-β1/miR-200b/VEGF通路发挥治疗DR的作用。而羟苯磺酸钙的作用机制早已有研究定论，并非主要通过上述机制发挥治疗DR作用。
(4)卫生经济学优势
中草药的效优价廉使其在面对DR防治的巨大医疗费用时具有更好的卫生经济学优势。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种中药复方汤剂用于制备治疗糖尿病视网膜病变药物的用途；
所述中药复方汤剂由以下中药制备而成：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、以及密蒙花；所述黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、密蒙花的重量比为15:15:10:30:15:15:3:10；
所述中药复方汤剂的制备方法由以下步骤构成：
第一步、取处方量的黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、密蒙花，以清洁水浸泡30-60分钟，然后放入煎药机中；
第二步、向煎药机中加入预定量的水，煎煮30-60分钟；利用煎药机的机械挤压部件，将药汁挤出；
第三步、向药汁中加入处方量的三七粉，混匀，并将所得液体分装，即得成品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，第二步所述预定量的水为每15g黄芪、15g生地黄、10g石斛、30g黄蜀葵花、15g丹皮、15g丹参、3g三七粉、10g密蒙花对应500-600毫升的水。
3.一种中药复方提取物用于制备治疗糖尿病视网膜病变药物的用途；
所述中药复方提取物由以下中药制备而成：黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、以及密蒙花；所述黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、三七粉、密蒙花的重量比为15:15:10:30:15:15:3:10；
所述中药复方提取物的制备方法由以下步骤构成：
第一步、取处方量的黄芪、生地黄、石斛、黄蜀葵花、丹皮、丹参、密蒙花，以水煎煮至少2次，每次煎煮1-2小时；合并煎煮液，过滤取滤液；
第二步、将滤液在温度65℃-85℃下减压浓缩3-4小时，获得浸膏；将浸膏在80℃±5℃下持续搅拌30-40分钟后，加入处方量的三七粉，继续搅拌5-10分钟至混匀；
第三步、将所得混合物喷雾干燥，即得成品。
4.根据权利要求1~3任一项所述的用途，其特征在于，所述药物的治疗作用包括改善糖尿病视网膜病变下视网膜的病理改变、改善糖尿病视网膜病变下视网膜毛细血管状况、抑制糖尿病视网膜病变下视网膜组织中TGF-β1蛋白和mRNA、VEGF蛋白和mRNA的过表达、促进提高糖尿病视网膜病变下视网膜组织中miR-200b水平。
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