CN111214492A - 多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖及成骨分化能力药物上的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖及成骨分化能力药物上的用途。本发明以多能干细胞来源的外泌体为干预手段，围绕与老年性骨质疏松发病密切相关的BMSCs衰老的调控，开展了系列临床前研究。本发明证明了多能干细胞来源的外泌体具有拮抗年龄相关骨质疏松的作用；体外实验表明多能干细胞来源的外泌体通过转运干性基因mRNA，上调内源性Oct4表达，改善BMSCs衰老，促进成骨分化。多能干细胞来源的外泌体有望成为治疗衰老相关疾病的一种新型治疗工具。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，尤其是涉及一种多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖及成骨分化能力药物上的用途。
背景技术
老年性骨质疏松是一种常见的衰老相关性疾病，其主要特点是全身骨量减少和骨组织微结构的改变，导致骨组织脆性增加、骨折风险提升。随着世界人口老龄化问题的不断加剧，老年性骨质疏松的发病率越来越高，成为一个日益严重的公共健康问题。我国已进入快速老龄化阶段，骨质疏松发病率呈逐年上升趋势，给广大老年群体的健康带来了巨大的威胁。现阶段抗骨质疏松治疗主要为抑制骨吸收和促进骨形成两大类药物。其中抑制骨吸收类药物主要有双膦酸盐类(Bisphosphonates)、选择性***受体调节剂、组织蛋白酶K抑制剂、RANKL抑制剂、雷奈酸锶、降血钙素等等；促进骨形成主要有甲状旁腺激素、sclerostin抑制剂等等。虽然有关药物研究发展迅速，但是仍有大量骨质疏松患者无法得到有效的治疗，一项针对 22598例病例的大宗研究报道指出，服用双膦酸盐类的人群股骨颈骨折的发生率仍有3％。因而亟待我们积极探索有效防治骨质疏松的新策略。
应用干细胞防治衰老相关性疾病已取得了令人振奋的成果。近年来，研究表明干细胞分泌的外泌体(exosomes)能够通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，发挥促进组织干细胞增殖分化、促进血管新生等诸多重要作用。Kulkarni等研究发现，将年轻BMSCs来源exosomes与衰老小鼠的造血干细胞共培养后，衰老的造血干细胞发生年轻化并部分恢复其造血功能。Ratajczak等研究报道，胚胎干细胞来源的exosomes可通过其内含的多种活性因子及RNA片段促进造血干细胞的存活，还可通过exosomes传递Nanog、Oct4、Rex-1等多能性因子而逆转造血干细胞回到原始分化状态；Katsman等人实验发现，ESC-Exos可通过选择性地转移mRNA(Oct4、SOX2)到视网膜Müller细胞中，并在基因表达及表观遗传学水平上产生影响，使靶细胞获得多能性。
中国专利CN108653334A公开了负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与在制备逆转或防治全身器官衰老药物或保健品方面的用途。其利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以大大提高其逆转或防治各器官衰老的效果，该专利中记载，ESC-Exos治疗6个月后，骨质疏松状态明显改善，由于骨质疏松的发病机制涉及多种因素和环节，但是上述专利中并没有涉及人多能干细胞外泌体是怎样发挥其作用的。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖及成骨分化能力药物上的用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：提供多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖能力药物上的用途。
本发明第二方面：提供多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs成骨分化能力药物上的用途。
进一步地，所述多能干细胞外泌体在制备促进BMSCs细胞Runx2、OPN、 BMP-2或OCN基因的表达药物上的用途。
进一步地，所述多能干细胞外泌体在制备上调BMSCs细胞中Nanog、Oct4和 Sox2基因表达的药物上的用途。
进一步地，所述多能干细胞外泌体在制备抑制BMSCs中P16、P21等衰老蛋白的表达和促进Oct4等多能性基因表达的药物的用途。
进一步地，所述多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。
本发明第三方面：
提供基于所述多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：
A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
B、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；
C、以所述多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂或活性载体。
进一步地，所述多能干细胞外泌体制备的药剂浓度为1-9×108～1-10×1010particles/ml。
优选地，所述制剂包括口服剂或静脉注射针剂，或直接在组织损伤部位注射剂(如关节腔内注射、骨折处注射等)或喷雾剂。
本发明以多能干细胞中的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)来源的外泌体(exosomes,exos)为干预手段，围绕与老年性骨质疏松发病密切相关的BMSCs 衰老的调控，开展了系列临床前研究：1)动态观察不同月龄SAMP8小鼠BMSCs 衰老表型及干性基因表达的变化；2)明确ESC-Exos对SAMP8小鼠骨质疏松和 BMSCs衰老的治疗作用；3)探讨ESC-Exos通过调控Oct4等干性基因的表达进而影响BMSCs衰老的分子机制。研究结果发现，老年性骨质疏松的发生发展与 BMSCs衰老密切相关，ESC-Exos可改善BMSCs的衰老发挥治疗骨质疏松的效果，且其作用与ESC-Exos传递的干性基因密切相关。这些发现为治疗衰老相关性疾病提供了新思路，对于干细胞再生医学技术的临床转化应用具有十分重要的现实意义。
本发明证明了ESC-Exos具有抗骨质疏松的作用；体外实验表明ESC-Exos通过转运干性基因mRNA，上调内源性Oct4表达，改善BMSCs衰老，促进成骨分化。ESC-Exos有望成为治疗衰老相关疾病的一种新型治疗工具。
附图说明
图1SAMP8小鼠BMSCs鉴定结果(包括图1A、图1B、图1C)；
图1A：SAMP8年轻小鼠骨髓间充质干细胞呈梭形形态。标尺：100μm；
图1B：骨髓间充质干细胞在成骨、成脂或成软骨诱导分化培养基中能分别分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。茜素红染色(标尺：50μm)、油红O染色 (标尺：50μm)和阿辛蓝染色(标尺：200μm)分别证明BMSCs分化为成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞；
图1C：流式细胞技术检测表面标记物(CD44、CD99、CD34和HLA-DR)。
图2：SAMP8小鼠骨质的动态变化(包括图2A、图2B)
图2A：不同月龄SAMP8小鼠股骨Micro-CT扫描结果；
图2B：骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间隙(Tb.Sp)的统计分析结果。n＝3/组。***，P<0.001； **，P<0.01；*，P<0.05.
图3：ESC-Exos改善SAMP8小鼠骨质疏松(包括图3A、图3B、图3C)
图3A：Control组和ESC-Exos组股骨Micro-CT扫描及定量分析结果。骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th) 和骨小梁间隙(Tb.Sp)的统计分析结果。n＝3/组。***，P<0.001；**，P<0.01； *，P<0.05；图3B：Control组和ESC-Exos治疗组股骨H&E染色结果；图3C： Control组和ESC-Exos组股骨Von kossa-Stevenel’s blue染色。
图4：改善BMSCs增殖及成骨分化能力(包括图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G)
图4A：Control组和ESC-Exos治疗组小鼠骨髓间充质干细胞克隆形成实验；
图4B：BMSCs克隆形成实验统计分析结果。n＝3/组。**，P<0.01；
图4C：Ki67免疫荧光染色评估Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs的增殖能力。标尺：50μm；
图4D：Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs细胞Ki67阳性细胞统计结果。 n＝3/组。*，P<0.05；
图4E：Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs碱性磷酸酶染色；
图4F：Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs茜素红染色；
图4G：PCR检测Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs细胞Runx2、OPN、 BMP-2和OCN基因的表达。***，P<0.001；**，P<0.01。
图5：ESC-Exos改善BMSCs的衰老并上调干性基因Oct4的表达(包括图 5A、图5B、图5C、图5D、5E、图5F、图5G)
图5A-B：细胞衰老β-半乳糖苷酶染色结果显示ESC-Exos可以改善BMSCs 衰老。标尺：50μm；**,P<0.01；
图5C：Western blot检测Control组和ESC-Exos治疗组12月龄BMSCs P16、 P21和Oct4蛋白水平；
图5D：P21免疫荧光染色。标尺：50μm；
图5E：γ-H2AX免疫荧光染色。标尺：50μm；
图5F：PCR检测Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs细胞Nanog、Oct4和Sox2基因的表达。***，P<0.001；
图5G：Oct4免疫荧光染色。标尺：50μm。
图6：ESC-Exos处理对BMSCs干性基因的影响(包括图9A、图9B、图9C)
图6A：免疫荧光结构证实DIO标记的ESC-Exos可被BMSCs内吞；
图6B：PCR检测ESC-Exos处理BMSCs后外源性hNanog、hOct4和hSox2 的含量变化。***,P<0.001；
图6C：PCR检测ESC-Exos处理BMSCs后内源性mNanog、mOct4和mSox2 含量的变化。*,P<0.05。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例一、小鼠BMSCs的提取
(1)取不同实验组的SAMP8小鼠，安乐死处理后，75％酒精浸泡消毒，无菌条件下取得小鼠下肢，浸泡在4℃含有5％P/S的DMEM基础培养基中待用；
(2)在超净工作台内，使用无菌器械去除股骨和胫骨上的软组织成分，反复用含5％P/S的DMEM基础培养基冲洗；
(3)用无菌镊子固定股骨和胫骨骨干，用无菌剪刀去除两端干骺断，暴露髓腔；
(4)用5mL注射器吸取MesenCult完全培养基，冲洗髓腔至髓腔成白色状；
(5)200g离心5分钟，弃上清，用MesenCult完全培养基重悬细胞，按合适密度接种于T25培养瓶内；37℃5％CO2培养箱培养72小时，期间不予处理，以免影响细胞贴壁效果；
(6)72小时后，隔日更换MesenCult完全培养基，直至细胞汇合度达到 80％-90％(注意避免细胞生长过密，会加速小鼠BMSCs的衰老)；
(7)细胞消化前准备：PBS和0.25％胰蛋白酶(不含EDTA)需37℃水浴锅预热，DMEM/10％FBS完全培养基和MesenCult完全培养基室温复温备用；
(8)待细胞汇合度达到80％-90％时，去除细胞培养上清，PBS洗涤细胞3次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，轻柔摇晃混匀使得胰蛋白酶与细胞充分接触，将培养瓶置于7℃5％CO2培养箱孵育1分钟，注意避免消化时间过长，以免影响细胞状态；
(9)加入1mL DMEM/10％FBS完全培养基终止消化，吹打细胞，并将其转移至15mL离心管，200g离心5分钟；
(10)去上清，用MesenCult完全培养基重悬细胞，按合适密度接种细胞；
(11)细胞冻存前准备：细胞程序降温盒室温复温，冻存液的配置(1mL体系；700μLFBS+200μL MesenCult完全培养基+100μL DMSO)；
(12)消化细胞，200g离心5分钟，弃去上清，加入1mL冻存液，封口膜封口，作好标记，置于细胞程序降温盒，-80℃过夜，后置于液氮罐内长期冻存。
实施例二、小鼠BMSCs的鉴定
1、小鼠BMSCs的表面标志物流式鉴定
取第3代小鼠BMSCs细胞做流式细胞仪表面标志物鉴定。选取CD44、CD90、 CD31、CD45进行检测。将小鼠BMSCs细胞消化后，200g离心5分钟，弃去上清，PBS洗涤细胞，3％BSA室温封闭细胞30分钟，300g离心5分钟，PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106/mL，取300μL细胞悬液加入至1.5mL EP管中，添加3μL的CD44、CD90、CD31、CD45荧光指标一抗，并设置IgG对照；37℃反应30分钟，PBS洗涤3次，300g离心5分钟，100μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。
2、小鼠BMSCs成骨分化实验
(1)按下表遵循说明书要求配制小鼠BMSCs成骨诱导分化完全培养基：
(2)明胶预包被培养板：于培养板中添加适量体积的0.1％明胶，超净台内放置30分钟以上，弃取明胶液体，晾干后即可用于接种细胞；
(3)待小鼠BMSCs汇合度达到80-90％时，0.25％胰蛋白酶消化细胞计数，被将细胞接种于预先包被明胶的培养板中，37℃5％CO2培养箱培养；
(4)当细胞汇合度达到60-70％时，吸弃细胞培养上清，加入适量37℃预热的成骨诱导分化培养基；
(5)每隔2-3天更换新鲜的成骨诱导分化培养基，诱导期间注意观察细胞形态变化，于不同时间点用于后续的qPCR检测、ALP染色和茜素红染色。
3、小鼠BMSCs成软骨分化实验
(1)按下表遵循说明书要求配制小鼠BMSCs成软骨诱导分化完全培养基：
(2)待小鼠BMSCs汇合度达到80-90％时，0.25％胰蛋白酶消化细胞计数，将4×105个细胞转移至15mL离心管，200g离心5分钟；
(3)弃上清，成软骨诱导分化预混液重悬洗涤细胞，200g离心5分钟；
(4)弃上清，预混液重悬洗涤细胞，200g离心5分钟；
(5)添加0.5mL成软骨诱导分化完全培养基，200g离心5分钟；
(6)弄松15mL离心管，置于37℃5％CO2培养箱培养；每天轻弹15mL离心管；每隔2-3天更换新鲜的成软骨诱导分化培养基；
(7)诱导21-28天后，对软骨小球进行4％PFA室温固定15分钟，石蜡包埋切片；
(8)石蜡切片脱蜡至水：将软骨小球石蜡切片按如下步骤操作，二甲苯I；二甲苯II；100％乙醇；100％乙醇；95％乙醇；90％乙醇；80％乙醇；70％乙醇；双蒸水水洗；
(9)阿利新蓝染色：切片入阿利新蓝染液中染色15分钟，自来水洗涤，双蒸水洗涤；
(10)脱水封片：70％乙醇；80％乙醇；90％乙醇；95％乙醇；100％乙醇；二甲苯I；二甲苯II；中性树脂封片；
(11)显微镜下观察并摄片保存。
4、小鼠BMSCs成脂分化实验
(1)按下表遵循说明书要求配制小鼠BMSCs成脂诱导分化培养基A液
(2)按下表遵循说明书要求配制小鼠BMSCs成脂诱导分化培养基B液
(3)待小鼠BMSCs汇合度达到80-90％时，0.25％胰蛋白酶消化细胞计数，按合适密度接种于6孔板，37℃5％CO2培养箱培养；
(4)待细胞汇合度达到100％时，去除细胞培养上清，加入2mL成脂诱导分化培养基A液；
(5)诱导成脂分化3天后，去除细胞培养上清，加入2mL成脂诱导分化培养基B液；
(6)诱导24小时后，去除细胞培养上清，加入2mL成脂诱导分化培养基A 液；
(7)重复步骤(5)和步骤(6)3-5次后，改用成脂诱导分化培养基B液维持诱导分化，每隔2-3天跟换成脂诱导分化培养基B液；
(8)油红O染色：待成脂分化诱导结束后，弃去细胞培养上清，PBS洗涤2 次，4％PFA室温固定15分钟；弃去PFA，PBS洗涤3次，每次5分钟；加入1mL 油红O染液孵育30分钟；弃去油红O染液，PBS洗涤3次，显微镜下观察并摄片保存。
实施例三、碱性磷酸酶(ALP)染色
(1)取成骨诱导分化结束的细胞，弃去诱导分化培养基，PBS洗涤3次，4％ PFA室温固定15分钟；
(2)PBS洗涤3次，弃PBS，加入BCIP/NBT碱性磷酸酯酶染色工作液，避光孵育，显微镜下动态观察，直至显色至预期效果；
(3)双蒸水洗涤3次，终止显色反应；
(4)显微镜下观察并摄片保存。
实施例四、茜素红染色
(1)取成骨诱导分化结束的细胞，弃去诱导分化培养基，PBS洗涤3次，4％ PFA室温固定15分钟；
(2)弃去PFA，PBS洗涤3次，每次5分钟；
(3)加入适量的茜素红染色工作液3-5分钟；
(4)弃去茜素红染色工作液，PBS洗涤3次，每次5分钟；
(5)显微镜下观察并摄片保存。
实施例五、克隆形成实验
(1)待小鼠BMSCs汇合度达到80-90％时，0.25％胰蛋白酶消化细胞计数，将300个细胞接种于6孔板，使细胞均匀分布于培养板中，37℃5％CO2培养箱培养3周；
(2)弃去细胞培养上清，PBS洗涤3次，4％PFA室温固定15分钟；
(3)弃去PFA，双蒸水洗涤3次，每次5分钟；
(4)结晶紫染色液染色10分钟；双蒸水洗涤3次；
(5)显微镜下观察并摄片保存。
实施例六、外泌体内吞实验
(1)超速离心法提取外泌体，用PBS重悬；按180μL ESC-Exos与20μL DIO (1:50)稀释工作液，混匀后室温孵育3分钟，添加3.8mL的培养基终止反应；
(2)超速离心洗涤去除游离DIO染料；qNano测定外泌体的粒子浓度；
(3)按合适的浓度处理细胞，孵育一定时间后，弃取含有DIO标记ESC-Exos 的培养基，PBS洗涤3次，4％PFA室温固定15分钟；
(4)用PBS按1:500稀释鬼笔环肽，室温避光孵育1小时，PBS洗涤3次，每次5分钟；
(5)Dapi染核工作液孵育5分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟；
(6)荧光显微镜下观察并摄片保存。
实施例七、实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)
(1)细胞RNA的提取：弃去6孔板中的细胞培养上清，PBS洗涤细胞；加入500μL裂解液(Lysis Buffer)，吹打10-15次，使细胞充***解；在上述细胞裂解产物中等体积的无水乙醇，充分混匀；加入离心柱(Spin Column)中，4000g 离心1分钟，弃去液体；在柱子中央加入2μL DNA酶(gDNA Remover)和10μL 双蒸水，室温放置5分钟；加入500μL洗涤液(WashBuffer)到离心柱中，12000 g离心1分钟，弃去液体，将离心柱放回收集管，12000g离心1分钟；将离心柱转移至无RNase的1.5mL EP管中，开盖晾干2分钟；向离心柱中央膜上滴加20μL洗脱液(Elution Buffer)，室温放置2分钟，12000g离心1分钟，将离心液加回至离心柱中央膜上，室温放置3分钟，12000g离心1分钟；将所得RNA转移至冰上放置，并通过Nanodrop测定浓度；
(2)逆转录：在无菌无RNase的PCR管中，加入模板RNA 1μg、oligo(dT)18引物1μL、DEPC水补齐至12μL，65℃孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上；按以下顺序依次加入5×Reaction Buffer 4μL、RiboLockTM RNA酶抑制剂(20 u/μL)1μL、10mM dNTP Mix 2μL、RevertAidTM M-MuLV逆转录酶(200u/μL) 1μL；混匀离心；42℃孵育60分钟；70℃加热5分钟终止反应。
(3)qRT-PCR：按照Roche试剂盒说明书要求，添加10μL SYBGreen Mix试剂、前后向引物各0.5μL(引物序列见下表)、1μL cDNA模板和8μL DEPC水。按照程序设定进行反应，反应的循环数均为40。以2-ΔΔCT展示结果。
各基因PCR引物的序列表
实施例八、股骨microCT扫描
将不同实验组股骨标本置于SkyScan高分辨率活体microCT，进行断层扫描。扫描结束后，使用Nrecon软件(Version 1.5.1.4,Skyscan)对图像进行三维重建。并选择感兴区域(the regions of interest，ROI)，并分析该区域内的骨密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)等参数。
实施例九、骨组织病理切片的制作
(1)对不同实验组SAMP8小鼠麻醉后，行心脏灌流、4％PFA灌注固定，留取股骨标本，净泡***溶液24小时以上，流水冲洗过夜；
(2)配制10％EDTA脱钙液，对骨组织进行脱钙处理2周，每天跟换脱钙液， 2周后流水冲洗过夜；
(3)脱水：50％乙醇2小时、70％乙醇2小时、80％乙醇2小时、90％乙醇2 小时、95％乙醇2小时、100％乙醇2小时、100％乙醇2小时；
(4)透明：二甲苯I15分钟，二甲苯II 15分钟；
(5)浸蜡和包埋：60℃-65℃烘箱内融化石蜡I 3小时，融化石蜡II 3小时；于包埋机内进行组织块包埋；
(6)制片：石蜡切片机切片，厚度为5μm。将切片置于40℃的温水上展片，用载玻片将切片捞起，60℃烘箱内烤片1小时，常温保存。
实施例十、病理切片的HE染色
(1)石蜡切片脱蜡至水：二甲苯I15分钟；二甲苯II 15分钟；100％乙醇5 分钟；100％乙醇5分钟；95％乙醇2分钟；90％乙醇2分钟；80％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；双蒸水2分钟；
(2)苏木素染色：苏木素染液4分钟；自来水洗2分钟；分化液分化20秒；自来水洗2分钟；返蓝液返蓝30秒；自来水洗2分钟；
(3)伊红染色及脱水封片：伊红染液染色90秒；70％乙醇2分钟；80％乙醇 2分钟；90％乙醇2分钟；95％乙醇2分钟；100％乙醇5分钟；二甲苯I15分钟，二甲苯II 15分钟；中性树脂封片；
(4)显微镜下观察并摄片保存。
实施例十一、骨组织硬组织切片的制作与Von kossa-Stevenel’s blue染色
(1)对不同实验组SAMP8小鼠麻醉后，行心脏灌流、4％PFA灌注固定，留取股骨标本，净泡***溶液24小时以上，流水冲洗过夜；
(2)脱水：70％乙醇12小时；75％乙醇12小时；80％乙醇12小时；85％乙醇12小时；90％乙醇12小时；95％乙醇12小时；100％乙醇12小时；100％乙醇12小时；
(3)透明：二甲苯I 2小时，二甲苯II 2小时；
(4)配制硬组织包埋甲液和硬组织包埋乙液，4℃冰箱保存，将股骨先后置于硬组织包埋甲液、乙液浸泡48小时；
(5)在包埋瓶内加入适量新鲜配制的硬组织包埋乙液，用丝线将股骨以合适的位置固定在包埋瓶内；
(6)真空泵内抽真空，条件：2×104Pa，4小时；
(7)37℃水浴锅聚合3天，及时添加双蒸水；
(8)采用Leica硬组织切片机切片，厚度8μm；
(9)通过脱塑剂脱塑，硝酸银染色，紫外灯照射15分钟，硫代硫酸钠冲洗，流水冲洗，Stevenel’s blue复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片；
(10)显微镜下观察并摄片保存。
实施例结果
1、SAMP8小鼠BMSCs的提取与鉴定
年轻SAMP8小鼠骨髓提取的BMSCs，光镜下呈典型的梭形形态(图1A)。三系分化鉴定结果表明，BMSCs在成骨、成脂和成软骨诱导分化培养基条件下，可分别成功被诱导成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，图1B分别是成骨分化后茜素红染色、成脂分化后油红O染色和成软骨分化后阿利新蓝染色结果。流式细胞仪分析结果显示SAMP8小鼠BMSCs表达CD44和CD99细胞表面标志物，CD34 和HLA-DR呈现阴性表达(图1C)。
2、SAMP8小鼠骨质的动态变化
通过对2月、4月、6月、8月、10月和12月龄雄性SAMP8小鼠股骨标本进行microCT扫描，并进行骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁间隙(Tb.Sp)等参数进行分析，观察不同月龄SAMP8 的骨质动态变化。实验结果表明SAMP8小鼠股骨6月龄骨质开始出现变化，相关参数如BMD具有显著性差异，并随着月龄的增加股骨骨质出现明显下降变化(图 2A-B)。SAMP8小鼠BMSCs在6月龄开始出现衰老变化，其增殖能力和成骨分化能力开始降低，故此以6月龄SAMP8小鼠为治疗起始点，旨在观察ESC-Exos能否通过改善BMSCs衰老，改善SAMP8的骨质疏松情况。
3、ESC-Exos显著改善SAMP8小鼠的骨质疏松
通过采用6月龄的SAMP小鼠进行治疗，实验组给予1-10×1010particles干预，对照组给予同等剂量的PBS，治疗周期为6个月。实验结果表明：MicroCT 扫描结果表明：对照组SAMP8小鼠12月龄时出现了明显的骨质疏松表现，而 ESC-Exos治疗6月明显抑制了SAMP8小鼠骨质疏松的表现(图3A)。HE染色和 Von kossa-Stevenel’s blue染色同样证实对照组出现明显骨小梁稀疏的现象(图3 B-C)。
4、ESC-Exos可显著改善BMSCs增殖及成骨分化能力
体内实验结果表明经6个月的ESC-Exos干预治疗可以改善SAMP8小鼠的骨质疏松。进一步通过提取治疗6月后Control组和ESC-Exos治疗组SAMP8小鼠 BMSCs。通过克隆形成实验(图4A-B)、Ki67免疫荧光染色(图4C-D)检测细胞增殖能力，结果表明ESC-Exos的长期治疗可以改善12月龄小鼠BMSCs的增殖能力。碱性磷酸酶(ALP)、茜素红染色结果表明ESC-Exos的长期治疗可以改善12 月龄小鼠BMSCs的成骨分化能力(图4E-F)。PCR检测两组Runx2、OPN、BMP-2 和OCN基因的表达同样证实，ESC-Exos可以改善BMSCs的成骨分化能力(图4G)。
5、ESC-Exos可显著改善BMSCs衰老指标及干性基因表达
上述结果证明ESC-Exos长期治疗可以改善BMSCs的增殖和成骨分化能力。BMSCs衰老导致成骨分化能力等功能减弱是老年性骨质疏松的发病机制之一。因此进一步通过衰老相关β-半乳糖苷酶、Western blot、免疫荧光染色和PCR等实验方法评估Control组和ESC-Exos治疗组BMSCs的衰老指标及干性基因的变化。结果表明：ESC-Exos的长期治疗可以改善12月龄SAMP8小鼠BMSCs的衰老指标 (图5A-E)，上调Oct4基因的表达(图5C，F-G)。
6、ESC-Exos可上调BMSCs的Oct4基因表达
上述研究证实ESC-Exos治疗6月后，可以改善12月龄SAMP8小鼠BMSCs 的衰老表型，增强细胞的增殖和成骨分化能力。ESC-Exos治疗6月龄SAMP8小鼠6个月后，通过提取BMSCs发现，ESC-Exos可以上调Oct4的表达。
为进一步验证ESC-Exos能否将其所包裹的hNanog、hOct4和hSox2 mRNA转运至BMSCs，并观察内源性mNanog、mOct4和mSox2基因的表达变化。采用1× 1010particles/ml浓度的ESC-Exos处理6月龄BMSCs。免疫荧光实验证实ESC-Exos 可被BMSCs内吞(图6A)。通过PCR动态监测ESC-Exos处理BMSCs后外源性和内源性mNanog、mOct4和mSox2基因的变化。结果发现，外源性hNanog、hOct4 和hSox2基因逐渐降低，而内源性mOct4在ESC-Exos处理48小时出现明显的上调(图6B-C)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖能力药物上的用途。
2.一种多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs成骨分化药物上的用途。
3.一种多能干细胞外泌体在制备改善BMSCs增殖能力和成骨分化药物上的用途。
4.根据权利要求1或2或3所述应用，其特征在于，所述多能干细胞外泌体在制备促进BMSCs细胞Runx2、OPN、BMP-2或OCN基因的表达药物上的用途。
5.根据权利要求1或2或3所述应用，其特征在于，所述多能干细胞外泌体在制备上调BMSCs细胞中Nanog、Oct4和Sox2等多能性基因表达的药物上的用途。
6.根据权利要求1或2或3所述应用，其特征在于，所述多能干细胞外泌体在制备抑制BMSCs的衰老相关蛋白P16、P21等的表达和促进多能性基因Oct4等的表达的药物中的用途。
7.根据权利要求1或2或3所述应用，其特征在于，所述多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。
8.基于所述多能干细胞外泌体的制剂，其特征在于，所述制剂选择以下形式中的任一种：
A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
B、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；
C、以所述多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂或活性载体。
9.根据权利要求8所述制剂，其特征在于，所述多能干细胞外泌体制备的药剂浓度为1-9×108～1-10×1010particles/ml。
10.根据权利要求8所述制剂，其特征在于，所述制剂包括口服剂或静脉注射针剂，或直接在组织损伤部位注射剂或喷雾剂。
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