CN113519882B - 一种利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，包括：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT‑01，制得种子液；将烟末与提取液混合，回流提取，过滤后取滤液进行真空旋蒸处理，灭菌后得到烟草浸提液；将种子液和烟草浸提液先搅拌发酵再静置发酵，得到发酵烟草浸提液；离心取上清液分离纯化，收集洗脱组分，浓缩得到浓缩液；在浓缩液中加入无水乙醇，离心取上清液，得到醇沉物；在醇沉物中加入1,2‑丙二醇。本公开的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法制得的烟草提取物具有水果的香气，发酵产生的酸性香味成分在一定程度上可以缓解烟碱带来的刺激感。

Description

一种利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法

技术领域

本发明涉及烟草提取领域，更具体地，涉及一种利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法。

背景技术

烟草提取物是卷烟加工中极为重要的烟用香料，可赋予卷烟更为自然、饱满的香气。烟草提取物一般采用有机溶剂或水从烟草中提取、纯化、浓缩而成。传统方法制备的烟草提取物的香味特征取决于烟叶原料的种类。然而，面对多样化的卷烟产品开发要求，需要开发出更多种风格类型的烟草提取物。

烟草提取物在提取过程中会存在很多大分子物质如蛋白、淀粉、果胶等，影响烟草提取物的品质，后期需要使用分离技术去除。而利用微生物发酵法可以有效降解大分子物质，并转化为小分子糖、氨基酸以及新型的香味成分，赋予烟草提取物新的风格特征。

因此，如何提供一种可制备具有特殊香味的烟草提取物的方法成为本领域亟需解决的技术难题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可制备具有特殊香味的烟草提取物的方法的新技术方案。

根据本发明的第一方面，提供了一种利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法。

该利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法包括如下步骤：

步骤(1)：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，调节pH并灭菌后，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01，恒温震荡培养一段时间，制得种子液；

步骤(2)：将烟末与提取液按照质量体积比1:(2-20)混合，30℃-120℃下回流提取0.5h-5h，过滤后取滤液进行真空旋蒸处理，灭菌后得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为(1-10):20；

步骤(3)：将种子液和烟草浸提液按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置发酵12-72h，得到发酵烟草浸提液；

步骤(4)：过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素，随后离心取上清液，将上清液分离纯化，采用不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液；

步骤(5)：在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物；

步骤(6)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草提取物。

可选的，所述步骤(1)具体如下：

配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01后于25-40℃，100-200r/min的条件下恒温震荡培养12-48h，制得种子液。

可选的，所述步骤(1)中的培养条件如下：

温度为30℃，转速为150r/min，时间为24h。

可选的，所述步骤(2)具体如下：

烟末过筛，将过筛烟末与提取液按照质量体积比1:(2-20)混合，30℃ -120℃下回流提取0.5h-5h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在121℃灭菌10min得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为(1-10):20。

可选的，所述步骤(2)具体如下：

烟末过筛，将过筛烟末与提取液按照质量体积比1:10混合，90℃下回流提取2h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在 121℃灭菌10min得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为1:5。

可选的，所述步骤(3)具体如下：

将种子液和烟草浸提液按照体积比1:250混合，在温度30℃、150r/min 下先搅拌发酵36h再静置发酵48h，得到发酵烟草浸提液。

可选的，所述步骤(4)具体如下：

步骤(4-1)：过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素；

步骤(4-2)：对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液进行离心处理，取上清液，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，真空浓缩至密度为 1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

可选的，所述步骤(4-2)具体如下：

对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液在转速8000r/min、温度4℃条件下离心30min，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，在温度55℃、真空度为100mbar条件下浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

可选的，所述步骤(4-2)中采用体积分数为20％、50％和80％的乙醇梯度洗脱。

可选的，所述步骤(5)具体如下：

在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，-20℃温度下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

本公开的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法制得的烟草提取物具有水果的香气，发酵产生的酸性香味成分在一定程度上可以缓解烟碱带来的刺激感。

具体实施方式

现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。

在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。

本公开提供的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，包括如下步骤：

步骤(1)：配制含有葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和一水合柠檬酸的水溶液，调节pH并灭菌后，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01，恒温震荡培养一段时间，制得种子液。

本公开的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为 CGMCC NO.21544，菌种名称为葡糖酸醋杆菌，菌株编号为ZT-01，分类命名为葡糖酸醋杆菌,Gluconacetobacter sp.，保藏时间为2020年12月23 日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

步骤(1)可具体如下：

配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01后于25-40℃，100-200r/min的条件下恒温震荡培养12-48h，制得种子液。

步骤(1)中的培养条件可如下：

温度为30℃，转速为150r/min，时间为24h。

步骤(2)：将烟末与提取液按照质量体积比1:(2-20)混合，30℃-120℃下回流提取0.5h-5h，过滤后取滤液进行真空旋蒸处理，灭菌后得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为(1-10):20。上述烟末可为优质烟末。真空旋蒸处理可充分去除体系中的乙醇。以乙醇与水的混合溶剂提取烟末，可以有效地把烟末中水溶性和醇溶性的物质提取出来，去除乙醇可以防止乙醇对微生物活性造成影响。

步骤(2)可具体如下：

烟末过筛，将过筛烟末与提取液按照质量体积比1:(2-20)混合，30℃ -120℃下回流提取0.5h-5h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在121℃灭菌10min得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为(1-10):20。

步骤(2)可具体如下：

烟末过筛，将过筛烟末与提取液按照质量体积比1:10混合，90℃下回流提取2h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在 121℃灭菌10min得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为1:5。

步骤(3)：将种子液和烟草浸提液按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置发酵12-72h，得到发酵烟草浸提液。

步骤(3)可具体如下：

将种子液和烟草浸提液按照体积比1:250混合，在温度30℃、150r/min 下先搅拌发酵36h再静置发酵48h，得到发酵烟草浸提液。

步骤(4)：过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素，随后离心取上清液，将上清液分离纯化，采用不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

步骤(4)可具体如下：

步骤(4-1)：过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素。

步骤(4-2)：对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液进行离心处理，取上清液，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，真空浓缩至密度为 1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

步骤(4-2)可具体如下：

对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液在转速8000r/min、温度4℃条件下离心30min，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，在温度55℃、真空度为100mbar条件下浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

步骤(4-2)中可采用体积分数为20％、50％和80％的乙醇梯度洗脱。

步骤(5)：在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物。

步骤(5)可具体如下：

在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，-20℃温度下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

步骤(6)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草提取物。

步骤(6)可具体如下：

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草提取物。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。

实施例1

配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌ZT-01后于30℃，150r/min的条件下恒温震荡培养24h，制得种子液。

烟末过50目筛，将过筛烟末与提取液(提取液为体积比为1:5的无水乙醇和水)按照质量体积比(g/mL)1:10混合，90℃下回流提取2h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在121℃灭菌10min 得到烟草浸提液。

将种子液和烟草浸提液按照体积比1:250混合，在温度30℃、150r/min 下先搅拌发酵36h再静置发酵48h，得到发酵烟草浸提液。

过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素。对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液在转速8000r/min、温度4℃条件下离心30min，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为20％、50％和80％的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，在温度55℃、真空度为100mbar条件下浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，-20℃温度下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，得到烟草提取物T。

对比例1

烟末过50目筛，将过筛烟末与提取液(提取液为体积比为1:5的无水乙醇和水)按照质量体积比(g/mL)1:10混合，90℃下回流提取2h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在121℃灭菌10min 得到烟草浸提液。

对烟草浸提液在转速8000r/min、温度4℃条件下离心30min，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为20％、50％和80％的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，在温度55℃、真空度为100mbar条件下浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，-20℃温度下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，得到烟草提取物CK。

烟草提取物通过HPLC检测有机酸成分，pH计测定pH值，GC-MS检测香味成分。

烟草提取物有机酸含量分析见表1。由表1可知，经过发酵后，烟草提取物T的有机酸总含量增加，pH降低。其中苹果酸、柠檬酸含量增加，可以有效增加烟草提取物的柔和感，增强水果气息。

表1.烟草提取物有机酸含量分析(单位：ug/mL)

烟草提取物的香味成分见表2。由表2可知，发酵后的酸香性烟草提取物T，香味成分总含量高于未经发酵的烟草提取物CK，新产生香草酸、对羟基苯乙醇、乳酸、香草醛、苯乙酸、苯乙醇、苯甲酸等香味成分，具有明显的酸香风格，表现为水果香型，经过发酵后的烟草提取物T品质更高。

表2.烟草提取物香味成分统计(单位：ug/mL)

虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims (8)

1.一种利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：配制含有20g/L葡萄糖、5g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、1g/L一水合柠檬酸的水溶液，调节pH至4.8-5，于121℃灭菌15min，接种保藏编号为CGMCC NO.21544的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)ZT-01后于30℃，150r/min的条件下恒温震荡培养24h，制得种子液；

步骤(2)：将烟末与提取液按照质量体积比1:(2-20)混合，30℃-120℃下回流提取0.5h-5h，过滤后取滤液进行真空旋蒸处理，灭菌后得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为(1-10):20；

步骤(3)：将种子液和烟草浸提液按照体积比1:(10-1000)混合，在温度25-40℃、50-300r/min下先搅拌发酵12-48h再静置发酵12-72h，得到发酵烟草浸提液；

步骤(4)：过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素，随后离心取上清液，将上清液分离纯化，采用不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液；

步骤(5)：在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物；

步骤(6)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草提取物。

2.根据权利要求1所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：

烟末过筛，将过筛烟末与提取液按照质量体积比1:(2-20)混合，30℃-120℃下回流提取0.5h-5h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在121℃灭菌10min得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为(1-10):20。

3.根据权利要求2所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：

烟末过筛，将过筛烟末与提取液按照质量体积比1:10混合，90℃下回流提取2h，过滤后取滤液在120mbar真空度、55℃温度下旋蒸2h，随后在121℃灭菌10min得到烟草浸提液，其中，烟末的质量的单位为g，提取液的体积的单位为mL，提取液包括乙醇和水，且提取液中乙醇和水的体积比为1:5。

4.根据权利要求1所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体如下：

将种子液和烟草浸提液按照体积比1:250混合，在温度30℃、150r/min下先搅拌发酵36h再静置发酵48h，得到发酵烟草浸提液。

5.根据权利要求1所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体如下：

步骤(4-1)：过滤除去发酵烟草浸提液中的固态细菌纤维素；

步骤(4-2)：对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液进行离心处理，取上清液，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，真空浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

6.根据权利要求5所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(4-2)具体如下：

对除去固态细菌纤维素的发酵烟草浸提液在转速8000r/min、温度4℃条件下离心30min，将上清液采用HD-20大孔树脂分离纯化，采用体积分数为10-100％的至少两种不同纯度的乙醇梯度洗脱，收集洗脱组分，在温度55℃、真空度为100mbar条件下浓缩至密度为1.145-1.155g/mL，得到浓缩液。

7.根据权利要求5或6所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(4-2)中采用体积分数为20％、50％和80％的乙醇梯度洗脱。

8.根据权利要求1所述的利用葡糖酸醋杆菌制备酸香型烟草提取物的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体如下：

在浓缩液中加入等体积的无水乙醇，-20℃温度下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。