CN115404203A - 毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用 - Google Patents

毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毛囊间充质干细胞的制备方法以及由此制备的毛囊间充质干细胞。本发明也公开了所述毛囊间充质干细胞治疗骨质疏松或骨量减少疾病药物中的医药应用。

Description

毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用
技术领域
本申请涉及毛囊间充质干细胞的制备方法及毛囊间充质干细胞的医药应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类存在于分化组织中的未分化的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可诱导分化为软骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等，是再生医学理想的种子细胞来源。间充质干细胞还具有强大的旁分泌能力，分泌的多种生长因子和细胞因子可促进血管生成和创伤修复。目前已从骨髓、毛囊、脂肪、胰腺、骨膜、滑膜、骨骼肌、皮肤、脐带血等组织中分离出来具有自我更新和多向分化能力的间充质干细胞。
人毛囊间充质干细胞位于毛囊毛球部中间的毛***内，作为一类来源于毛囊、具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，人毛囊间充质干细胞不仅在毛囊发生、自我更新和周期形成中扮演重要角色，作为重要的干细胞来源还具有来源丰富、获取方便、易于扩增、免疫原性低、伦理争议少等优势，是血管组织工程、神经再生和毛囊重建的种子细胞，具有重要的临床治疗意义。为了获得质量和数量均满足临床治疗需要的毛囊间充质干细胞，分离和培养方法的选择十分重要，不同的分离和培养方法会导致细胞的分离成功率、增殖和分化能力以及临床治疗效果产生较大差异，因此，寻找到一种具有较好分离成功率、增殖和分化能力以及治疗效果的毛囊间充质干细胞的制备方法是必须要解决的问题。
骨质疏松，即骨质疏松症(osteoporosis)，是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(Ⅰ型)、老年性骨质疏松症(Ⅱ型)和特发性骨质疏松三种；继发性骨质疏松则是由于各种全身性或内分泌代谢性疾病引起的骨组织量减少。其中，绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5～10年内；老年性骨质疏松症一般指老人70岁后发生的骨质疏松；而特发性骨质疏松主要发生在青少年。骨质疏松的严重后果为发生骨质疏松性骨折(脆性骨折)，即在受到轻微创伤时或日常活动中即可发生的骨折，好发部位为脊柱、髋部和前臂。发生骨折会导致骨质疏松症患者的病残率和死亡率明显增加。因此，寻找到一个有效治疗骨质疏松症的方法极为重要。
发明内容
本发明内容之一是一种制备毛囊间充质干细胞的方法，该制备方法包括：
1)获得毛囊组织，优选来自人的毛囊组织；
2)由毛囊组织获得毛囊间充质干细胞；和
3)于培养基中对所得毛囊间充质干细胞进行培养。
其中，步骤2)可以采用酶解法由毛囊组织分离获得毛囊间充质干细胞，所用酶解液可包含胶原酶，中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)和氯化钙。
其中，所述培养基可包含氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子、微量元素、胎牛血清和抗生素。
或选地，本发明方法还可以包括步骤4)：对经培养的毛囊间充质干细胞进行传代。
优选实施方式之一中，所述培养基为ScienCell 7501间充质干细胞培养基。
优选实施方式之一中，酶解液可包含胶原酶IV，中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)和氯化钙。
本发明的内容还包括用本发明方法获得的毛囊间充质干细胞。
本发明的内容也包括所述毛囊间充质干细胞在制备治疗骨质疏松和骨量减少疾病药物中的应用；优选地，所述骨质疏松为原发性骨质疏松；更优选地，所述骨质疏松为中老年骨质疏松或绝经后骨质疏松。
优选实施方式之一中，所述药物为液体剂型，优选静脉给药剂型。
本发明的内容也包括一种治疗骨质疏松或骨量减少疾病的方法：包括对患有骨质疏松或骨量减少疾病的患者施用所述毛囊间充质干细胞的步骤。优选地，所述骨质疏松为原发性骨质疏松；更优选地，所述骨质疏松为中老年骨质疏松或绝经后骨质疏松。
优选实施方式之一中，所述施用方式为静脉给药，优选静脉滴注或静脉注射。
附图说明
图1显示了实施例1中本发明制备的毛囊间充质干细胞不同代次细胞的扩增倍数结果图。
图2显示了实施例1中本发明制备的毛囊间充质干细胞不同代次细胞总量结果图。
图3显示了实施例2中不同培养基培养的毛囊间充质干细胞调节Th淋巴细胞亚群结果图。
图4显示了实施例2中不同培养基培养的毛囊间充质干细胞调节Treg淋巴细胞亚群结果图。
图5显示了实施例4中人源毛囊间充质干细胞延缓早衰小鼠SAMP8增龄性骨流失的情况。其中，分图A、B、C、D、E分别显示了胫骨近端松质骨的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隙以及形态的变化情况。
具体实施方案
在本说明书中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本说明书中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方案以及优选实施方案可以相互组合形成新的技术方案。
在本说明书中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。
在本说明书中，如果没有特别的说明，所述数值或数值范围不论是否带有前行词“约”均涵盖相关领域技术人员能够理解的与该数值或数值范围等同的约略范围，例如该数值或端值±10％的范围，亦可是±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％的范围。
本发明提供了一种制备毛囊间充质干细胞的方法，该制备方法包括：
1)获得毛囊组织，优选来自人的毛囊组织；
2)由毛囊组织获得毛囊间充质干细胞；和
3)于培养基中对所得毛囊间充质干细胞进行培养。
或选地，本发明方法还可以包括步骤4)：对经培养的毛囊间充质干细胞进行传代。
一些实施方式中，步骤1)获得毛囊组织包括提取完整毛囊，即去除包裹着毛囊的皮肤组织，剥离出完整的毛囊组织。举例来说，具体的步骤可以包括：用清洗液润洗存储于组织储存液中的包裹着毛囊的皮肤组织，采用眼科镊、手术刀等工具剥离出完整的毛囊组织，存放于新鲜组织储存液中。或者，完整毛囊的提取还可以通过毛囊提取机直接获得。
一些实施方式中，步骤2)由毛囊组织获得毛囊间充质干细胞包括采用酶解法或组织贴壁法，所得毛囊间充质干细胞亦称原代毛囊间充质干细胞。其中，酶解法是利用酶解液酶解毛囊组织使其疏松利于干细胞爬出。举例来说，具体步骤可包括加入酶解液酶解毛囊组织，置于适宜条件下酶解。组织贴壁法主要通过贴壁培养使干细胞从毛囊组织中爬出。举例来说，具体步骤可包括体式显微镜下使用针头在毛囊外毛根鞘位置做切口，等待毛囊组织完全贴壁后加入培养基，于适宜条件下静置培养等待毛囊组织周围细胞爬出。
一些实施方式中，步骤3)中原代细胞的培养包括用培养基重悬原代毛囊间充质干细胞，接种于培养容器中，置于适宜条件下培养。
一些实施方式中，步骤4)中的细胞传代包括加入消化酶从器壁上消化贴壁的细胞，终止消化后，收获细胞，加入培养基重悬，接种于培养容器中，置于适宜条件下培养。
一些实施方式中，在步骤3)、步骤4)中，所述培养基包含氨基酸，维生素，有机化合物，无机化合物，激素，生长因子，微量元素，胎牛血清和抗生素。所述培养基可以自己制备获得也可以通过商业途径购买获得。
一些实施方式中，所述培养基中胎牛血清体积百分比约为5-10％，优选约5％。
一些实施方式中，所述抗生素为庆大霉素、青霉素、链霉素或其组合。
一些实施方式中，所述抗生素若为庆大霉素，则其浓度约为50-100U/mL，优选约50U/mL；所述抗生素若为青霉素则其浓度约为100-150U/mL，优选约100U/mL；或所述抗生素若为链霉素则其浓度约为0.10-0.15mg/mL，优选约0.10mg/mL。
一些实施方式中，在步骤3)、步骤4)中，所述培养基为ScienCell 7501间充质干细胞培养基(购买自ScienCell Research Laboratories)。
一些实施方式中，在所述步骤2)采用酶解法时使用的酶解液包含胶原酶、中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)和氯化钙。
一些实施方式中，所述胶原酶可以是胶原酶Ⅰ或胶原酶Ⅳ，优选胶原酶Ⅳ。
一些实施方式中，胶原酶的浓度约为0.1-5mg/mL，优选约1mg/mL。
一些实施方式中，所述中性蛋白酶(DispaseⅡ)浓度约为1-4mg/mL，优选约2mg/mL。
一些实施方式中，所述氯化钙浓度约为5mM。
一些实施方式中，在所述步骤2)采用酶解法时酶解时间约为1-3.5小时，优选约3小时。
一些实施方式中，酶解温度为约37℃。
一些实施方式中，当步骤1)获得毛囊组织过程中用到组织储存液时，所述组织储存液可以是含有抗生素和胎牛血清的基础培养基，例如补加有抗生素和胎牛血清的DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F12)。一些实施方式中，所述抗生素选自庆大霉素、青霉素、链霉素或其组合。一些实施方式中，组织储存液若包含庆大霉素则其浓度约为50-100U/mL，优选约50U/mL；所述组织储存液若包含青霉素则其浓度约为100-150U/mL，优选约100U/mL，所述组织储存液若包含链霉素则其浓度约为0.10-0.15mg/mL，优选约0.10mg/mL。一些实施方式中，所述胎牛血清体积百分比约为5％-10％，优选约10％。
一些实施方式中，制备方法中用于清洗组织或细胞的清洗液可以是基础培养基或磷酸盐缓冲液，优选为含有抗生素的基础培养基和磷酸盐缓冲液。举例来说，抗生素可以选自庆大霉素、青霉素、链霉素或其组合。一些实施方式中，所述清洗液若包含庆大霉素，则其浓度约为50-100U/mL，优选约50U/mL；所述清洗液若包含青霉素则其浓度约为100-150U/mL，优选约100U/mL；或所述清洗液若包含链霉素则其浓度约为0.10-0.15mg/mL，优选约0.10mg/mL。
一些实施方式中，用于贴壁细胞消化的消化酶可以是胰蛋白酶或稳定型胰蛋白酶替代酶，优选稳定型胰蛋白酶替代酶(例如TrypLETM Express Enzyme(1×)，nophenolred)。
一些实施方式中，在所述步骤3)和4)中，可以在5％CO2，37℃条件下进行原代细胞培养和传代培养。
本发明还提供用本发明方法制得的毛囊间充质干细胞。本发明所得毛囊间充质干细胞具有增强的细胞增殖能力强和增强的免疫调节能力。
本发明还包括所述毛囊间充质干细胞在制备治疗骨质疏松和骨量减少疾病药物中的应用；优选地，所述骨质疏松为原发性骨质疏松；更优选地，所述骨质疏松为中老年骨质疏松或绝经后骨质疏松。
一些实施方式中，所述药物剂型为液体剂型，优选静脉给药剂型。
本发明的内容也包括一种治疗骨质疏松或骨量减少疾病的方法：包括对患有骨质疏松或骨量减少疾病的患者施用所述毛囊间充质干细胞的步骤。优选地，所述骨质疏松为原发性骨质疏松；更优选地，所述骨质疏松为中老年骨质疏松或绝经后骨质疏松。
一些实施方式中，所述施用方式为静脉给药，优选静脉滴注或静脉注射。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。应当理解，提供这些实施例只是为了起说明作用，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1：人源毛囊间充质干细胞的制备
材料
1)酶解液配制：
准确称量0.1g胶原酶Ⅳ溶解于5mL的DMEM/F12基础培养基中，待胶原酶Ⅳ完全溶解后上下颠倒混匀，0.22μm过滤器过滤，得到20mg/mL胶原酶Ⅳ储存液；准确称量0.1g中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)溶解于50mM的羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)中，上下颠倒混匀，待中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)完全溶解后，0.22μm过滤器过滤，得到40mg/mL DispaseⅡ储存液；准确称量0.11g氯化钙，溶解于2mL的无菌水中，上下颠倒混匀，待氯化钙完全溶解后，0.22μm过滤器过滤，得到500mM氯化钙储存液。
分别取上述配制好的20mg/mL胶原酶Ⅳ储存液0.05mL，40mg/mL DispaseⅡ储存液0.05mL和500mM氯化钙储存液0.01mL与0.89mL平衡盐溶液(Hank'sBalanced SaltSolution(HBSS)混匀，由此制得含1mg/mL胶原酶Ⅳ、2mg/mL DispaseⅡ和5mM氯化钙的酶解液。
2)配制清洗液：在DMEM/F12基础培养基中配制含50U/mL的庆大霉素(购自华中药业股份有限公司)和10％胎牛血清的清洗液。
3)配制组织储存液：在DMEM/F12基础培养基中配制含50U/mL的庆大霉素(购自华中药业股份有限公司)和10％胎牛血清的组织储存液。
方法：
1)完整毛囊的提取：
将包裹着人毛囊的头皮组织放入装有10mL清洗液的培养皿中，润洗两次，将润洗后的头皮组织浸泡于组织储存液中，使用弯头眼科镊，辅助手术刀切去皮肤表皮组织，左手用弯头眼科镊横向夹住皮肤组织，右手使用显微镊小心分离包裹着毛囊的皮肤组织。剥离的毛囊会携带少许部分皮肤***，体视显微镜下使用显微镊小心分离毛囊组织周围的***。将剥离出的完整毛囊组织放置于含组织储存液的培养皿中。
2)原代细胞获取：
按照步骤1)获得完整毛囊组织后，使用显微镊小心将毛囊组织放置在EP管底部，使用移液枪尽量吸去毛囊组织携带的组织储存液。按每根毛囊8μL量加入酶解液，37℃，5％CO2培养箱静置3小时，每隔1小时小心轻弹管底，轻轻混匀。酶解3小时后，镜下可见毛囊的外毛根鞘层已完全酶解，毛干部分不能完全酶解。使用100-1000μL移液枪轻柔吹打30次，将酶解液完全混合，吸取全部酶解所得细胞悬液。
3)原代细胞培养：
在培养瓶中加入酶解后细胞悬液，再加入ScienCell 7501间充质干细胞培养基(购买自ScienCell Research Laboratories)重悬。将培养瓶放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。于第五天和第九天更换新鲜培养基继续培养。待细胞融合度达到90％或以上，即可收获或传代。
4)细胞传代：
将通过以上步骤制备获得的毛囊间充质干细胞进行传代培养，每代以5.0×103个细胞/cm2的密度接种到内含ScienCell 7501间充质干细胞培养基(购买自ScienCellResearch Laboratories)的T75培养瓶中，观察培养瓶内细胞密度达90％以上，弃去培养基后，用清洗液清洗两次，弃去清洗液。向培养瓶底部的细胞沉淀加入3mL稳定型胰蛋白酶替代酶(TrypLETM Express Enzyme(1×)，no phenol red)，置于室温静置消化3分钟。使用10mL移液管向培养瓶中加入6mL PBS来稀释酶液，终止消化，将上清取出置于15mL离心管中，再加入10mL PBS润洗瓶底1次，同润洗液加入该离心管中，1500r/min，离心5分钟，弃去上清，加入1mLScienCell 7501间充质干细胞培养基重悬，采用AO/PI(AO(AcridineOrange)吖啶橙，PI(Propidium Iodide)碘化丙啶)双染细胞凋亡检测试剂盒(DNA探针双染细胞核方法，购买自上海睿钰生物科技有限公司)检测每代收获的细胞数量，计算每代的扩增倍数，实验结果见图1和图2。
实验结论：本发明制备方法制得的毛囊间充质干细胞在P3代后均可收获3×108个的细胞总量，满足生产需求。P1-P3代，细胞扩增倍数在10倍以上，P4-P7代，扩增倍数在5倍以上，显示出很强的细胞增殖能力。
实施例2：不同培养基培养的人源毛囊间充质干细胞对免疫功能的调节作用比较
按照实施例1所述，分别采用人胚胎干细胞完全培养基(购买自赛业生物科技有限公司)，羊水培养基(购买自广州拜迪生物医药有限公司)代替ScienCell 7501间充质干细胞培养基(购买自ScienCell Research Laboratories)来制备人源毛囊间充质干细胞。
根据以下实验方法比较不同培养基培养的人源毛囊间充质干细胞对免疫功能的调节作用。
1)毛囊间充质干细胞调节辅助性T细胞(Th淋巴细胞亚群)作用
实验方法：不同培养基培养获得的毛囊间充质干细胞分别以细胞浓度1×105/mL/孔铺于十二孔板内，贴壁培养24小时后，再每孔接种5×105个外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，以使孔内的毛囊间充质干细胞和外周血单个核细胞数量比例为1:5，进行共同培养，作为试验组。再单独培养外周血单个核细胞，接种的细胞数量为5×105个/孔，作为对照组。试验组和对照组每孔均加入植物凝集素(Phytohemagglutinin，PHA)，置于5％CO2，37℃培养箱培养67个小时，再每孔加入蛋白转运抑制剂(Protein Transport Inhibitor，购买自BD GolgiStopTM)和离子霉素(Ionomycin)，继续在培养箱中培养5小时。收集试验组和对照组的外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测和Th1细胞相关的细胞因子(CD4+和IFN-γ+)，以及和Th17细胞相关的细胞因子(CD4+和IL-17+)，结果见表1和图3。
表1不同培养基培养的毛囊间充质干细胞调节Th淋巴细胞亚群结果
培养基种类 ScienCell 7501培养基 完全培养基(赛业生物) 羊水培养基(拜迪生物)
Th1抑制率 -95.8％ -88.76％ -79.97％
Th17抑制率 -84％ -73％ -22％
实验结论：毛囊间充质干细胞能有效抑制促炎性淋巴细胞亚群Th1和Th17增殖，且不同培养基培养的毛囊间充质干细胞作用效果具有显著差异，其中以ScienCell 7501间充质干细胞培养基培养的毛囊间充质干细胞抑制效果最好。
2)毛囊间充质干细胞调节调节性T细胞(Regulatory cell，简称Treg)的作用
实验方法：不同培养基培养获得的毛囊间充质干细胞分别以细胞浓度1×105/mL/孔铺于十二孔板内，贴壁培养24小时后，再每孔接种5×105个外周血单个核细胞，以使孔内的毛囊间充质干细胞和外周血单个核细胞数量比例为1:5，进行共同培养，作为试验组。再单独培养外周血单个核细胞，接种的细胞数量为5×105个/孔，作为对照组。置于5％CO2，37℃培养箱培养72个小时。收集试验组和对照组的外周血单个核细胞，根据Treg检测试剂盒(购买自Biolegend)操作方法对细胞进行染色，采用流式细胞仪对Treg细胞相关细胞因子(CD4+、CD25+和FoxP3+)进行检测，结果见表2和图4。
表2不同培养基培养的毛囊间充质干细胞调节Treg淋巴细胞亚群结果
培养基种类 ScienCell 7501培养基 完全培养基(赛业生物) 羊水培养基(拜迪生物)
Treg促进率 191.78％ 94.98％ 75.34％
实验结论：毛囊间充质干细胞能够促进Treg淋巴细胞亚群的增殖功能，且不同培养基培养的毛囊间充质干细胞作用效果具有显著差异，其中以ScienCell 7501间充质干细胞培养基培养的毛囊间充质干细胞的促进效果最好。
实施例3：酶解液配方及酶解时间对分离人源毛囊间充质干细胞的影响
如实施例1所述制备人源毛囊间充质干细胞，不同的是分别用以下配方1、配方2和配方3的酶解液代替实施例1中的酶解液酶解毛囊组织。
酶解液配方1：准确称量0.1克胶原酶Ⅰ溶解于5mL的DMEM/F12基础培养基中，待胶原酶Ⅰ完全溶解后上下颠倒混匀，0.22μm过滤器过滤，得到20mg/mL胶原酶Ⅰ储存液，加入95mL平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)稀释，得到1mg/mL的胶原酶Ⅰ酶解液。
酶解液配方2：准确称量0.1g胶原酶Ⅳ溶解于5毫升的DMEM/F12基础培养基中，待胶原酶Ⅳ完全溶解后上下颠倒混匀，0.22μm过滤器过滤，得到20mg/mL胶原酶Ⅳ储存液，加入95mL平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)稀释，得到1mg/mL的胶原酶Ⅳ酶解液。
酶解液配方3：按实施例1中所述配制酶解液，不同的是将其中的胶原酶Ⅳ替换成胶原酶Ⅰ，由此获得含1mg/mL胶原酶Ⅰ、2mg/mL DispaseⅡ和5mM氯化钙的酶解液。
酶解1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时后光学显微镜下观察毛囊组织的酶解效果。
镜下结果显示，酶解1小时已可见内毛根鞘和外毛根鞘与毛干分离，酶解3小时后，内毛根鞘和外毛根鞘与毛干明显分离，且经过酶解后内毛根鞘和外毛根鞘经过吹打能分散成单个细胞。时间越长酶解越充分，但酶解3.5小时镜检与3小时差异不大。取酶解3小时制得的毛囊间充质干细胞在ScienCell 7501间充质干细胞培养基中培养，显微镜下观察生长状态并计数最终收获的细胞数量，结果见表3。
表3不同酶解液酶解毛囊组织最终收获的毛囊间充质干细胞数量结果
酶解液配方 原代毛囊间充质干细胞培养天数 收获细胞数量
实施例1酶解液配方 12天 175000
酶解液配方1 12天 55700
酶解液配方2 12天 98600
酶解液配方3 12天 91500
结论：胶原酶与中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)组合的效果显著优于胶原酶单用；且胶原酶Ⅳ与中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)组合的效果优于胶原酶Ⅰ与中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)组合。相对而言，实施例1的酶解液配方酶解后细胞增殖迅速，相同培养时间收获的细胞数量最多。
实施例4：人源毛囊间充质干细胞制剂治疗原发性骨质疏松及骨量减少
发明人选用20周龄早衰小鼠SAMP8作为研究对象，通过尾静脉注射低剂量(1×105个/只)和高剂量(4×105个/只)的人源毛囊间充质干细胞(实施例1制得)，共注射3次，两次注射之间间隔1周，以此探究人源毛囊间充质干细胞对延缓早衰小鼠SAMP8增龄性骨流失的效果。SAMP8小鼠为一类常用的快速老化动物模型，由于可在早期自发发生骨量减少乃至骨质疏松而被用于老龄相关原发性骨质疏松和骨量减少的研究。
具体地，分为5个组进行试验：1、正常对照组，SAMR1小鼠(12只)，与早衰小鼠SAMP8具有相同遗传背景，但不具备早衰表型；2、空白组，早衰小鼠SAMP8(12只)，不做任何处理；3、溶媒组，早衰小鼠SAMP8(12只)，接受同等剂量的生理盐水(细胞重悬溶剂)尾静脉注射，共注射3次，每两次注射之间间隔1周；4、毛囊间充质干细胞低剂量组，早衰小鼠SAMP8(12只)接受人源毛囊间充质干细胞(1×105个/只)尾静脉注射，共注射3次，每两次注射之间间隔1周；5、毛囊间充质干细胞高剂量组，早衰小鼠SAMP8(12只)接受人源毛囊间充质干细胞(4×105个/只)尾静脉注射，共注射3次，每两次注射之间间隔1周。
最后1次注射细胞的2个月后处死小鼠，分离胫骨，借助微计算机断层扫描技术(Micro-CT)检测外源干细胞对SAMP8小鼠胫骨近端松质骨增龄性骨流失的改善作用，具体检测了骨体积分数和其它骨微结构参数(如骨小梁厚度、数量和间隙)的改善情况及其3D图像，统计结果和3D图像见附图5。
由附图5可知，高/低剂量的毛囊间充质干细胞可以不同程度地改善小鼠胫骨近端松质骨骨体积分数(附图5A)和其它骨微结构参数，包括骨小梁厚度(附图5B)、骨小梁数量(附图5C)和骨小梁间隙(附图5D)；由附图5E可知，3D图像也显示了相同的趋势，即注射高/低剂量的毛囊间充质干细胞可以有效改善早衰小鼠的骨流失现象。早衰小鼠SAMP8中的结果显示，本发明制得的人源毛囊间充质干细胞能够有效延缓增龄性骨流失。
尽管本文描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims (10)

1.一种制备毛囊间充质干细胞的方法，该制备方法包括：
1)获得毛囊组织，优选来自人的毛囊组织；
2)由毛囊组织获得毛囊间充质干细胞；和
3)于培养基中对所得毛囊间充质干细胞进行培养；
其中，步骤2)采用酶解法由毛囊组织分离获得毛囊间充质干细胞，所用的酶解液包含胶原酶，中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)和氯化钙；或者/且
所述培养基包含氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子、微量元素、胎牛血清和抗生素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤4)：对经培养的毛囊间充质干细胞进行传代。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胎牛血清体积百分比为5-10％，优选5％；
或者/并且，所述抗生素为庆大霉素、青霉素、链霉素或其组合；
优选地，所述庆大霉素浓度为50-100U/mL，优选50U/mL；所述青霉素浓度为100-150U/mL，优选100U/mL；或者/并且，所述链霉素浓度为0.10-0.15mg/mL，优选0.10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基为ScienCell 7501间充质干细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，还具有一项或多项以下所述的特征：
所述胶原酶为胶原酶Ⅰ或胶原酶Ⅳ，优选胶原酶Ⅳ；
所述胶原酶浓度为0.1-5mg/mL，优选1mg/mL；
所述中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ)浓度为1-4mg/mL，优选2mg/mL；
所述氯化钙浓度为5mM；
酶解法的酶解时间为1-3.5小时，优选3小时；
酶解温度为37℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，毛囊组织包含于组织储存液中，组织储存液为含有抗生素和胎牛血清的基础培养基；
优选地，所述胎牛血清体积百分比为5％-10％，优选10％；
优选地，所述抗生素选自庆大霉素、青霉素、链霉素或其组合；
更优选地，所述庆大霉素浓度为50-100U/mL，优选50U/mL；所述青霉素浓度为100-150U/mL，优选100U/mL；或者/并且，所述链霉素浓度为0.10-0.15mg/mL，优选0.10mg/mL。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)包括用消化酶进行消化，所述消化酶为胰蛋白酶或稳定型胰蛋白酶替代酶，优选稳定型胰蛋白酶替代酶。
8.权利要求1-7任一项所述方法获得的毛囊间充质干细胞。
9.权利要求8所述毛囊间充质干细胞在制备治疗骨质疏松或骨量减少疾病药物中的应用；
优选地，所述药物为液体剂型，优选静脉给药剂型；
优选地，所述骨质疏松为原发性骨质疏松；更优选地，所述骨质疏松为中老年骨质疏松或绝经后骨质疏松。
10.一种治疗骨质疏松或骨量减少疾病的方法；其特征在于，包括对患有骨质疏松或骨量减少疾病的患者施用权利要求8所述毛囊间充质干细胞的步骤；
优选地，所述施用方式为静脉给药，优选静脉滴注或静脉注射；
优选地，所述骨质疏松为原发性骨质疏松；更优选地，所述骨质疏松为中老年骨质疏松或绝经后骨质疏松。
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