CN113215187A - 一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，基于Badh2基因的序列特征，设计靶序列，构建CRISPR/Cas9‑Badh2基因编辑载体，转化不香的水稻材料，对基因组编辑材料编辑位点的鉴定和T‑DNA序列的PCR检测，获得无T‑DNA的香稻材料。本发明利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因，获得无T‑DNA的香稻材料，具有简单便捷、快速高效的特点，对水稻香味品质改良育种具有指导意义。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种、作物新资源创新领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法。
背景技术
香味是优质稻米的一个重要指标。稻米中的香味物质有很多种，其中最重要的是2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2-AP)。香味的遗传主要受1对隐性基因控制。Bradbury等利用图位克隆法分离克隆了香味基因fgr，其编码了甜菜碱乙醛脱氢酶2(betaine aldehyde dehydrogenase，BAD2)。Chen等的研究发现其功能丧失的隐性等位基因badh2-E2和badh2-E7均能引起2-AP积累而导致香味产生。随后，Kovach等深入分析了该香味基因的起源及进化关系，发现了8种隐性等位基因，其中badh2.1是香稻中普遍存在的优势等位基因，并且首先起源于粳稻，后来才导入到籼稻。最近的研究发现2-AP的积累与脯氨酸的含量呈正相关性，因此，Keyghobad等通过过量表达合成脯氨酸的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase)编码基因OsP5CS，使2-AP的含量提高了2倍。此外，除了遗传调控外，添加锌、镧金属离子和外源2-AP以及改善栽培条件如土壤和收获时间等环境因素都能不同程度地影响2-AP的含量。因此，米香不仅是食味品质的重要指标，从代谢调控角度来看，其与氨基酸代谢关系密切。
基因组编辑技术是一种在基因组水平上对DNA序列进行靶向修饰的遗传操作技术。CRISPR/Cas9是近几年发展起来的一类基因编辑技术。CRISPR/Cas基因编辑***的发现源自于对细菌的免疫***的研究，最早是日本科学家Nakata等在研究大肠杆菌时发现的一种特定的重复序列，但当时他们还不清楚其具体功能。后来人们发现这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中，随后科学家正式将其定义为CRISPR (Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)。2005年，多个研究团队发现CRISPR间隔序列与噬菌体或质粒等外源DNA序列高度同源。2007年，Barrangou等发现改变CRISPR中的重复序列能调节嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)对噬菌体的抗性，证实CRISPR/Cas***使细菌通过获取噬菌体DNA片段形成“记忆”，从而使细菌获得再次遭到同一噬菌体入侵时对其免疫的能力。随着CRISPR/Cas9技术的不断完善和成熟，该技术已经在微生物、动物和植物等领域广泛应用。利用CRISPR/Cas9技术，科研工作者已经实现了在水稻、拟南芥、烟草、玉米、小麦、高粱、大豆、番茄等植物进行基因组编辑。Shan等利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsPDS-P1和OsBADH2基因进行编辑，开启了CRISPR/Cas9技术在水稻基因编辑中的先河。目前，CAO1、PDS、PMS3、AOX1、Waxy等水稻重要功能基因已经成功实现编辑。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，所述方法为设计用于编辑Badh2基因的sgRNA识别位点的靶序列，将其构建CRISPR/Cas9-Badh2基因编辑载体，将该载体转化水稻获得无T-DNA的香稻材料。
其中，所述sgRNA识别位点的靶序列为5’-AGCTCTTCGTCGCCGGCGAG-3’。
其中，所述CRISPR/Cas9-Badh2基因编辑载体构建的方法如下：
A)靶点接头制备：采用接头引物用TE溶解成母液，母液稀释后90℃30s，移至室温冷却完成退火，即获得靶点接头；
B)sgRNA连接产物制备：采用pYLsgRNA-OsU3中间载体、靶点接头、DNA连接酶、BsaI进行PCR扩增获得sgRNA连接产物；
C)扩增sgRNA表达盒：以引物组合正向引物U-F、反向引物sgRNA-R对sgRNA连接产物进行第一轮PCR扩增获得第一轮PCR产物，然后以Uctcg-B1和gRcggt-BL为扩增引物对稀释后的第一轮PCR产物进行第二轮PCR，获得的PCR产物即为sgRNA表达盒；
D)将sgRNA表达盒连接到CRISPR/Cas9表达载体上，获得连接产物；
E)将步骤D)的连接产物进行热激发转化大肠杆菌获得重组菌，提取通过验证的含目的条带的菌液的阳性质粒即得。
其中，所述步骤A)接头引物为：
Bh2-U3-F：5’-ggcAGCTCTTCGTCGCCGGCGAG-3’；
Bh2-U3-R：5’-aaacCTCGCCGGCGACGAAGAGC-3’。
其中，所述步骤C)中的
正向引物U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；
反向引物gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；
所述引物Uctcg-B1：TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3；
所述引物gRcggt-BL：AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3。
其中，所述方法包括将步骤E)中获得的含有目的条带的CRISPR/Cas9基因编辑载体转入农杆菌EHA105，转化水稻，获得T0代转基因植株，以引物F20和R15对T0代转基因植株进行扩增并测序鉴定获得Badh2基因发生突变的植株。
其中，所述引物F20为5’-AGCGGCAAGACTATCCTCGACT-3’；所述引物R15为5’-GCACCGACACGCAAA-3’。
其中，所述方法还包括将含有Badh2基因突变的T0代转基因植株的T1代植株的T-DNA载体的剔除，所述T-DNA载体包括潮霉素磷酸转移酶基因HPT、核酸酶基因Cas9和sgRNA编码基因。
其中，所述T-DNA载体的剔除通过对含有Badh2基因突变的T1代植株的HPT基因、Cas9基因和sgRNA编码基因同时检测，重复多次，筛选得到不携带这三个基因的T1代单株即为目标植株。
其中，所述HPT基因检测方法通过以Badh2基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以hyg283-F和hyg283-R为引物进行PCR扩增，同时，所述Cas9基因检测方法通过以Badh2基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以Cas9T-F和Cas9T-R为引物进行PCR扩增，同时，所述sgRNA编码基因检测方法通过以Badh2基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以pYLU3-F和pYLsgRNA-R为引物进行PCR扩增，当均未同时检测到HPT基因、Cas9基因和sgRNA编码基因，表明这成功剔除了T-DNA。
其中，所述引物hyg283-F：5’-TCCGGAAGTGCTTGACATT-3’，引物hyg283-R：5’-GTCGTCCATCACAGTTTGC-3’，所述引物Cas9T-F：5’-AGCGGCAAGACTATCCTCGACT-3’，引物Cas9T-R：5’-TCAATCCTCTTCATGCGCTCCC-3’，sgRNA编码基因引物pYLU3-F：5’-CGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’，引物pYLsgRNA-R：5’-AGTTGATAACGGACTAGCCTT-3’)。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法。该方法简单易操作、便捷快速，可以高效地获得无T-DNA的香稻材料，为获得无T-DNA的香稻育种提供了方法，对于水稻香味品质改良育种具有重要的指导意义。
附图说明
图1 Badh2基因结构及靶序列示意图；
图2载体测序验证；
图3质粒图谱；
图4构建载体T-DNA区图谱；
图5 T1代基因组编辑植株Hpt基因的PCR鉴定；
M为DL2000 Marker(条带从上至下分别为，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；1-81为T1代基因编辑植株，泳道82为以携带T-DNA的阳性质粒为模板的阳性对照，泳道83为野生型，泳道84为无菌水为模板的阴性对照；
图6 T1代基因组编辑植株Cas9基因的PCR鉴定；
M为DL2000 Marker(条带从上至下分别为，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；1-81为T1代基因编辑植株，泳道82为以携带T-DNA的阳性质粒为模板的阳性对照，泳道83为野生型，泳道84为无菌水为模板的阴性对照；
图7 T1代基因组编辑植株sgRNA编码基因的PCR鉴定；
M为DL2000 Marker(条带从上至下分别为，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；1-81为T1代基因编辑植株，泳道82为以携带T-DNA的阳性质粒为模板的阳性对照，泳道83为野生型，泳道84为无菌水为模板的阴性对照；
图8基因组编辑株系核酸序列比对；
图9基因组编辑株系氨基酸序列比对。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。涉及的引物均在南京擎科生物科技有限公司合成。
实施例1：基因组编辑材料的获得过程
1、靶点接头的设计
根据CRISPR/Cas9识别靶位点的识别特点，选取Badh2基因CDS区第26～45bp为靶序列(序列为5’-AGCTCTTCGTCGCCGGCGAG-3’，图1)，接头引物如下：
Bh2-U3-F：5’-ggcAGCTCTTCGTCGCCGGCGAG-3’；
Bh2-U3-R：5’-aaacCTCGCCGGCGACGAAGAGC-3’；
靶序列由OsU3基因启动子驱动。
2、pYLCRISPR/Cas9-Badh2基因编辑载体构建
基因编辑载体构建参考Mao等(Mao Y，et al.，Mol Plant，2013，6(6)：2008-2011.)报道方法，按以下步骤进行：
(1)靶点接头制备
将接头引物(Bh2-U3-F：5’-ggcAGCTCTTCGTCGCCGGCGAG-3’；Bh2-U3-R：5’-aaacCTCGCCGGCGACGAAGAGC-3’)用1x TE(PH8.0)溶解成100μM母液，各取1μl加入到98μl0.5x TE混合稀释到1μM。约90℃ 30s，移至室温冷却完成退火，即获得靶点接头。
(2)sgRNA表达盒制备
按以下反应体系进行PCR扩增：
注：T4 DNA ligase及10x DNA ligase buffer购于Takara，BsaI购于NEB。
PCR反应程序为37℃5min，20℃5min，5个循环。获得的PCR产物即为sgRNA连接产物。
pYLsgRNA-OsU3为中间载体，为sgRNA表达盒提供启动子和引导序列骨架，由华南农业大学刘耀光教授团队开发(Ma X，Zhang Q，Zhu Q，et al.A robust CRISPR/Cas9system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot anddicot plants.Mol Plant，2015，8(8)：1274-1284.)。
(3)扩增sgRNA表达盒
以引物组合正向引物U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’和反向引物gRNA-R：5'-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’，按照以下反应体系进行PCR扩增：
其中，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP Mix和2×PrimeSTAR GC Buffer均购于Takara。在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行PCR。PCR反应程序：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃20s，10个循环；95℃10s，60℃15s，68℃30s，22个循环；4℃保存。
以Uctcg-B1’：TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3；gRcggt-BL：AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3为扩增引物，按以下反应体系进行PCR扩增：
在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行PCR。PCR反应程序：95℃10s，60℃15s，68℃20s，25个循环；4℃保存。获得的PCR产物即为sgRNA表达盒。
(4)sgRNA表达盒连接pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体
按以下反应体系和过程，在Eppendorf Mastercycle热循环仪中，将sgRNA表达盒连接pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体，获得连接产物。
反应体系及过程：
pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体为植物双元表达载体，由华南农业大学刘耀光教授团队开发(Ma X，Zhang Q，Zhu Q，et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants.MolPlant，2015，8(8)：1274-1284.)
(5)转化大肠杆菌DH5α及验证
将连接产物用热激法(42℃)转化大肠杆菌DH5α，菌液涂布于含有50mg/l卡那霉素的LB平板上，培养约12h。挑取平板上长出的单菌落，摇菌扩繁。以菌液为模板进行PCR验证。
PCR反应体系为：
Taq DNA聚合酶购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行PCR。PCR反应程序：95℃10min；95℃30s，51℃30s，72℃45s，28个循环；72℃5min；4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像仪拍照并记录结果。提取PCR检测含目的条带的菌液的质粒，送往英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果表明，所构建的CRISPR/Cas9-Badh2载体序列正确无误，如图2所示。
CRISPR/Cas9-Badh2载体图谱见图3，T-DNA区域图谱见图4。
(6)T0代基因组编辑植株的获得
将CRISPR/Cas9-Badh2载体转入农杆菌EHA105。采用常规农杆菌介导法转化水稻日本晴，T0代基因组编辑植株。
实施例2：无T-DNA植株的获得及Badh2基因敲除分析
在培养箱中种植T0代基因组编辑植株，自交结实，收获种子。待种子破休眠后，浸种，播种于秧盘中，放置在培养室中，待苗长至两叶一心时，参考Murray等的CTAB方法，按单株提取植株的基因组DNA(Murray M G，et al.，NucleicAcids Research，1980，8(19)：4321-4326)。以编码潮霉素的Hpt基因引物(hyg283-F：5’-TCCGGAAGTGCTTGACATT-3’，hyg283-R：5’-GTCGTCCATCACAGTTTGC-3’)、编码Cas9核酸酶的Cas9基因引物(Cas9T-F：5’-AGCGGCAAGACTATCCTCGACT-3’，Cas9T-R：5’-TCAATCCTCTTCATGCGCTCCC-3’)和sgRNA编码基因引物(pYLU3-F：5’-CGTCTTCTACTGGTGCTAC-3’，pYLsgRNA-R：5’-AGTTGATAACGGACTAGCCTT-3’)进行检测。
PCR反应体系为灭菌水2.6μl、引物2.0μl(10pM的前后引物各1.0μl)、稀释过的DNA模板1.0μl、DNA聚合酶KOD-FX 0.4ul、专用buffer缓冲液10μl、dNTPs 4μl。
PCR反应条件为96℃预变性3min；98℃变性100sec、60℃退火30sec、68℃延伸30sec，32个循环；最后68℃延伸5min。
PCR反应在Eppendorf Mastercycle热循环仪中进行。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像仪中拍照，并记录结果。Hpt基因、Cas9基因和sgRNA编码基因的扩增结果分别见图5、图6和图7。
以上检测结果表明，泳道3、11、13、18、28、31、35、39、47、49、50、51、53、55、58、65、73、74、75、76、78、80不携带T-DNA(包括编码潮霉素的Hpt基因、编码Cas9核酸酶的Cas9基因和sgRNA编码基因)，而其它T1代植株仍然携带T-DNA。分别将泳道3、11、13、18、28、31、35、39、47、49、50、51、53、55、58、65、73、74、75、76、78、80对应的单株分别编号为BY1～BY22，这些T1代株系均已成功剔除T-DNA。
为明确植株中是否剔除T-DNA，本发明利用高灵敏度PCR的方法，对T-DNA中重要的三个元件(Hpt、Cas9和sgRNA)进行检测，比之前报道的仅检测T-DNA中一个或两个基因的方法更加可靠。
为了进一步明确BY1～BY22的碱基突变情况，利用特异检测靶位点的引物F20(5’-AGCGGCAAGACTATCCTCGACT-3’)和R15(5’-GCACCGACACGCAAA-3’)进行扩增，并进行测序分析。结果表明，BY1～BY18的Badh2基因编码区序列相同，与野生型Badh2相比，缺失31bp，核苷酸序列如SEQID NO.16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；BY19～BY22的Badh2基因编码区序列相同，与野生型Badh2相比，缺失2bp，核苷酸序列如SEQID NO.18所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。核酸序列比对如图8所示(BY1～BY18以BY1为例)，氨基酸序列比对如图9所示(BY19～BY22以BY19为例)。
实施例3香味表型鉴定
理论上通过敲除Badh2基因，2-乙酰基-1-吡咯啉(2-AP)即可积累，使得稻米具有香味。本发明用咀嚼法鉴定基因组编辑植株的表型。将水稻种子晒干，剥去颖壳，将糙米放入口中，用牙齿咬碎，根据味觉和嗅觉感知稻米香味。每个样品鉴定完均需用清水漱口，以提高鉴定的准确性。经鉴定，BY1～BY22株系的稻米均有香味。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> gRNA-R(Artificial Sequence)
<400> 5
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> Uctcg-B1’(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcagaggtc tctctcgcac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> gRcggt-BL(Artificial Sequence)
<400> 7
agcgtgggtc tcgaccgggt ccatccactc caagctc 37
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> hyg283-F(Artificial Sequence)
<400> 8
tccggaagtg cttgacatt 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> hyg283-R(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcgtccatc acagtttgc 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Cas9T-F(Artificial Sequence)
<400> 10
agcggcaaga ctatcctcga ct 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Cas9T-R(Artificial Sequence)
<400> 11
tcaatcctct tcatgcgctc cc 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> pYLU3-F(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtcttctac tggtgctac 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> pYLsgRNA-R(Artificial Sequence)
<400> 13
agttgataac ggactagcct t 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> F20(Artificial Sequence)
<400> 14
agcggcaaga ctatcctcga ct 22
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> R15(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaccgacac gcaaa 15
<210> 16
<211> 1481
<212> DNA
<213> BY1~BY18的Badh2基因的cDNA序列(Badh2)
<400> 16
atggccacgg cgatcccgca gcggcagctc ttcgtcgccg cctccccgtc gtcaaccccg 60
ccaccgagtc ccccatcggc gagatcccgg cgggcacggc ggaggacgtg gacgcggcgg 120
tggcggcggc gcgggaggcg ctgaagagga accggggccg cgactgggcg cgcgcgccgg 180
gcgccgtccg ggccaagtac ctccgcgcaa tcgcggccaa gataatcgag aggaaatctg 240
agctggctag actagagacg cttgattgtg ggaagcctct tgatgaagca gcatgggaca 300
tggacgatgt tgctggatgc tttgagtact ttgcagatct tgcagaatcc ttggacaaaa 360
ggcaaaatgc acctgtctct cttccaatgg aaaactttaa atgctatctt cggaaagagc 420
ctatcggtgt agttgggttg atcacacctt ggaactatcc tctcctgatg gcaacatgga 480
aggtagctcc tgccctggct gctggctgta cagctgtact aaaaccatct gaattggctt 540
ccgtgacttg tttggagctt gctgatgtgt gtaaagaggt tggtcttcct tcaggtgtgc 600
taaacatagt gactggatta ggttctgaag ccggtgctcc tttgtcatca caccctggtg 660
tagacaaggt tgcatttact gggagttatg aaactggtaa aaagattatg gcttcagctg 720
ctcctatggt taagcctgtt tcactggaac ttggtggaaa aagtcctata gtggtgtttg 780
atgatgttga tgttgaaaaa gctgttgagt ggactctctt tggttgcttt tggaccaatg 840
gccagatttg cagtgcaaca tcgcgtctta ttcttcataa aaaaatcgct aaagaatttc 900
aagaaaggat ggttgcatgg gccaaaaata ttaaggtgtc agatccactt gaagagggtt 960
gcaggcttgg gcccgttgtt agtgaaggac agtatgagaa gattaagcaa tttgtatcta 1020
ccgccaaaag ccaaggtgct accattctga ctggtggggt tagacccaag catctggaga 1080
aaggtttcta tattgaaccc acaatcatta ctgatgtcga tacatcaatg caaatttgga 1140
gggaagaagt ttttggtcca gtgctctgtg tgaaagaatt tagcactgaa gaagaagcca 1200
ttgaattggc caacgatact cattatggtc tggctggtgc tgtgctttcc ggtgaccgcg 1260
agcgatgcca gagattaact gaggagatcg atgccggaat tatctgggtg aactgctcgc 1320
aaccctgctt ctgccaagct ccatggggcg ggaacaagcg cagcggcttt ggacgcgagc 1380
tcggagaagg gggcattgac aactacctaa gcgtcaagca agtgacggag tacgcctccg 1440
atgagccgtg gggatggtac aaatcccctt ccaagctgta a 1481
<210> 17
<211> 47
<212> PRT
<213> BY1~BY18的Badh2基因编码的氨基酸序列(Badh2)
<400> 17
Met Ala Thr Ala Ile Pro Gln Arg Gln Leu Phe Val Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ala
20 25 30
Arg Arg Arg Thr Trp Thr Arg Arg Trp Arg Arg Arg Gly Arg Arg
35 40 45
<210> 18
<211> 1510
<212> DNA
<213> BY19~BY22的Badh2基因的cDNA序列(Badh2)
<400> 18
atggccacgg cgatcccgca gcggcagctc ttcgtcgccg gagtggcgcg cccccgcgct 60
cggccgccgc ctccccgtcg tcaaccccgc caccgagtcc cccatcggcg agatcccggc 120
gggcacggcg gaggacgtgg acgcggcggt ggcggcggcg cgggaggcgc tgaagaggaa 180
ccggggccgc gactgggcgc gcgcgccggg cgccgtccgg gccaagtacc tccgcgcaat 240
cgcggccaag ataatcgaga ggaaatctga gctggctaga ctagagacgc ttgattgtgg 300
gaagcctctt gatgaagcag catgggacat ggacgatgtt gctggatgct ttgagtactt 360
tgcagatctt gcagaatcct tggacaaaag gcaaaatgca cctgtctctc ttccaatgga 420
aaactttaaa tgctatcttc ggaaagagcc tatcggtgta gttgggttga tcacaccttg 480
gaactatcct ctcctgatgg caacatggaa ggtagctcct gccctggctg ctggctgtac 540
agctgtacta aaaccatctg aattggcttc cgtgacttgt ttggagcttg ctgatgtgtg 600
taaagaggtt ggtcttcctt caggtgtgct aaacatagtg actggattag gttctgaagc 660
cggtgctcct ttgtcatcac accctggtgt agacaaggtt gcatttactg ggagttatga 720
aactggtaaa aagattatgg cttcagctgc tcctatggtt aagcctgttt cactggaact 780
tggtggaaaa agtcctatag tggtgtttga tgatgttgat gttgaaaaag ctgttgagtg 840
gactctcttt ggttgctttt ggaccaatgg ccagatttgc agtgcaacat cgcgtcttat 900
tcttcataaa aaaatcgcta aagaatttca agaaaggatg gttgcatggg ccaaaaatat 960
taaggtgtca gatccacttg aagagggttg caggcttggg cccgttgtta gtgaaggaca 1020
gtatgagaag attaagcaat ttgtatctac cgccaaaagc caaggtgcta ccattctgac 1080
tggtggggtt agacccaagc atctggagaa aggtttctat attgaaccca caatcattac 1140
tgatgtcgat acatcaatgc aaatttggag ggaagaagtt tttggtccag tgctctgtgt 1200
gaaagaattt agcactgaag aagaagccat tgaattggcc aacgatactc attatggtct 1260
ggctggtgct gtgctttccg gtgaccgcga gcgatgccag agattaactg aggagatcga 1320
tgccggaatt atctgggtga actgctcgca accctgcttc tgccaagctc catggggcgg 1380
gaacaagcgc agcggctttg gacgcgagct cggagaaggg ggcattgaca actacctaag 1440
cgtcaagcaa gtgacggagt acgcctccga tgagccgtgg ggatggtaca aatccccttc 1500
caagctgtaa 1510
<210> 19
<211> 89
<212> PRT
<213> BY19~BY22的Badh2基因编码氨基酸序列(Badh2)
<400> 19
Met Ala Thr Ala Ile Pro Gln Arg Gln Leu Phe Val Ala Gly Val Ala
1 5 10 15
Arg Pro Arg Ala Arg Pro Pro Pro Pro Arg Arg Gln Pro Arg His Arg
20 25 30
Val Pro His Arg Arg Asp Pro Gly Gly His Gly Gly Gly Arg Gly Arg
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Glu Glu Glu Pro Gly Pro Arg
50 55 60
Leu Gly Ala Arg Ala Gly Arg Arg Pro Gly Gln Val Pro Pro Arg Asn
65 70 75 80
Arg Gly Gln Asp Asn Arg Glu Glu Ile
85
Claims (10)
1.一种利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述方法为设计用于编辑Badh2基因的sgRNA识别位点的靶序列，将其构建CRISPR/Cas9-Badh2基因编辑载体，将该载体转化水稻获得无T-DNA的香稻材料。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述sgRNA识别位点的靶序列为5’- AGCTCTTCGTCGCCGGCGAG -3’。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9-Badh2基因编辑载体构建的方法如下：
A）靶点接头制备：采用接头引物用TE溶解成母液，母液稀释后90 oC 30s，移至室温冷却完成退火，即获得靶点接头；
B）sgRNA连接产物制备：采用pYLsgRNA-OsU3中间载体、靶点接头、DNA连接酶、BsaI进行PCR扩增获得sgRNA连接产物；
C）扩增sgRNA表达盒：以引物组合正向引物U-F、反向引物sgRNA-R对sgRNA连接产物进行第一轮PCR扩增获得第一轮PCR产物，然后以Uctcg-B1和 gRcggt-BL为扩增引物对稀释后的第一轮PCR产物进行第二轮PCR，获得的PCR产物即为sgRNA表达盒；
D）将sgRNA表达盒连接到CRISPR/Cas9表达载体上，获得连接产物；
E）将步骤D）的连接产物进行热激发转化大肠杆菌获得重组菌，提取通过验证的含目的条带的菌液的阳性质粒即得。
4.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述步骤A)接头引物为：
Bh2-U3-F: 5’- ggcAGCTCTTCGTCGCCGGCGAG -3’；
Bh2-U3-R: 5’- aaacCTCGCCGGCGACGAAGAGC -3’；
所述步骤C) 中的
正向引物U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；
反向引物gRNA-R：5’–CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；
所述引物Uctcg-B1：TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3；
所述引物gRcggt-BL: AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3。
5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述方法包括将步骤E）中获得的含有目的条带的CRISPR/Cas9基因编辑载体转入农杆菌EHA105，转化水稻，获得T0代转基因植株，以引物F20和R15对T0代转基因植株进行扩增并测序鉴定获得Badh2基因发生突变的植株。
6.根据权利要求5所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述引物F20为5’-AGCGGCAAGACTATCCTCGACT -3’；
所述引物R15为5’-GCACCGACACGCAAA -3’。
7.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述方法还包括将含有Badh2基因突变的T0代转基因植株的T1代植株的T-DNA载体的剔除，所述T-DNA载体包括潮霉素磷酸转移酶基因HPT、核酸酶基因Cas9和sgRNA编码基因。
8.根据权利要求7所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述T-DNA载体的剔除通过对含有Badh2基因突变的T1代植株的HPT基因、Cas9基因和sgRNA编码基因同时检测，重复多次，筛选得到不携带这三个基因的T1代单株即为目标植株。
9.根据权利要求8所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述HPT基因检测方法通过以Badh2基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以hyg283-F和hyg283-R为引物进行PCR扩增，同时，所述Cas9基因检测方法通过以Badh2基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以Cas9T-F和Cas9T-R为引物进行PCR扩增，同时，所述sgRNA编码基因检测方法通过以Badh2基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以pYLU3-F和pYLsgRNA-R为引物进行PCR扩增，当均未同时检测到HPT基因、Cas9基因和sgRNA编码基因，表明这成功剔除了T-DNA。
10.根据权利要求9所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得香稻材料的方法，其特征在于，所述引物hyg283-F：5’- TCCGGAAGTGCTTGACATT -3’， 引物hyg283-R：5’-GTCGTCCATCACAGTTTGC -3’，所述引物Cas9T-F：5’- AGCGGCAAGACTATCCTCGACT -3’， 引物Cas9T-R： 5’- TCAATCCTCTTCATGCGCTCCC -3’， sgRNA编码基因引物pYLU3-F: 5’-CGTCTTCTACTGGTGCTAC -3’， 引物pYLsgRNA-R: 5’- AGTTGATAACGGACTAGCCTT -3’）。
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2020
- 2020-01-21 CN CN202010073253.7A patent/CN113215187A/zh active Pending
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