CN113388561B

CN113388561B - 一种根瘤菌hh103ω突变体及其应用

Info

Publication number: CN113388561B
Application number: CN202110564809.7A
Authority: CN
Inventors: 辛大伟; 王锦辉; 刘春燕; 邹佳男; 杨明亮; 朱荣胜; 胡振帮; 武小霞; 齐照明; 赵莹; 陈庆山
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113388561A

Abstract

本发明提供了一种根瘤菌HH103Ω突变体及其应用，属于农用微生物技术领域。本发明的目的是为了减少大豆根瘤的数量。本发明提供了一种根瘤菌HH103的突变体，所述突变体是以根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103为出发菌株，经过数次实验和不同群体的验证表明NopZ突变的突变体HH103ΩNopZ能减少大豆的根瘤的数量，为后续研究大豆‑根瘤菌共生体系形成提供了基础，为提高大豆与根瘤菌的共生效率提供了可能性。

Description

一种根瘤菌HH103Ω突变体及其应用

技术领域

本发明属于农用微生物技术领域，具体涉及一种根瘤菌HH103Ω突变体及其应用。

背景技术

氮元素是限制作物生长的最主要元素之一，但是土壤中能够被植物所利用的氮元素非常有限，主要还是由化学肥料来提供。然而，随着氮肥使用量的不断增加，这不仅抑制根瘤菌与豆科植物间的共生固氮作用，而且给生态环境带来了诸多不利的影响。所以，在无化学肥料供应的情况下，共生固氮可以为豆科植物的生长发育提供足够的氮源。在大豆根系被根瘤菌侵染后会形成共生根瘤，根瘤会通过生物固氮的的方式将空气中的氮气转化成氨为大豆提供氮源。增加大豆与根瘤菌间的固氮能力，既可以大幅度减少氮肥的使用，同时也可以提高大豆产量。因此，提高豆科植物自身的固氮能力对生态环境与农业发展具有重要意义。

豆科植物与根瘤菌(Sinorhizobium fredii)的共生结瘤过程中有很多信号分子的传导参与，其中根瘤菌的Ⅲ型泌出***分泌的Ⅲ型效应因子是最主要的信号分子之一，它影响着根瘤菌与宿主植物之间共生关系的建立。但是Ⅲ型效应因子是如何影响植物结瘤的分子机制还不清楚，以及根瘤菌与豆科植物间的互作基因还没有深入的研究。

大豆根瘤的数目是影响大豆共生固氮和生长情况的重要的因素，目前控制大豆根瘤菌的数量是没有办法通过人为来控制的，只能通过不断的更换根瘤菌摸索适合于接种大豆的根瘤菌维持稳定的根瘤数量，操作很麻烦并且工程量很大，未知的因素也比较多。现在急需一种可以控制大豆根瘤数量的方法。

发明内容

本发明的目的是为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。本发明提供了一种根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103的突变体，所述突变体是以根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103为出发菌株，将出发菌中的NopZ基因缺失或者沉默得到的。

在一种实施方式中，所述NopZ基因的NCBI GenBank：AY683479.1。

在一种实施方式中，所述突变体的是以根瘤菌HH103为宿主表达NopZ基因的pJQ200SK载体得到的。

本发明还提供了上述突变体的构建方法，所述构建方法的具体步骤如下：

(1)构建重组载体：在NopZ的CDS的起始密码子下游24b-29bp处突变成为EcoRI的酶切位点，然后在NopZ的CDS的起始密码子下游24bp处SEQ ID NO:13所示的抗性片段Specc得到目的片段；

(2)将步骤(1)得到的目的片段与pJQ200SK载体连接得到重组载体；

(3)将步骤(2)得到的重组载体通过三亲杂交的方法导入到根瘤菌HH103中，得到根瘤菌HH103突变体。

本发明还提供了一种减少大豆根瘤数目的试剂，所述试剂的有效成分是含有上述的根瘤菌HH103的突变体。

在一种实施方式中，所述根瘤菌HH103的突变体的数量为大于1×10⁵个/毫升。

本发明还提供了一种减少大豆根瘤的方法，所述方法的具体步骤如下：

在大豆苗生长至对生真叶期，对大豆苗施上述的突变体的菌液，接菌量为大于2×10⁵个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。

在一种实施方式中，所述菌液按如下方法制备：

(1)将上述的突变体培养活化，控制OD₆₀₀为0.65-0.86；

(2)将步骤(1)得到的菌液离心，收集菌体并洗涤，再用硫酸镁溶液重悬菌体，使菌液OD₆₀₀达到0.2；

本发明还提供了一种上述试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，所述试剂适用的大豆品种为绥农14或野生豆ZYD00006。

本发明还提供了上述的突变体在大豆育种中的应用。

本发明还提供了上述减少大豆根瘤的方法在大豆育种中的应用。

有益效果：本发明是通过对中华根瘤菌Ⅲ型效应因子NopZ进行基因缺失突变，PCR和Southern blot鉴定后得到突变体HH103ΩNopZ。对HH103ΩNopZ突变体以及野生型菌株HH103进行220份染色体片段代换系(CSSL)结瘤试验，对根瘤数目及瘤干重进行统计，结果表明NopZ突变能够减少根瘤数目和根瘤干重并且经过数次实验和不同群体的验证表明NopZ突变的突变体HH103ΩNopZ能减少大豆的根瘤的数量，为后续研究大豆-根瘤菌共生体系形成提供了基础，为提高大豆与根瘤菌的共生效率提供了可能性。

附图说明

图1为扩增基因的凝胶电泳结果图，其中，A是NopZ突变片段扩增，M是Trans 2KPlus DNA marker，1、2是NopZ突变片段(1440bp)；B是Spec抗性基因***NopZ突变片段，M是Trans 2K DNA marker；1、2是Spec***NopZ突变片段(2681bp)；

图2为突变体HH103ΩNopZ的PCR鉴定，其中，M是Trans 2K Plus DNA marker，A是引物Nifh-F和Nifh-R进行第一轮鉴定，B是引物Spec-F和NopZ-R引物进行第二轮验证，C是引物NopZ-F和NopZ-R引物进行第三轮PCR验证，5、6泳道为NopZ突变体；

图3为突变体HH103ΩNopZ的Southern鉴定，其中，M是DL 15000DNA Ladder，1是HH103ΩNopZ(HindⅢ)，2是HH103(HindⅢ)；

图4为回补菌株的PCR鉴定，其中，M是Trans 2K Plus DNA marker，1是HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ，2是HH103野生型，3是HH103ΩNopZ；

图5为不同菌株接种绥农14，ZYD00006的结瘤表型，其中，A是根瘤数目统计，横坐标为组别，纵坐标为根瘤数目；B是根瘤干重统计，横坐标为组别，纵坐标为根瘤干重；注：*表示在p<0.05水平差异显著。

具体实施例

全基因组导入系群体(Chromosome Segments Substitution Lines，CSSL)记载在文章_陈庆山，“作物回交导入系的构建与应用”。

HH103ΩTtsI(效应因子不表达突变体)记载在[1]田博宇,孙志君,刘函西,等.根瘤菌TtsI突变体构建及结瘤表型鉴定[J].中国油料作物学报,2020,v.42；No.179(01):21-28.

pEASY-T1载体、Helper(Km)和pFAJ1702(Tet)均为商业购买。

pJQ200SK载体(Gm)载体记载在Quandt,J.,&Hynes,M.F.(1993).Versatilesuicide vectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negative bacteria.Gene,127(1),15–21.doi:10.1016/0378-1119(93)90611-6文献中；

SN14、野生豆ZYD00006绥农14、Charleston、东农594、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、Nattosan、黑农44、黑农35和北丰11均是黑龙江常见的品种，来自东北农业大学大豆生物学***重点实验室。

快生型费氏中华根瘤菌HH103(源于西班牙塞维利亚大学Francisco Javier López-Baena实验室，记载在Weidner S,Becker A,Bonilla I,et al.Genome Sequence ofthe Soybean Symbiont Sinorhizobium fredii HH103[J].Journal of Bacteriology,2012,194(6):1617.)

2×TY液体培养基：胰蛋白胨(bacto-tryptone)16g、酵母提取物(bacto-yeastextract)10g、NaCl 5g、水1000mL,pH7.2，121℃灭菌30min

实施例1.构建重组载体

1.根据费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HH103全基因组序列(NCBI ID号为txid1117943)，从中找到Ⅲ型效应因子NopZ的编码序列(GenBank:AY683479.1)。设计NopZ突变片段序列(起始密码子上游650bp和下游750bp左右)，设计引物NopZ突变片段-F(CCGTGCGATAGTTGTGGTT，SEQ ID NO：1)和NopZ突变片段-R(TCACCTCCCAAATCCCAAA，SEQ IDNO：2)。

2.NopZ突变片段：利用细菌全基因组提取试剂盒(TIANGEN公司)提取得到根瘤菌HH103基因组，利用引物NopZ突变片段-F和NopZ突变片段-R对提取好的根瘤菌HH103基因组进行NopZ突变片段进行的PCR扩增。反应体系：模板DNA，2μg；5×PS Bufferr，20μL；dNTP，8μL；NopZ-R，2μL；NopZ-F，2μg；PrimeSTAR，1.2μL；ddH2O，up to 100μL；

反应条件(28个循环)：98℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，pause。

pEASY-Blunt Cloning Kit载体连接体系(10μL)：NopZ突变片段，4μL；Solution，5μL；pEASY-Blunt Cloning Kit，1μL。得到NopZ-LF-pEasy-Blunt质粒。

结果：NopZ基因的目标条带为537bp，NopZ突变片段的目标条带为1440bp，如图1中的A所示。

3.同源重组片段的构建

设计引物：在NopZ的CDS的起始密码子下游18bp处成为EcoRI的酶切位点。在突变位置上下15bp作为上游引物，下游引物为其互补链。抗性片段Spec引物在5，端加上EcoRI酶切位点序列。

NopZ-D-F(GGAGACGGTCGGATGGAATTCGCGTTTGACCTCGTG，SEQ ID NO：3)，NopZ-D-R(CACGAGGTCAAACGCGAATTCCATCCGACCGTCTCC，SEQ ID NO：4)，Spec-D-F(ACTAGTAGTAAACTGGATGGCTTTCTTG，SEQ ID NO：5)，Spec-D-R(ACTAGTCTTCAGCATCTTTTACTTTCAC，SEQ ID NO：6)。

(1)NopZ突变片段点突变

反应体系(100μL)如下：NopZ-F-pEasy-Blunt，2μg；5×PS Buffer，20μL；dNTP，8μL；NopZ-D-R，2μL；NopZ-D-F，2μg；PrimeSTAR，1.2μL；ddH₂O，up to 100μL；

PCR反应条件(14个循环)：95℃，10min；95℃，1min；66.8℃，1min；68℃，5min18s；72℃，10min；4℃，Pause。

反应结束后，加入1μLDpnI，放置金属浴中37℃，消化1h。转入T1大肠杆菌感受态，菌液PCR，测序后命名NopZ-EcoRI。EcoRI酶切位点的序列为:GAATTC。

Spec抗性片段扩增，NopZ-EcoRI载体与Spec片段如SEQ ID NO:13所示用EcoRI酶切：

酶切体系(150μL)：DNA，6μg；Cutsmart，15μL；EcoRI，3μL；ddH₂O，up to 150μL；酶切产物胶回收，连接体系及反应条件(10μL)：载体，0.5μg；片段，2μg；Buffer，1μL；T4连接酶，1μL；ddH₂O，up to 10μL；放置金属浴中16℃，过夜连接后转入大肠杆菌感受态，菌液PCR鉴定后，测序成功后命名NopZ-D-Spec。

结果：在NopZ突变片段起始密码子ATG下游18bp处***Spec基因，以含有Spec抗性的pEASY-T1载体为模板，用引物Spec-F/R扩增Spec基因。设计带有EcoRI酶切位点的引物，NopZ突变片段和Spec基因进行PCR扩增，酶切后连接转化的菌液进行PCR菌液鉴定，用NopZ-D-F和NopZ-D-R为引物进行PCR扩增如图1中的B所示。

4.重组***载体构建

引物设计：分析NopZ-D-Spec载体和pJQ200SK载体的酶切位点，前者没有的酶切位点，后者存在的酶切位点为XBaI和XmaI，设计引物。用引物NopZ-dp-F/R扩增NopZ-D-Spec，得到基因序列NopZ-dp序列，NopZ-dp-F引物(TGCTCTAGACCGTGCGATAGTTGTGGTT，SEQ ID NO：7)；NopZ-dp-R引物(CCCCCCGGGTCACCTCCCAAATCCCAAA，SEQ ID NO：8)，对***载体和基因序列NopZ-dp序列进行双酶切纯化后连接pJQ200SK-NopZ，转入大肠杆菌感受态，测序对比后得到含有pJQ200SK-NopZ菌液。

实施例2.构建根瘤菌HH103的突变体

1.三亲杂交实验方法：将带有pJQ200SK-NopZ的大肠杆菌划线于含有Km、Gent抗性的LB固体培养基；将野生型根瘤菌HH103划线于含Rif抗性的TY固体培养基中；将带有Helper质粒的大肠杆菌划线于含Km抗性的LB固体培养基。过夜培养直至长出单克隆；将3种菌挑单克隆分别于7mL相应培养基中培养至OD₆₀₀值为0.65左右；每个用枪吸取1mL，分别放于新的1.5mL离心管中，常温下离心12 000rpm离心30s，弃上清，用1mL无抗TY反复重悬(调整OD600到0.6)；取重悬后的HH103菌液200μL，pJQ200SK-NopZ的大肠杆菌和带有Helper质粒的大肠杆菌各100μL加入到新的1.5mL离心管中，11995rpm离心30s，弃上清，用20μL无抗TY重新重悬；将混合菌液滴到无抗TY固体培养基平板上过夜培养；过夜培养后，刮取大斑划线到含Rif/Spec(50mg/mL)抗性的TY固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；将经过3次筛选的单克隆划线于含有5％蔗糖的Rif/Spec(50mg/mL)抗性的TY固体培养基进行筛选，重复3次；筛选到的突变体命名为HH103ΩNopZ。

将含有pJQ200SK-NopZ的菌液、HH103、含有Helper质粒的菌液，三种菌液按2:1:1(体积比)的比例混合，滴到无抗TY固体培养基平板上过夜培养，用灭过的枪头分多次刮取大斑，划线到含Rif/Spec(50mg/mL)抗性的TY固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；将经过3次筛选的单克隆划线于含有5％蔗糖的Rif/Spec(50mg/mL)抗性的TY固体培养基进行筛选，重复3次；筛选到的突变体经PCR、Southern blot鉴定后命名为HH103ΩNopZ。

2.HH103ΩNopZ菌液PCR鉴定：利用引物Nifh-F(R)、Spec-F和NopZ-R以及NopZ突变片段-F(R)三对引物分别扩增突变菌株HH103ΩNopZ，通过电泳的方法，观察到目的条带，测序验证突变体。

结果：用引物Nifh-(F/R)扩增，NifH-F：CTA CTG CGG TGC TGC TAT(SEQ ID NO：14)；NifH-R：GTC CGT CTT GTC GTC CGC(SEQ ID NO：15)

证明扩增菌液为中华根瘤菌，长度为960bp。用引物Spec-F和NopZ-R扩增长度应该包含抗生素片段与NopZ基因，长度为1778bp。引物NopZ-LF(F/R)扩增片段包含NopZ基因与***载体，长度为2681bp。最终筛选出突变体HH103ΩNopZ，结果如图2所示。

3.Southern blot鉴定:

(1)限制性内切酶：HindⅢ(TAKARA公司)；

(2)引物：设计标记探针的引物，引物包括目的基因及Spec基因的一部分，总共大约600bp，设计引物。S-NopZ-F：(TGATGGCACAGGCGAT，SEQ ID NO：9)，S-NopZ-R：(ACAGGCTTATCTTGGACA，SEQ ID NO：10)。

结果：如图3所示，酶切后突变体HH103ΩNopZ片段比野生型根瘤菌HH103片段多大约1000bp多，即Spec基因片段大小，验证突变体HH103ΩNopZ的准确性。扩增长度与理论相符。

实施例3.构建回补菌株pFAJ1702-NopZ与鉴定结瘤能力

1.设计引物：在NopZ起始密码子前500bp左右开始到NopZ终止为扩增片段。用DNAMAN分析不能切开的酶有HindⅢ、BamHⅠ，设计引物。pFAJ1702-NopZ-F(CCCAAGCTTCGTGCGATGCGCGAGATA，SEQ ID NO：11)，pFAJ1702-NopZ-R(CGCGGATCCTTACCGGAACTCGTTGCG，SEQ ID NO：12)。

步骤为：(1)用pFAJ1702-NopZ(F/R)扩增中华根瘤菌HH103全基因组，纯化产物后将载体和NopZ目标产物进行双酶切3-5h，酶切后进行产物纯化，连接16h后转入大肠杆菌中，菌液PCR验证后进行测序；

(2)通过三亲杂交的方法获得NopZ的回补菌株，回补菌株被命名为HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ。

HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ菌液PCR鉴定：利用引物NopZ突变片段-F(R)分别扩增HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ、HH103野生型和HH103ΩNopZ突变体菌株，后两者作为对照，通过电泳的方法，观察到目的条带。验证回补菌株HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ。

结果：以回补菌液HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ、野生型菌株HH103和突变体菌液HH103ΩNopZ为模板，用引物NopZ突变片段、(F/R)进行菌液PCR鉴定。回补菌液HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ目的条带有两条，一条与野生型菌株HH103的扩增条带长度相同，另一条与变体菌液HH103ΩNopZ的扩增条带长度相同，扩增长度与理论相符。如图4所示。鉴定后命名为HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ。

利用以下实验验证实验效果：

结瘤能力鉴定：

(1)准备大豆样品：

a)取染色体片段代换系(CSSL)父母本SN14和野生豆ZYD00006各80粒左右，氯气对种子表面进行灭菌12h。

b)将种子从通风储中拿出，放置无菌通风的环境中20min左右，将表面氯气吹干净。

c)组装好双层钵植物生长***，生长***内含有蛭石与缺氮营养液，对双层钵进行高温灭菌，在无菌操作台中，对镊子进行酒精灯消毒，在每个双层钵植物***种植4粒大豆种子，种植后立刻盖上双层钵的盖子。

d)等待种子发芽，待长出2.5cm左右，挑选出生长长势大致一样的苗，用120℃高温灭菌后白石子，冷却后，放置在双层钵植物生长***上，一方面为了减少水分的过度流失，一方面为了放置其他菌的侵染。每过一段时间，注意观察***内营养液的消耗量，即时补上。

(2)制备接种菌液：

a)从冰箱中取出中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopZ、HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ和HH103ΩTtsI，准备好相应抗性的TY固体培养基，对每个菌株进行划线，在28℃培养箱中进行培养直至长出单克隆，挑选出单克隆，分别放入其抗性的液体培养基中继续培养活化，OD₆₀₀为0.6-0.8左右。

b)每种菌液取出200μL，继续放入相应抗性的液体培养基中培养活化，OD₆₀₀为0.65-0.85左右。

c)提前准备好灭过的硫酸镁溶液(10mM)，将菌液进行离心4000rpm，10min，每次用20mL硫酸镁溶液进行重悬洗菌重复4次。

d)对硫酸镁溶液(10mM)重悬后的菌液测量OD值，保证每种菌液的OD值大致相同，准备接种大豆(完成后立刻接菌)。

(3)接种菌液及性状调查：

a)等待双层钵植物生长***中的大豆苗生长至对生真叶，完全展开时(生长1周左右)，用2mL注射器对大豆苗进行接菌，确保接菌数量一致，30d后对大豆性状进行调查统计。

b)调查方法：对绥农14和野生豆ZYD00006的大豆单株及接种不同菌液进行分类性状调查。结瘤性状包含(数目、结瘤大小以2mm为区分、干重等)。

(4)结瘤表型分析：接种中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopZ、HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ和HH103ΩTtsI(效应因子不表达突变体)30天后，分析统计其根瘤数目与瘤干重。

结果：对本实验室构建的导入系群体父母本绥农14和野生豆ZYD00006作为结瘤能力鉴定的材料，在双层钵植物生长营养***中种植，大豆植株Vc期时进行根瘤菌接种回补菌株HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ、中华根瘤菌HH103、突变体HH103ΩNopZ和HH103ΩTtsI。接种一个月后对结瘤性状进行统计分析。如图5、表1和表2所示。与中华根瘤菌HH103和HH103ΩTtsI相比，NopZ突变能够引起根瘤数目的显著较少，也能够引起根瘤干重的显著降低。接种回补菌株HH103ΩNopZpFAJ1702-NopZ后，根瘤数目与根瘤干重均增加，但不超过中华根瘤菌HH103和HH103ΩTtsI。

表1导入系父母本接种不同菌株后的根瘤数目

表2导入系父母本接种不同菌株后的根瘤干重

注：*表示在p<0.05水平差异显著

实施例2.减少大豆根瘤数量的试剂

试剂的成分：突变体HH103ΩNopZ菌液。

使用方法：

(1)将突变体HH103ΩNopZ进行培养活化，控制OD600为0.65-0.86；

(2)将步骤(1)得到的菌液进行4000rpm，10min离心，用10mM的硫酸镁溶液进行重悬洗菌重复4次；将硫酸镁溶液重悬后的菌液OD₆₀₀＝0.2；

(3)大豆苗生长至对生真叶期，对大豆苗进行接菌，接菌数量为大于2×10⁵个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。

该试剂或该方法还可用于大豆育种，降低结瘤数目，减少共生固氮消耗的能量，保证大豆产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种根瘤菌HH103Ω突变体及其应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

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ccgtgcgata gttgtggtt 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcacctccca aatcccaaa 19

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggagacggtc ggatggaatt cgcgtttgac ctcgtg 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

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<400> 4

cacgaggtca aacgcgaatt ccatccgacc gtctcc 36

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工合成

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actagtagta aactggatgg ctttcttg 28

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

actagtcttc agcatctttt actttcac 28

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tgctctagac cgtgcgatag ttgtggtt 28

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccccccgggt cacctcccaa atcccaaa 28

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgatggcaca ggcgat 16

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<212> DNA

<213> 人工合成

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acaggcttat cttggaca 18

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<212> DNA

<213> 人工合成

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cccaagcttc gtgcgatgcg cgagata 27

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<211> 27

<212> DNA

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cgcggatcct taccggaact cgttgcg 27

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gcacgaaccc agtggacata agcctcgttc ggttcgtaag ctgtaatgca agtagcgtaa 60

ctgccgtcac gcaactggtc cagaaccttg accgaacgca gcggtggtaa cggcgcagtg 120

gcggttttca tggcttgtta tgactgtttt tttggggtac agtctatgcc tcgggcatcc 180

aagcagcaag cgcgttacgc cgtgggtcga tgtttgatgt tatggagcag caacgatgtt 240

acgcagcagg gcagtcgccc taaaacaaag ttaaacatca tgggggaagc ggtgatcgcc 300

gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg 360

ttgctggccg tacatttgta cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat 420

attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc 480

aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa 540

gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg 600

caatttggag aatggcagcg caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc 660

gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt 720

ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat 780

gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg 840

cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc 900

gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct 960

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gaatttgtcc actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata atgtctagct 1080

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cgtgcataat aagccctaca caaattggga gatatatcat g 1241

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ctactgcggt gctgctat 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

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Claims

1.一种减少大豆根瘤的方法，其特征在于，在大豆苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）HH103的突变体的菌液，接菌数量为大于2×10⁵个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天，所述突变体是以费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）HH103为出发菌株，将出发菌株中的NopZ基因缺失或者沉默得到的，所述NopZ基因的核苷酸序列如Genbank 登录号AY683479.1所示序列的第7381bp-7917bp。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌液按如下方法制备：

（1）将费式中华根瘤菌HH103的突变体培养活化，控制OD₆₀₀为0.65-0.86；所述突变体是以费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）HH103为出发菌株，将出发菌株中的NopZ基因缺失或者沉默得到的，所述NopZ基因的核苷酸序列如Genbank 登录号AY683479.1所示序列的第7381bp-7917bp；

（2）将步骤（1）得到的菌液离心，收集菌体并洗涤，再用硫酸镁溶液重悬菌体，使菌液OD₆₀₀达到0.2。

3.含有根瘤菌HH103的突变体的试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，其特征在于，所述试剂适用的大豆品种为绥农14或野生豆ZYD00006，所述突变体是以费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）HH103为出发菌株，将出发菌株中的NopZ基因缺失或者沉默得到的，所述NopZ基因的核苷酸序列如Genbank 登录号AY683479.1所示序列的第7381bp-7917bp。

4.含有根瘤菌HH103的突变体的试剂或权利要求1或2所述的方法在大豆育种中的应用，其特征在于，所述突变体是以费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii ）HH103为出发菌株，将出发菌株中的NopZ基因缺失或者沉默得到的，所述NopZ基因的核苷酸序列如Genbank 登录号AY683479.1所示序列的第7381bp-7917bp。