CN113475746B - 一种烟草提取物残渣的二次提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草提取物残渣的二次提取方法，包括：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌ZY02的菌落接种至液体培养基中，制得种子液；将微球菌种子和残渣混溶物混合发酵，得到发酵残渣混溶物；过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物，对第一滤液离心，得到第二固形物；将第一固形物和第二固形物混合得到的第三固形物和无水乙醇震荡后过滤得到第二滤液；将上清液和第二滤液混合，得到的烟草二次提取液真空浓缩，得到浓缩液；对浓缩液进行回流提取处理，得到烘烤浓缩液；在烘烤浓缩液中加入无水乙醇，离心得到醇沉物；在醇沉物中加入1,2‑丙二醇。本公开的烟草提取物残渣的二次提取方法可有效提取烟草提取物残渣中的有益成分，得到新型烟草提取物。

Description

一种烟草提取物残渣的二次提取方法

技术领域

本发明涉及烟草废料利用领域，更具体地，涉及一种烟草提取物残渣的二次提取方法。

背景技术

烟草提取物是卷烟加工中极为重要的烟用香料，可赋予卷烟更为自然、饱满的香气。

烟草提取物的制备一般先把烟叶或碎片粉碎成烟末，使用有机物或水作为溶剂，以将烟末中的香味成分进行提取、纯化、浓缩。提取过程中，易溶于溶剂的成分被提取出，而一些固形物如纤维、蛋白、淀粉、果胶、木质素，以及一部分内部包裹的香味成分等难以被提取，形成烟末残渣。

这些烟末残渣一般被丢弃，造成浪费。而某些优质的烟草资源价格较高，用于制备烟草提取物后剩余的残渣如果可以二次提取，制备出新的烟草提取物，将会产生更好的经济和社会效益。

对烟草提取物残渣进行二次提取，首先要把大分子物质降解，一方面是将大分子物质转化为小分子和香味成分，另一方面是把烟草中包裹的香味成分更好地释放。残渣中的大分子物质可以通过化学法和生物法进行降解。化学法主要包括强酸或强碱法，此种方法很难解决残留的酸、碱，不适宜用于烟草提取物的制备。生物法主要通过微生物或酶制剂处理，以将大分子物质降解转化为可溶性糖和氨基酸等小分子，进而可以在高温条件下诱导美拉德反应，产生更多的香味成分。某些增香微生物本身也可以利用糖和氨基酸产生香味物质，利用生物法处理烟草提取物残渣并进行二次提取，具有较好的实用价值。

因此，如何提供一种可有效提取烟草提取物残渣中的有益成分的生物法处理烟草提取物残渣的方法成为本领域亟需解决的技术难题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种可有效提取烟草提取物残渣中的有益成分的生物法处理烟草提取物残渣的方法的新技术方案。

根据本发明的第一方面，提供了一种烟草提取物残渣的二次提取方法。

该烟草提取物残渣的二次提取方法包括如下步骤：

步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，制得种子液；

步骤(2)：将种子液在4000r/min，4℃的条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD₆₀₀为2.0，制得微球菌种子；

步骤(3)：将烟草提取物残渣与去离子水按照质量比1:(1-10)混合，得到残渣混溶物；

步骤(4)：将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，恒温搅拌发酵12-96h，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g；

步骤(5)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物，对第一滤液离心进行离心处理，得到上清液和第二固形物；

步骤(6)：将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温震荡一段时间后，过滤得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL；

步骤(7)：将上清液和第二滤液混合，得到烟草二次提取液；

步骤(8)：将烟草二次提取液真空浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液；

步骤(9)：对浓缩液进行回流提取处理，得到烘烤浓缩液；

步骤(10)：在烘烤浓缩液中加入无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物；

步骤(11)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

可选的，所述步骤(1)中的液体培养基为LB液体培养基。

可选的，所述步骤(1)中培养的条件如下：

温度为30℃，震荡速度为150r/min，时间为12h。

可选的，所述步骤(4)具体如下：

将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，在30℃下恒温搅拌发酵12-96h，搅拌转速为180r/min，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g。

可选的，所述步骤(5)具体如下：

步骤(5-1)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物；

步骤(5-2)：在4℃下以8000r/min的速率离心第一滤液20min，得到上清液和第二固形物。

可选的，所述步骤(6)具体如下：

将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温下150r/min震荡2h后，用快速滤纸过滤，得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL。

可选的，所述步骤(8)具体如下：

将烟草二次提取液在温度50℃、真空度为150mbar的条件下浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液。

可选的，所述步骤(9)具体如下：

浓缩液采用回流提取装置在110℃条件下加热烘烤1-5h，得到烘烤浓缩液。

可选的，所述步骤(10)具体如下：

烘烤浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

可选的，所述步骤(11)具体如下：

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

本公开的烟草提取物残渣的二次提取方法可有效提取烟草提取物残渣中的有益成分，得到新型烟草提取物。

通过以下参照附图对本发明的示例性实施例的详细描述，本发明的其它特征及其优点将会变得清楚。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。

图1为烟草二次提取物的香味成分统计图。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。

在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。

本公开提供的烟草提取物残渣的二次提取方法包括如下步骤：

步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，制得种子液。

本公开的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21313，菌种名称为微球菌，菌株编号为ZY02，分类命名为微球菌,Micrococcaceae Pribram，保藏时间为2020年12月07日。

步骤(1)中的液体培养基可为LB液体培养基。

步骤(1)中培养的条件可如下：

温度为30℃，震荡速度为150r/min，时间为12h。

步骤(2)：将种子液在4000r/min，4℃的条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD₆₀₀为2.0，制得微球菌种子。

步骤(3)：将烟草提取物残渣与去离子水按照质量比1:(1-10)混合，得到残渣混溶物。

步骤(4)：将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，恒温搅拌发酵12-96h，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g。

步骤(4)可具体如下：

将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，在30℃下恒温搅拌发酵12-96h，搅拌转速为180r/min，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g。

步骤(5)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物，对第一滤液离心进行离心处理，得到上清液和第二固形物。

步骤(5)可具体如下：

步骤(5-1)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物。

步骤(5-2)：在4℃下以8000r/min的速率离心第一滤液20min，得到上清液和第二固形物。

步骤(6)：将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温震荡一段时间后，过滤得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL。

步骤(6)可具体如下：

将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温下150r/min震荡2h后，用快速滤纸过滤，得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL。

步骤(7)：将上清液和第二滤液混合，得到烟草二次提取液。

步骤(8)：将烟草二次提取液真空浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液。

步骤(8)可具体如下：

将烟草二次提取液在温度50℃、真空度为150mbar的条件下浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液。

步骤(9)：对浓缩液进行回流提取处理，得到烘烤浓缩液。

步骤(9)可具体如下：

对浓缩液采用回流提取装置在110℃条件下加热烘烤1-5h，得到烘烤浓缩液。

步骤(10)：在烘烤浓缩液中加入无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物。

步骤(10)可具体如下：

烘烤浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

步骤(11)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

步骤(11)可具体如下：

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。

实施例1

将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(Micrococcaceae Pribram)ZY02的菌落接种至LB液体培养基中，于30℃，150r/min的摇床中培养12h，制得种子液。

将种子液在4000r/min，4℃的条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD₆₀₀为2.0，制得微球菌种子。

将烟草提取物残渣与去离子水按照质量比1:5混合，得到残渣混溶物。烟草提取物残渣为云南昆明2019年CJ34烟叶采用乙醇高温回流提取法制备烟草提取物后产生的固形物烟末残渣。

将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比(mL/g)1:20混合，在30℃下恒温搅拌发酵48h，搅拌转速为180r/min，得到发酵残渣混溶物。

过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物。

在4℃下以8000r/min的速率离心第一滤液20min，得到上清液和第二固形物。

将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比(g/mL)1:10混合，常温下150r/min震荡2h后，用快速滤纸过滤，得到第二滤液。

将上清液和第二滤液混合，得到烟草二次提取液。

将烟草二次提取液在温度50℃、真空度为150mbar的条件下浓缩至密度为1.20±0.005g/mL，得到浓缩液。

浓缩液采用回流提取装置在110℃条件下加热烘烤1-5h，得到烘烤浓缩液。

烘烤浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物T。

对比例1

将烟草提取物残渣与去离子水按照质量比1:5混合，得到残渣混溶物。烟草提取物残渣为云南昆明2019年CJ34烟叶采用乙醇高温回流提取法制备烟草提取物后产生的固形物烟末残渣。

将去离子水和残渣混溶物按照体积质量比(mL/g)1:20混合，在30℃下恒温搅拌48h，搅拌转速为180r/min，得到残渣混溶物。

过滤残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物。

在4℃下以8000r/min的速率离心第一滤液20min，得到上清液和第二固形物。

将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比(g/mL)1:10混合，常温下150r/min震荡2h后，用快速滤纸过滤，得到第二滤液。

将上清液和第二滤液混合，得到烟草二次提取液。

将烟草二次提取液在温度50℃、真空度为150mbar的条件下浓缩至密度为1.20±0.005g/mL，得到浓缩液。

浓缩液采用回流提取装置在110℃条件下加热烘烤1-5h，得到烘烤浓缩液。

烘烤浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物CK。

采用流动分析法检测实施例1和对比例1中的烟草二次提取液常规化学成分，通过GC-MS检测烟草二次提取物T和烟草二次提取物CK的香味成分。

烟草二次提取液的常规化学成分见表1。由表1可见，经过发酵后，烟草二次提取液中总糖、还原糖、烟碱、总氮含量显著提升，糖碱比增加。说明经过发酵后，大分子物质转化为可溶性小分子糖和氨基酸，同时包裹的可溶性物质也随着大分子的降解被释放出来，因此使得烟草二次提取物T中的内含物更丰富。

表1.烟草二次提取液常规化学成分含量分析(单位：mg/mL)

烟草二次提取物的香味成分见表2。由表2和图1可知，发酵后的烟草二次提取物T，各种种类的香味成分总含量均高于未经发酵的烟草二次提取物CK。其中，美拉德产物的含量增加最明显，可以反应出经过发酵后，大分子降解产生了一定量的小分子糖类和氨基酸，经过高温过程产生了大量美拉德产物，提高了烟草二次提取物的品质。

表2.烟草二次提取物香味成分统计(单位：ug/mL)

虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims (9)

1.一种烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌(MicrococcaceaePribram)ZY02的菌落接种至液体培养基中，于25-40℃，100-200r/min的摇床中培养6-36h，制得种子液；

步骤(2)：将种子液在4000r/min，4℃的条件下低温离心20min，去除上清液，加入无菌水复溶，调节OD₆₀₀为2.0，制得微球菌种子；

步骤(3)：将烟草提取物残渣与去离子水按照质量比1:(1-10)混合，得到残渣混溶物；

步骤(4)：将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，恒温搅拌发酵12-96h，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g；

步骤(5)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物，对第一滤液离心进行离心处理，得到上清液和第二固形物；

步骤(6)：将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温震荡一段时间后，过滤得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL；

步骤(7)：将上清液和第二滤液混合，得到烟草二次提取液；

步骤(8)：将烟草二次提取液真空浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液；

步骤(9)：浓缩液采用回流提取装置在110℃条件下加热烘烤1-5h，得到烘烤浓缩液；

步骤(10)：在烘烤浓缩液中加入无水乙醇，低温静置一段时间后，离心取上清液，得到醇沉物；

步骤(11)：在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的1％-50％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

2.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的液体培养基为LB液体培养基。

3.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的条件如下：

温度为30℃，震荡速度为150r/min，时间为12h。

4.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(4)具体如下：

将微球菌种子和残渣混溶物按照体积质量比1:(10-200)混合，在30℃下恒温搅拌发酵12-96h，搅拌转速为180r/min，得到发酵残渣混溶物，其中，微球菌种子的体积的单位为mL，残渣混溶物的质量的单位为g。

5.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(5)具体如下：

步骤(5-1)：过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物；

步骤(5-2)：在4℃下以8000r/min的速率离心第一滤液20min，得到上清液和第二固形物。

6.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(6)具体如下：

将第一固形物和第二固形物混合得到第三固形物，将第三固形物和无水乙醇按照质量体积比1:(1-20)混合，常温下150r/min震荡2h后，用快速滤纸过滤，得到第二滤液，其中，第三固形物的质量的单位为g，无水乙醇的体积的单位为mL。

7.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(8)具体如下：

将烟草二次提取液在温度50℃、真空度为150mbar的条件下浓缩至密度为1.195-1.205g/mL，得到浓缩液。

8.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(10)具体如下：

烘烤浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇，-20℃下静置过夜后，离心取上清液，得到醇沉物。

9.根据权利要求1所述的烟草提取物残渣的二次提取方法，其特征在于，所述步骤(11)具体如下：

在醇沉物中加入体积为醇沉物体积的10％的1,2-丙二醇，即得到烟草二次提取物。

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