CN116426469B - LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种LAP2α在间充质干细胞成脂向分化过程中的应用，提出LAP2α基因或LAP2α蛋白的激动剂可以用于加速间充质干细胞成脂向分化，以达到促进脂肪再生的目的，在治疗软组织缺损和凹陷方面有着广阔的开发应用前景。LAP2α基因或LAP2α蛋白的抑制剂可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪分化调控异常相关疾病的药物，如肥胖症、糖尿病、脂肪肝及高脂血症等，未来有望实现临床推广，提升患者生活质量，减轻社会经济负担。
Description
技术领域
本申请涉及基因的功能与应用技术领域，具体而言，涉及一种LAP2α在间充质干细胞成脂向分化中的应用。
背景技术
软组织缺损或凹陷是由创伤、先天畸形、感染、肿瘤切除等原因导致的组织缺损，可能会影响面部的外观和一些生理功能，例如言语、咀嚼、吞咽等。颌面部软组织缺损的病因可分为两类：先天性因素和后天性因素。最常见的先天性因素是唇腭裂，而后天性因素主要是由创伤引起的，例如交通事故和烧伤。软组织重建是颌面缺损术后修复的重要部分。自体组织移植、异体组织移植、人工材料植入常用于软组织缺损修复。自体组织移植是指将患者自身的组织移植到缺损部位进行修复，如自体口腔黏膜、皮肤和脂肪组织等。这种方法具有较好的生物相容性和免疫性，但可能导致高吸收率、液化坏死和供体区瘢痕收缩。异体组织移植可以避免自体移植的供体部位损伤，但需要进行免疫抑制治疗。人工材料包括生物可降解聚合物、硅胶、聚乳酸等，但可能会出现感染、易于降解、假体脱位等并发症。因此，开发更安全、更有效的脂肪再生手段非常重要。
近年来，间充质干细胞结合组织工程技术进行组织再生已成为研究热点。人脂肪间充质干细胞是一种极具吸引力的成体干细胞来源，具有自我更新和多向分化潜能，且来源广泛易于获取，在颌面部缺损再生修复中具有重要的应用价值和临床转化潜能。在脂肪细胞分化的早期阶段，间充质干细胞被诱导向前脂肪细胞分化。在这个过程中，一些转录因子如C/EBPβ和C/EBPδ会被激活，它们可以调控前脂肪细胞的增殖和分化。随着脂肪细胞的成熟，间充质干细胞开始表达PPARγ和C/EBPα等脂肪细胞特异性转录因子，这些转录因子可以调控脂肪酸的合成和存储，同时促进脂肪细胞的成熟和功能发挥。因此，间充质干细胞在脂肪细胞分化过程中发挥着至关重要的作用。
此外，脂肪细胞分化及其调控失常与肥胖症、2型糖尿病、脂肪肝、高脂血症及乳腺癌等多种人类疾病密切相关。脂肪细胞分化及其调控机制的研究不但对于探讨这些重大的生命和疾病过程具有重要理论价值，而且对于预防和治疗这些疾病具有生理病理意义，尤其是在细胞和分子水平上筛选针对上述疾病的靶向药物。
核纤层蛋白相关多肽2α（Lamin-associated polypeptide 2 alpha，LAP2α）是核蛋白LAP2家族的成员之一，由于其独特的结构域和核定位具有与其他同种型不同的功能。研究报道了LAP2α在多种生理、病理过程中发挥着关键作用，包括细胞周期、染色质重塑和干细胞命运决定，但目前LAP2α在脂肪生成分化中的作用尚不清楚。
发明内容
本发明提供了一种LAP2α在间充质干细胞成脂向分化过程中的应用，所述应用不包括疾病的治疗和诊断方法。
具体的，所述应用为LAP2α在制备促进间充质干细胞的成脂向分化和/或脂肪组织再生功能的增强剂中的应用。
所述应用为LAP2α基因或LAP2α蛋白的激动剂在筛选或制备预防或治疗软组织缺损和凹陷的相关药物中的应用。
所述应用为LAP2α基因或LAP2α蛋白的抑制剂在筛选或制备预防、缓解或治疗脂肪分化调控异常相关疾病的药物中的应用。所述疾病包括肥胖症、糖尿病、脂肪肝或高脂血症。所述LAP2α基因或LAP2α蛋白的抑制剂选自LAP2α拮抗剂、LAP2α shRNA、LAP2α siRNA。
所述间充质干细胞包括人脂肪来源间充质干细胞。
本发明的有益效果包括：
（1）本发明发现了一个关键的成脂向分化增强因子-LAP2α。LAP2α过表达能够促进间充质干细胞的成脂向分化能力。本发明揭示了LAP2α对人间充质干细胞定向分化的调控作用，并探索了具体的分子生物学机制，一方面为研发小分子化学药物调控干细胞成脂向分化提供全新的作用靶点，另一方面为以干细胞为基础的组织再生技术的临床转化奠定研究基础。
（2）本发明基于LAP2α的新功能，提出LAP2α基因或LAP2α蛋白的激动剂可以用于加速间充质干细胞成脂向分化，以达到促进脂肪再生的目的，在治疗软组织缺损和凹陷方面有着广阔的开发应用前景。LAP2α基因或LAP2α蛋白的抑制剂可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪分化调控异常相关疾病的药物，如肥胖症、糖尿病、脂肪肝及高脂血症等，未来有望实现临床推广，提升患者生活质量，减轻社会经济负担。
附图说明
图1为人脂肪间充质干细胞成脂向分化过程中LAP2α的表达量变化图；其中，A为LAP2α的mRNA表达水平的检测结果图；B为PPARγ的mRNA表达水平的检测结果图；C为C/EBPα的mRNA表达水平的检测结果图；D为LAP2α、PPARγ的蛋白表达水平结果图；
图2为LAP2α促进人脂肪间充质干细胞体外成脂向分化的检测图；其中，A为阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs成脂诱导后油红O染色和定量结果图；B为阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs成脂诱导后成脂关键基因PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平的检测结果图；C为空载对照组和LAP2α过表达组hASCs成脂诱导后油红O染色和定量结果图；D为空载对照组和LAP2α过表达组hASCs成脂诱导后成脂关键基因PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平的检测结果图；
图3为LAP2α促进人脂肪间充质干细胞体内成脂向分化的检测图；其中，A为阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs裸鼠皮下异位成脂的H&E染色结果图；B为阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs裸鼠皮下异位成脂的油红O染色结果图；
图4为LAP2α通过STAT3信号通路调控人脂肪间充质干细胞成脂向分化的结果图；其中，A为阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs的p-STAT3、STAT3和PPARγ的蛋白表达水平和定量结果图；B为STAT3通路激活剂Colivelin（终浓度为500nm）处理的阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs成脂诱导后油红O染色和定量结果图；C为STAT3通路激活剂Colivelin（终浓度为500nm）处理的阴性对照组和LAP2α敲低组hASCs成脂诱导后p-STAT3、STAT3和PPARγ的蛋白表达水平和定量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所述的LAP2α基因为现有技术中已知基因且是唯一的序列，在NCBI的GeneID:7112。
涉及英文缩写的中英文全称如下：
LAP2α（Lamin-associated polypeptide 2 alpha）核纤层蛋白相关多肽2α；
DMEM （Dulbecco's modified eagle medium）Dulbecco改良的Eagle培养基；
PBS （Phosphate Buffered Saline）磷酸盐缓冲盐水；
DEPC （Diethypyrocarbonate）焦碳酸二乙酯；
GAPDH （Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）甘油醛-3-磷酸脱氢酶；
qRT-PCR （Quantitative reverse transcription PCR）逆转录定量聚合酶链式反应；
PVDF （Polyvinylidene fluoride）聚偏二氟乙烯膜；
BCA （Bicinchonininc acid）二辛可宁酸；
hASCs（Human adipose-derived stem cells）人脂肪间充质干细胞；
PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）过氧化物酶体增殖物激活受体γ；
C/EBPα （CCAAT enhancer binding protein alpha）CCAAT增强子结合蛋白α；
STAT3 （Signal transducer and activator of transcription 3）信号转导和转录激活因子3。
实施例1、人脂肪间充质干细胞成脂向分化过程中LAP2α的表达量变化
（一）细胞培养
人脂肪间充质干细胞购于美国ScienCell公司。人脂肪间充质干细胞收集于三名不同的供体，获得北京大学口腔医院伦理委员会的审核批准。增殖培养基成分包含DMEM培养液、10%胎牛血清及1%青链霉素双抗。细胞被接种至10cm培养皿中，在含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，待细胞汇合度达到80%-90%时将细胞传代至六孔板或6cm皿。待细胞汇合至100%左右开始进行成脂诱导。成脂诱导分化培养基试剂盒（赛业生物科技有限公司，HUXMD-90031）中包含A液及B液。A液成分为：基础培养基+胎牛血清+双抗+谷氨酰胺+胰岛素+罗格列酮+***。B液成分为：基础培养基+胎牛血清+双抗+谷氨酰胺+胰岛素。A液与B液交替使用，期间需密切观察细胞状态，若A液诱导过程中出现细胞收缩、死亡的情况，则及时更换B液，直至细胞状态恢复。
（二）细胞总RNA提取
(1) 将六孔板中的培养液吸净，PBS冲洗3次。
(2)向每孔加入1ml Trizol试剂裂解细胞，室温下静置5分钟，反复吹打并转移至1.5ml EP管中，静置5分钟。
(3)每个EP管中加入氯仿200μl，涡旋混合器震荡30秒至呈现粉红色奶昔状，冰上静置3分钟待出现分层。将离心管置于高速离心机中，4℃，12000rpm，离心15分钟。
(4)小心取出EP管，避免震动，静置3分钟，吸出上层水相于新EP管中。
(5)加入等体积异丙醇，上下翻转10下，冰上静置5分钟。将离心管置于高速离心机中，4℃，12000rpm，离心10分钟，底部出现白色沉淀即为RNA。
(6)弃上清，加入1ml75%乙醇。将离心管置于高速离心机中，4℃，7500rpm，离心5分钟，此过程可重复2遍。弃去上清，尽量吸净底部残留液体。
(7)室温下干燥，加入适量DEPC水，轻柔吹打溶解沉淀。测定RNA纯度和浓度。
（三）逆转录合成cDNA
逆转录反应参考Evo M-MLV反转录试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司， AG11706）说明书，在冰上配制反应液并加入200μl EP管中。
逆转录反应体系：5×Evo M-MLV RT Master Mix 2μl；RNA模板500ng；RNase Free水补齐至10μl。
逆转录反应条件：37℃作用15分钟，85℃作用5秒，4℃保持。
（四）实时定量PCR反应
(1) 八连管的每孔内配置一个10μl反应体系，每个样品、每个基因设置三个副孔，反应体系包括SYBR Green 5μl，cDNA 1μl，引物1μl，DEPC水8.5μl，其中引物序列如表1所示。
表1实时定量PCR引物序列
| 引物名 | 引物序列 | 序列表中编号 |
| GAPDH | 正义链（5’-3’）: GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | SEQ ID NO:1 |
| 反义链（5’-3’）: GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG | SEQ ID NO:2 | |
| LAP2α | 正义链（5’-3’）: ACAGTGACAATGAAGAAGGAAAGA | SEQ ID NO:3 |
| 反义链（5’-3’）: AGGAAAAGAAATACCCTGAAAAAA | SEQ ID NO:4 | |
| PPARγ | 正义链（5’-3’）: CGAGACCAACAGCTTCTCCTTCTCG | SEQ ID NO:5 |
| 反义链（5’-3’）: TTTCAGAAATGCCTTGCAGTCC | SEQ ID NO:6 | |
| C/EBPα | 正义链（5’-3’）: CGGCTTATCCTAAATACTAGAGTTGCCG | SEQ ID NO:7 |
| 反义链（5’-3’）: GGACTTGGTGCGTCTAAGATGA | SEQ ID NO:8 |
(2) PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃变性30秒，60℃退火延伸1分钟，变性、退火及延伸共40循环。
(3) 反应结束后，以GAPDH表达水平为内参，确定各基因Ct值，采用2-ΔΔCt法计算被测基因相对表达水平。
（五）Western blot实验
(1) 收取细胞：每组加入适量含有2%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上30分钟使细胞充***解，用塑料刮刀将细胞快速刮下，将混合液转入1.5ml EP管中。
(2) 4℃，12000rpm，离心30分钟，得到的上清液即为细胞总蛋白裂解液，转移至新EP管中。
(3) 使用BCA定量检测试剂盒（Thermo公司）测定总蛋白浓度，根据各样品蛋白浓度计算25-30μg蛋白量对应的蛋白体积，根据计算所得蛋白体积适当配置不同体积体系的蛋白样品，99℃煮5分钟。
(4) 根据目的蛋白分子量制备合适浓度的分离胶及浓缩胶，加入蛋白样品，室温下以80V恒压电泳，当蛋白条带跑出浓缩胶进入分离胶后改为120V，直至溴酚蓝完全跑出分离胶。
(5) 在转膜夹板上，从阴极到阳极依次放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，排净气泡，用夹子固定，放入转膜槽，根据目标蛋白分子量在冰浴条件下以100 V恒压转膜1.5-3小时。
(6) 转膜结束后小心取出PVDF膜，放入5%脱脂牛奶中，置于摇床上室温封闭1-2小时。
(7) 按照抗体（PPARγ抗体购自Cell Signaling Technology公司, #2435S；LAP2α抗体购自Abcam公司，#ab5162；GADPH抗体购自Proteintech公司，#60004）说明书使用抗体稀释液稀释一抗，覆盖至膜上，4℃孵育过夜。
(8) 吸净一抗，TBST缓冲液清洗膜三次，每次5分钟，孵育二抗，置于摇床上室温孵育1小时。
(9) 配置发光液，避光保存，将发光液均匀滴加在膜的蛋白侧，曝光拍照。
（六）实验结果
如图1所示，本发明实施例1提供的人脂肪间充质干细胞在成脂诱导的0、7、10、14天LAP2α及成脂相关指标表达上升。具体的，qRT-PCR结果显示LAP2α的表达水平在成脂诱导后7天呈上升趋势，10天时出现小幅下降，但整体呈上升趋势（图1中A）；成脂相关基因PPARγ（图1中B）和C/EBPα（图1中C）的表达水平从成脂诱导后开始逐步上升。Western blot结果显示PPARγ蛋白表达水平随时间变化明显升高，LAP2α蛋白表达水平在诱导后的第10、14天略有升高趋势（图1中D）。
实施例2、抑制或过表达LAP2α对人脂肪间充质干细胞体外成脂向分化的影响
（一）慢病毒转染
(1) 针对LAP2α设计了两条不同的敲低序列（表2）。敲低（shLAP2α-1、shLAP2α-2）及阴性对照组（shNC）慢病毒购自上海吉玛制药技术有限公司。LAP2α过表达（FLAG-LAP2α）及空载对照组（Vector）慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。所有的慢病毒载体均含有嘌呤霉素抗性基因及绿色荧光蛋白基因。
(2) 在转染实验前首先进行预实验探索慢病毒的最佳转染条件及转染复数（multiplicity of infection，MOI），据此加入病毒悬液后再加入终浓度为5μg/ml聚凝胺（polybrene）来增强转染效率。
(3) 转染24小时后，更换增殖培养基。
(4) 72小时后，于荧光显微镜下观察荧光强弱，向培养基中加入5μg/ml的嘌呤霉素3天进行筛选以获得稳定转染细胞。
表2 慢病毒的敲低序列
| 名称 | 序列 | 序列表中编号 |
| shLAP2α-1 | GTCTGTATAAAGCAGTGTA | SEQ ID NO:9 |
| shLAP2α-2 | GCAGAAACGGCTTCGAAATAT | SEQ ID NO:10 |
| shNC | TTCTCCGAACGTGTCACGT | SEQ ID NO:11 |
（二）油红O染色及定量
(1) 采用与实施例1中相同的方法进行成脂诱导分化。待成脂诱导分化结束后，吸走六孔板中的培养基，用PBS轻柔冲洗3次。
(2)每孔加入2mL 4%中性甲醛溶液，固定30分钟。吸走中性甲醛溶液，用PBS冲洗3次。
(3)称取油红O干粉0.5g，溶于100ml 100%异丙醇，充分溶解后得到油红O贮存液，4℃避光保存。取油红O贮存液，按照贮存液：蒸馏水=3:2的比例稀释，用中性滤纸过滤后得到油红O染料工作液。
(4) 每孔中加入1mL油红O染料工作液完全覆盖细胞，染色15分钟。随时将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果，染出脂滴即可吸去染液并进行镜下拍照。
(5) 在每孔中加入1ml 100%异丙醇，轻摇溶解。每孔吸取100μL到96孔板中（可设置3个副孔），以100%异丙醇为空白对照，于酶标仪500nm波长下测定吸光光度值，进行油红O染色定量分析。
（三）实时定量PCR反应
实验方法同实施例1。
（四）实验结果
使用LAP2α敲低慢病毒（shLAP2α-1，shLAP2α-2）和阴性对照慢病毒（shNC）转染hASCs，将转染后的hASCs分别在增殖培养基（PM）和成脂诱导培养基（AM）中培养，14天后进行油红O染色及定量。如图2中A所示，LAP2α敲低组（shLAP2α-1，shLAP2α-2）较对照组（shNC）形成的脂滴数目明显减少，对应定量结果显示敲低组较对照组的油红O定量降低。如图2中B所示，与对照组（shNC）相比，LAP2α敲低组（shLAP2α-1，shLAP2α-2）的成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平显著降低。
将LAP2α过表达组细胞（LAP2α）与空载对照组细胞（Vector）分别行PM和AM培养14天后，进行油红O染色和定量分析。如图2中C所示，LAP2α过表达组较对照组形成的脂滴数目明显增多，对应定量结果显示经成脂诱导后LAP2α过表达组的定量结果明显高于对照组。如图2中D所示，与对照组相比，LAP2α过表达组的成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平显著升高。
实施例3、体内实验检测LAP2α敲低对人脂肪间充质干细胞体内成脂向分化的作用
（一）裸鼠皮下成脂实验
动物实验经由北京大学生物医学伦理委员会审查批准，全程接受该委员会监督。BALB/c裸鼠（6周龄，雌性）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
(1) 将慢病毒转染后的hASCs分为三组（shNC、shLAP2α-1、shLAP2α-2）培养于10cm皿中，体外成脂诱导7天后消化离心，制备成细胞悬液。
(2) 将胶原蛋白海绵膜裁剪成合适大小（8mm*8mm*2mm），完全培养基润湿后分别放入1.5ml细胞冻存管，并接种适量细胞（1*106个）。置于37℃恒温摇床中轻摇1小时，使细胞充分吸附于胶原蛋白膜上，再于1000rpm转速下离心5分钟，得到细胞支架混合物用于后续动物体内实验。
(3) 全部手术操作在SPF级动物手术室中进行，将BALB/c裸鼠麻醉，碘伏消毒，于背部中线切开，向皮下两侧充分钝性分离出植入腔。将细胞支架混合物分别植入裸鼠背部两个独立的位置。植入后严密对位缝合。
(4) 6周后取材，将混合支架材料置于组织固定液内，24小时后取出进行后续组织学切片、H&E染色及油红O染色。
（二）实验结果
H&E染色切片（图3中A）可见，对照组（shNC）可见大量脂肪组织形成，脂肪细胞呈空泡样，主体为一个巨大的脂滴，脂滴外包裹着一薄层细胞质，细胞核被推挤到一侧；LAP2α敲低组（shLAP2α-1、shLAP2α-2）可见少量脂肪组织形成，而大量支架材料剩余。
油红O染色切片（图3中B）可见，脂肪组织被染成红色，对照组（shNC）可见大量脂肪组织阳性染色结构，LAP2α敲低组（shLAP2α-1、shLAP2α-2）见少量阳性染色结构。
实施例4、LAP2α通过STAT3信号通路调控人脂肪间充质干细胞成脂向分化
采用与实施例1中相同的方法进行成脂诱导分化。实验用油红O染色定量及Western blot方法同实施例1-2。所用p-STAT3抗体购自华兴博创基因技术有限公司，#HX18074G；STAT3抗体购自华兴博创基因技术有限公司, #HX19081；GADPH抗体购自Proteintech公司，#60004。
实验结果
Western blot及定量结果（图4中A）显示，经成脂诱导后，阴性对照组（shNC）PPARγ、p-STAT3的表达水平升高，但LAP2α敲低组（shLAP2α-1、shLAP2α-2）的PPARγ、p-STAT3表达水平的升高程度显著减少。
使用STAT3通路激活剂Colivelin（终浓度为500nm）处理LAP2α敲低组细胞及阴性对照组（shNC）细胞，并对其进行成脂诱导14天，油红O染色和定量结果见图4中B。与未处理组相比，对应的Colivelin处理组（shNC+Colivelin、shLAP2α-1+Colivelin）形成的脂滴数目明显增多，Colivelin的处理显著减弱了LAP2α敲低对hASCs脂肪生成的阻滞作用，定量分析结果与染色结果一致。
如图4中C所示，Western blot结果显示Colivelin的处理显著增加了PPARγ、p-STAT3的蛋白表达水平，定量分析结果与染色结果一致。
综上，本发明实施例1-4的实验结果证明LAP2α在间充质干细胞成脂向分化过程中表达量逐渐升高；LAP2α的敲低抑制间充质干细胞成脂向分化，反之亦然；LAP2α的敲低可以抑制STAT3信号通路；LAP2α调控间充质干细胞成脂向分化是依赖于对STAT3信号通路的调控。本发明揭示了LAP2α对人间充质干细胞定向分化的调控作用，并探索了具体的分子生物学机制，一方面为研发小分子化学药物调控干细胞成脂向分化提供全新的作用靶点，另一方面为以干细胞为基础的组织再生技术的临床转化奠定研究基础。
Claims (3)
1.LAP2α增强剂在制备促进间充质干细胞的成脂向分化和/或脂肪组织再生功能的增强剂中的应用，所述应用不包括疾病的治疗和诊断方法。
2.LAP2α抑制剂在制备抑制间充质干细胞的成脂向分化和/或脂肪组织再生功能的抑制剂中的应用，所述应用不包括疾病的治疗和诊断方法。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括人脂肪来源间充质干细胞。
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| "Wnt4 and LAP2alpha as Pacemakers of Thymic Epithelial Senescence";Krisztian Kvell等;《PLOS ONE》;第5卷(第5期);第1-7页 * |
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