CN107298702A

CN107298702A - 一种水稻粒型相关蛋白及其编码基因

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Publication number: CN107298702A
Application number: CN201710674542.0A
Authority: CN
Inventors: 钦鹏; 李仕贵; 胡彬华; 张国华; 陈微兰; 涂斌; 马炳田; 王玉平
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107298702B

Abstract

本发明公开了一种水稻粒型相关蛋白，属于水稻基因工程领域。该蛋白由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成；其编码基因由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了通过基因编辑***敲除该基因培育大粒水稻品种的方法。本发明为大粒水稻品种的培育提供了一种新的有效途径，即通过基因编辑方法对水稻粒型相关基因进行调控，从而获得大粒水稻品种；其次，本发明粒型调控基因调控效果好，与野生型相比，水稻粒长、粒宽明显增加，可以显著提高水稻产量，在水稻杂种优势利用中具有广阔的应用前景。

Description

一种水稻粒型相关蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于水稻基因工程领域，具体涉及一种水稻粒型相关蛋白，还涉及编码该蛋白的基因。

背景技术

随着全球人口增长、工业化导致的耕地减少和环境污染加剧，粮食短缺一直是严重的问题。提高粮食单产是解决粮食短缺问题的主要途径。水稻产量取决于三个因素，即单位面积上穗数、每穗粒数和粒重。水稻粒型是粒重的决定因子，通常粒长越长，粒宽越宽，籽粒就越重，水稻产量也就越高；同时粒型也是水稻品质的重要决定因素。

随着分子生物学技术的发展，通过对基因的调控达到遗传改良的目的，已经成为性状改良的一个重要途径。目前，一些与水稻粒型相关基因已被定位和克隆，如GS3(Fan等,Theoretical and Applied Genetics,2006,112(6):1164-1171.)、GW2(Song等,Naturegenetics,2007,39(5):623-630.)、GW5(Weng等,Cell research,2008,18(12):1199-1209.)、GS5(Li等,Nature genetics,2011,43(12):1266-1269.)、GW8(Wang等,Naturegenetics,2012,44(8):950-954.)、GL7/qGW7(Wang等,Nature genetics,2015,47(8):949-954.Wang et al,Nature genetics,2015,47(8):944-948.)和GS2(Hu J等,MolecularPlant,2015,8(10):1455.)等。但是，控制这些性状相关的遗传机理与蛋白水平的复杂调控之间的关系尚不清楚，难以在实践中应用。

发明内容

本发明人在对EMS诱变的水稻R527突变体库筛选过程中，意外获得了一个大粒突变体，本发明是在此意外发现的基础上研究形成的。本发明目的在于提供一种水稻粒型相关蛋白。

本发明另一目的在于提供上述蛋白在控制水稻粒型、提高水稻粒重或产量方面的用途。

本发明第三目的在于提供编码上述水稻粒型相关蛋白的基因。

本发明第四目的在于提供上述基因在控制水稻粒型、提高水稻粒重或产量方面的用途。

本发明第五目的在于提供用于敲除上述基因的靶点序列。

本发明第六目的在于提供用于敲除上述基因的sgRNA。

本发明第七目的在于提供通过敲除上述基因培育大粒水稻品种的方法。

本发明第八目的在于提供用于检测敲除上述基因的转基因植物的引物对。

本发明第九目的在于提供用于检测敲除上述基因的转基因植物的试剂盒。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明一种水稻粒型相关蛋白，命名为LG2，所述的蛋白如下：

(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成；

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过添加、取代或缺失一个或几个氨基酸残基而衍生的、且具有控制水稻粒型功能的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明还提供了上述蛋白在控制水稻粒型上的应用。

上述应用中所述的水稻粒型是指水稻粒长、粒宽。

本发明还提供了上述蛋白在提高水稻粒重或产量上的应用。

本发明还提供了编码上述水稻粒型相关蛋白的基因，命名为LG2，所述的基因具有如下的核苷酸序列：

(a)由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成；

(b)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过添加、取代或缺失一个或几个碱基而生成的，并编码控制水稻粒型功能蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供了上述基因在控制水稻粒型上的应用。

上述应用中所述的粒型是指水稻粒长、粒宽。

本发明还提供了上述基因在提高水稻粒重或产量上的应用。

本发明还提供了用于敲除上述基因的靶点序列，所述的靶点序列由SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列组成；即

5’-GACGCGGCGCAGACGTTCG-3’(SEQ ID NO.6)。

本发明还提供了用于敲除上述基因的sgRNA，所述的sgRNA的靶点序列由SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列组成。

本发明还提供了通过敲除上述基因培育大粒水稻品种的方法，所述的敲除水稻LG2基因是通过CRISPR/Cas9***实现的；所述的LG2基因由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。

上述方法中所述的CRISPR/Cas9***中，其sgRNA的靶点序列是SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

本发明还提供了用于检测敲除上述基因的转基因植物的引物对，所述的引物对由LG2-F和LG2-R组成；其中所述的LG2-F由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成；所述的LG2-R由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成；即：

LG2-F:5’-TCACCTCGTTCAAGCACTCCT-3’(SEQ ID NO.4)；

LG2-R:5’-CACGACGAGGAGGTAGTTGATG-3’(SEQ ID NO.5)。

本发明还提供了用于检测敲除上述基因的转基因植物的试剂盒，包括由LG2-F和LG2-R组成的引物对；其中所述的LG2-F由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成；所述的LG2-R由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成。

上述试剂盒还包括：10×KOD buffer 2.5μL，2×GC buffer I 12.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.5μL，Mg²⁺1μL，KOD plus(酶)0.25μL，ddH₂O 1.1μL。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明为大粒水稻品种的培育提供了一种新的有效途径，即通过基因编辑方法对水稻粒型相关基因进行调控，从而获得大粒水稻品种；(2)本发明粒型调控基因调控效果好，与野生型相比，水稻粒长、粒宽明显增加，可以显著提高水稻产量，在水稻杂种优势利用中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.为水稻R527和大粒突变体lg2的籽粒照片。

图2.为水稻R527和大粒突变体lg2籽粒长度(平均数)柱形图。

图3.为水稻R527和大粒突变体lg2籽粒宽度(平均数)柱形图。

图4.是用MutMap定位方法将LG2基因定位于水稻第3染色体上以及候选基因突变方式示意图。

图5.候选基因LG2的CRISPR/Cas9敲除表达载体的结构示意图。

图6.候选基因LG2遗传互补载体的结构示意图。

图7.是Nip(野生型日本晴)背景LG2cas9敲除转基因材料T₀代植株PCR扩增产物电泳图谱；其中1-8为敲除LG2基因的材料T₀代不同的株系。

图8.为图7中PCR扩增产物的部分测序结果；其中Nip为日本晴；lg2-1和lg2-2分别为敲除LG2转基因材料T0代植株中两种不同敲除突变体。

图9.为水稻Nip(野生型日本晴)和敲除突变体lg2-1和lg2-2的籽粒照片。

图10.水稻Nip(野生型日本晴)和敲除突变体lg2-1和lg2-2的籽粒长度(平均数)柱形图。

图11.水稻Nip(野生型日本晴)和敲除突变体lg2-1和lg2-2的籽粒宽度(平均数)柱形图。

图12.pCAMBIA1300-LG2转化lg2突变体互补转基因的潮霉素检测电泳图谱；其中1-9为T0代不同的转基因株系。

图13.LG2互补阳性转基因植株籽粒照片；其中R527是野生型，lg2是突变体，lg2-C是互补阳性转基因材料。

图14.LG2互补转基因植株籽粒长度柱形图；其中R527是野生型，lg2是突变体，lg2-C是互补阳性转基因材料。

图15.LG2互补转基因植株籽粒宽度柱形图；其中R527是野生型，lg2是突变体，lg2-C是互补阳性转基因材料。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的解释和说明，但是并不用于限定本发明。下述实施例中的方法如非特别说明，均为本领域的常规方法；所用的试剂，均为本领域技术人员熟知的常规试剂。

实施例1水稻大粒突变体的分离与遗传分析

本发明人通过对EMS诱变的水稻R527(R527为“蜀恢527”的简称)突变体库的筛选，分离获得了一个大粒水稻突变体，命名为lg2(large grain 2)，连续回交3代后，其表型能稳定遗传，在成熟后表现出籽粒变大的表型(见图1、图2和图3)。

将突变体lg2与其野生型R527杂交，获得F₁代，F₁代籽粒大小表现为中间型(籽粒大小介于lg2和野生型之间)；F₁代自交获得F₂代，利用万深拷种仪测量F₂代群体中单株籽粒的大小，结果发现F₂代群体中单株的粒长表现出典型的QTL双峰分布(即籽粒大小呈连续的分布)；遗传分析结果(见表1)F₂群体中粒长表型的分离比为3:1，说明本发明突变体lg2的粒长由一对隐性基因控制。

表1本发明突变体lg2粒长的遗传分析结果

实施例2：lg2突变基因的定位及候选基因的验证

(1)lg2突变基因的定位：

在实施例1中构建的突变体lg2与其野生型R527杂交的F₂群体中，根据籽粒测量的结果，挑选25个极端粒短与25个极端粒长的单株在发芽盒中进行发芽，形成F₃代幼苗；将25个极端粒短的F₃幼苗等量混合进行DNA的提取，形成显性池；将25个极端粒长的F3幼苗等量混合进行DNA的提取，形成隐性池。将显性池和隐性池DNA分别送北京诺禾致源生物技术有限公司进行重测序，测序结果通过MutMap方法进行定位，定位在第3染色体上，分析结果(见图4)表明第3染色体上只有一个SNP index指数为1的候选基因，即LOC_Os03g12790。

(2)候选基因在F₂群体中的验证：在F₂群体中选取120个大粒的极端水稻植株提取DNA，分别将10个植株的叶片等量混合，形成12个DNA混合池；通过对12个混合DNA进行PCR扩增(BIO-RAD C1000型梯度热循环仪)，测序验证突变位点的真实情况，PCR扩增所用的引物为LG2-F和LG2-R，即：

LG2-F:5’-TCACCTCGTTCAAGCACTCCT-3’(SEQ ID NO.4)；

LG2-R:5’-CACGACGAGGAGGTAGTTGATG-3’(SEQ ID NO.5)。

其中PCR扩增的反应体系(30μl)为：50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl，200μmol/L dNTP，基因组DNA 50-100ng，1个单位的KOD聚合酶和0.1μmol/L引物。PCR扩增程序为：94℃2min；98℃20S，58℃30S，68℃1min，30个循环；68℃5min。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离和Golden View核酸染料进行染色，检测PCR产物，切胶送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序结果用DNAMAN8进行比对分析，结果显示lg2突变体在LOC_Os03g12790基因第784位有一个G碱基突变为A碱基(见图4)，说明lg2突变体的长粒表型是由候选基因LOC_Os03g12790的突变所造成的。

实施例3：本发明与粒型相关基因的预测和序列比对分析

根据实施例2中测序比对的结果，说明LOC_Os03g12790是控制粒型的候选基因，根据该基因的功能注释预测(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，LOC_Os03g12790编码一个多药及有毒化合物外排蛋白的基因。根据实施例2中测序比对的结果，发现在lg2突变体中LOC_Os03g12790基因CDS核苷酸序列的第452位碱基由G变成了A，导致编码色氨酸的密码子变成终止密码子，蛋白编码提前终止，使得该蛋白的功能缺失(见图4)。此外，该基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例4：CRISPR/Cas9基因编辑表达载体和互补载体的构建

(一)CRISPR/Cas9基因编辑表达载体的构建

采用百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒快速构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。

(1)设计靶点序列：在CRISPR/Cas9***的sgRNA在线设计软件网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/-currently the best online solution)输入LG2基因的基因组序列，设计并自动生成gRNA靶点序列，识别序列选择19bp，该靶点序列为：5’-GACGCGGCGCAGACGTTCG-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)合成寡核苷酸序列：将(1)中所得的靶点序列输入到百格基因网站(http:// www.biogle.cn/index/excrispr)下面的对话框，自动生成与试剂盒对应的Oligo寡核苷酸序列Oligo F和Oligo R，寡核苷酸序列由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。所述的寡核苷酸序列为：

Oligo F:5’-TGTGTGGACGCGGCGCAGACGTTCG-3’(SEQ ID NO.7)，

Oligo R:5’-AAACCGAACGTCTGCGCCGCGTCCA-3’(SEQ ID NO.8)。

(3)按照百格CRISPR/Cas载体构建试剂盒所述的方法制备Oligo二聚体。将合成的Oligo加水溶解至10μM，按Buffer Anneal 18μl，Oligo F 1μl，Low Oligo R 1μl反应体系混合，然后在PCR仪上进行：95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，获得Oligo二聚体。将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas9载体。按CRISPR/Cas9Vector 2μl，Oligo二聚体1μl，Enzyme Mix1μl，H₂O 6μl的反应体系在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时，获得LG2基因靶点序列加gRNA连接CRISPR/Cas9载体的连接产物。

(4)将步骤(3)所得的连接产物转化大肠杆菌感受态Trans5α，涂板，挑取4个菌落进行摇菌，提取质粒；将质粒送到成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，测序结果中含有LG2基因靶点序列的质粒,即为LG2基因的CRISPR/Cas9基因编辑表达载体(或称LG2基因敲除表达载体),该表达载体的结构图(见图5)，命名为pCAMBIA1300-U6-LG2cas9。

(二)LG2基因互补载体的构建：

(1)根据LG2基因组序列(包含LG2基因上下游3k长的基因组序列)，设计带有EcoRI和Bam HI双酶切位点的特异引物LG2C-F和LG2C-R，用于扩增包含LG2基因完整的基因组及上游约2kb序列，共约5.0kb的片段，所述的扩增引物LG2C-F和LG2C-R为:

LG2C-F:5’-GGGGTACCAGGCACTGAAATGCTACACGTT-3’(SEQ ID NO.9)，

LG2C-R:5’-CGGGATCCATCAAATGGTTGCGACTTTATCA-3’(SEQ ID NO.10)。

(2)以R527基因组DNA为模板，以LG2C-F和LG2C-R为引物进行PCR扩增，获得约5.0kb的LG2基因组片段；将扩增获得LG2基因组片段先连入中间载体pEasy-Blunt上进行测序，获得LG2基因片段的阳性克隆，最后用EcoRI和BamHI酶切阳性克隆和表达载体pCAMBIA1300，将酶切后的LG2基因组片段通过T4连接酶与pCAMBIA1300连接，获得了LG2基因的互补表达载体，命名为pCAMBIA1300-LG2(见图6)。

实施例5：CRISPR/Cas9敲除LG2基因质粒转化水稻

按照如下方法进行：

(1)表达载体质粒转化农杆菌：

通过冻融法将实施例4中构建的表达载体pCAMBIA1300-U6-LG2cas9导入农杆菌菌株EHA105。具体方法为：每100μl EHA105感受态细胞与0.5-1μg(约2μl)质粒DNA混匀，依次在冰上、液氮中和37℃水浴中各放置5min；用新鲜的LB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取出200μl涂布含抗生素Kan(50μg/ml)和Rif(50μg/ml)的LB平板上，在28℃培养2-3天，从LB平板上挑取农杆菌单菌落进行鉴定，即获得了转化农杆菌的阳性克隆，菌液于-80℃保存备用。

(2)采用常规的农杆菌介导的方法转化水稻成熟胚愈伤组织。

(a)愈伤组织的诱导和继代培养：取日本晴的成熟种子去壳，用75％的酒精浸泡2min后，无菌水冲洗3-5次；用50％的次氯酸钠溶液浸泡30min，期间适时摇晃；无菌水洗涤8-10次，置于灭菌的玻璃培养皿中的滤纸上，在超净工作台中晾5min左右，摆放于诱导培养基(简称为：MSD)上，每培养皿20-25颗。于30℃光照培养箱中持续光照培养7-10天，至愈伤组织长出。在超净工作台中将长出的愈伤组织接种到MSD培养基上进行继代培养，相同条件下培养3天左右，即可以进行农杆菌浸染。

(b)农杆菌的活化：从-80℃冰箱中取出步骤(1)中保存的农杆菌，于含有相应抗生素的YEP平板上划线活化；挑取单克隆，接种于含有相应抗生素的2ml YEP液体培养基中，在28℃、200rpm条件下培养过夜。取200μl菌液接种于20ml TY+AS培养基中，在28℃、200r/min条件下培养大约3-5h,获得OD600为0.1-0.2的农杆菌培养液。

(c)浸染和共培养：将步骤(a)中培养的愈伤组织从继代培养基上收集起来，转入步骤(b)所得的农杆菌培养液中浸染30min，然后将愈伤组织取出，放置于灭菌滤纸上约5min，将多余的菌液吸干；再将愈伤组织转移到共培养培养基(MSD+S+AS)上，在22℃、黑暗条件下培养2-3天。

(d)筛选：将(c)中共培养培养基上的愈伤组织转到筛选培养基(MSD+CH)上，在30℃、光照条件下培养两周左右(注意观察是否有农杆菌污染)，然后将愈伤组织转到新的筛选培养基上，相同条件下继续培养两周。

(e)分化和诱导生根：经过步骤(d)的二次筛选培养，阴性的愈伤组织大多死亡，阳性愈伤组织周围会长出新的愈伤。将新长出来的愈伤转移到分化培养基(BN+S+CH)上，在30℃、光照条件下培养20天，愈伤组织开始分化发生转绿。变绿的愈伤组织慢慢长成幼苗(3-5cm)时，将其转移到生根培养基(MS)上，继续培养10-15天。幼苗长出根来，此时拔掉试管塞，加入灭菌蒸馏水让其自然生长。一周后将培养基洗净，将幼苗移栽至大田，移栽成活的植株即为转基因T0代植株。

(3)转基因植株的检测

提取步骤(2)中所得的转基因幼苗的叶片总DNA，用于PCR检测。CRISPR/Cas9敲除转基因植株的检测，首先采用潮霉素引物检测，引物序列为：

Hpt-F:5’-TACACAGGCCATCGGTCCAGA-3’(SEQ ID NO.11)，

Hpt-R:5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’(SEQ ID NO.12)。

上述PCR的反应体系(20μL)：模板3.0μL(20-100ng)，10×buffer(含Mg²⁺25mmol/L)2.0μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，Taq酶0.2μL，Primer(0.25mmol/L)2.0μl，ddH₂O 10.8μL。PCR反应程序：94℃2min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，循环30次；72℃5min；20℃2min。

检测结果显示获得有敲除的阳性植株8株；由于以LG2-F和LG2-R为引物扩增获得的DNA片段包含了LG2基因的靶点，因此，以LG2-F和LG2-R为引物、用KOD酶对敲除LG2基因的阳性植株进行PCR扩增和测序。

其中PCR的反应体系(25μL)为：模板2.0μL(20-100ng)，10×KOD buffer2.5μL，2×GC buffer I 12.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.5μL，Mg²⁺1μL，KOD plus(酶)0.25μL，Primers(0.25mmol/L)2.0μL，ddH₂O 1.1μL。PCR的反应程序：94℃2min；98℃20s，58℃30s，68℃30s，32个循环；68℃10min，20℃2min。

通过PCR扩增含有CRISPR靶位点的片段，扩增产物大小分别为951bp(见图7)，将扩增出的PCR产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序；测序结果显示阳性转基因苗中LG2基因都被敲除，T0代获得了2株在该基因第857位有一个T碱基***的纯合突变体,命名为lg2-1，还有一株敲除植株在该基因的840-864之间有段24bp的缺失,命名为lg2-2(见图8)，其余5株为敲除杂合突变体植株。成熟后收获这两株纯合植株进行农艺性状的观察，与受体植株日本晴(Nip)相比，这两株纯合突变体植株的籽粒长度和籽粒宽度都增加(见图9、图10和图11)，说明该基因具有调控水稻籽粒大小的功能，因此，可通过调控该基因的功能来调控水稻籽粒的大小。

实施例6：LG2基因互补载体转化水稻

按照如下方法进行：

(1)表达载体质粒转化农杆菌：

通过冻融法将实施例4中构建的LG2互补表达载体pCAMBIA1300-LG2导入农杆菌菌株EHA105。具体方法为：每100μl EHA105感受态细胞与0.5-1μg(约2μl)质粒DNA混匀，依次在冰上、液氮中和37℃水浴中各放置5min；用新鲜的LB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取出200μl涂布含抗生素Kan(50μg/ml)和Rif(50μg/ml)的LB平板上，在28℃培养2-3天，从LB平板上挑取农杆菌单菌落进行鉴定，即获得了转化农杆菌的阳性克隆，菌液于-80℃保存备用。

(2)采用常规的农杆菌介导的方法转化水稻成熟胚愈伤组织。

(a)愈伤组织的诱导和继代培养：取水稻lg2突变体成熟种子去壳，用75％的酒精浸泡2min后，无菌水冲洗3-5次；用50％的次氯酸钠溶液浸泡30min，期间适时摇晃；无菌水洗涤8-10次，置于灭菌的玻璃培养皿中的滤纸上，在超净工作台中晾5min左右，摆放于诱导培养基(简称为：MSD)上，每培养皿20-25颗。于30℃光照培养箱中持续光照培养7-10天，至愈伤组织长出。在超净工作台中将长出的愈伤组织接种到MSD培养基上进行继代培养，相同条件下培养3天左右，即可以进行农杆菌浸染。

(b)农杆菌的活化：从-80℃冰箱中取出步骤(1)中保存的农杆菌，于含有相应抗生素的YEP平板上划线活化；挑取单克隆，接种于含有相应抗生素的2ml YEP液体培养基中，在28℃、200rpm条件下培养过夜。取200μl菌液接种于20ml TY+AS培养基中，在28℃、200rpm条件下培养大约3-5h,获得OD600为0.1-0.2的农杆菌培养液。

(e)分化和诱导生根：经过步骤(d)的二次筛选培养，阴性的愈伤组织大多死亡，阳性愈伤组织周围会长出新的愈伤。将新长出来的愈伤转移到分化培养基(BN+S+CH)上，在30℃、光照条件下培养20天，愈伤组织开始分化发生转绿。变绿的愈伤组织慢慢长成幼苗(3-5cm)时，将其转移到生根培养基(MS)上，继续培养10-15天。幼苗长出根来，此时拔掉试管塞，加入灭菌蒸馏水让其自然生长。一周后将培养基洗净，将幼苗移栽至大田，移栽成活的植株即为转基因T0植株，待植株成活后进行检测。

(3)转基因植株的检测

根据LG2基因互补表达载体pCAMBIA1300的植物抗性是潮霉素，互补转基因植株用潮霉素特异引物进行PCR扩增检测，引物序列为Hpt-F和Hpt-R，PCR反应体系及PCR反应程序参照实施例5(3)。

检测结果(见图12)LG2基因互补转化获得了7株阳性植株。

植株成熟后观察这7株阳性转基因植株与野生型和lg2突变体植株的粒型并测定其籽粒的长度和宽度，结果(见图13-15)阳性转基因植株粒长变短、粒宽变窄，恢复到了野生型的表型，互补转基因植株T₁代的籽粒长度和宽度恢复到野生型表型，表明控制籽粒大小的基因LG2被成功克隆，由于该基因的功能缺失使得种子变大，说明LG2是一个粒型和粒重的负调控因子，这和其他控制粒型的基因GS5、GW8、GL7/qGW7和GS2不同，它们多是正调控种子大小。同时也证明了这个基因可以通过遗传转化来改良水稻品种。验证了LG2基因能够调控水稻粒型的功能。

综上所述，本发明LG2基因能用于对水稻粒型进行改良，培育大粒水稻品种，最终提高水稻产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种水稻粒型相关蛋白及其编码基因

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 644

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Cys Asn Ser Gly Thr Ser Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Pro Pro Pro Leu Thr Ser Phe Lys His Ser Ser His Leu Leu Arg Leu

20 25 30

Val Asp Asp Asp Ala Asp Asp Gly His Ala Leu Leu Leu Ser Lys Val

35 40 45

Ala Gly Glu Ala Gln Ala Ile Gly Arg Val Ser Val Pro Met Ala Val

50 55 60

Thr Gly Leu Val Met Tyr Ser Arg Ala Leu Ile Ser Met Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gly Arg Leu Gly Glu Leu Ala Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ala Leu Gly

85 90 95

Phe Ala Asn Ile Thr Gly Tyr Ser Val Leu Ser Gly Leu Ala Leu Gly

100 105 110

Met Glu Pro Ile Cys Gly Gln Ala Phe Gly Ala Arg Arg Gly Lys Leu

115 120 125

Leu Ala Leu Ala Leu His Arg Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Val Ala

130 135 140

Leu Pro Ile Ser Leu Leu Trp Val Thr Ser Thr Gly Tyr Ile Leu Lys

145 150 155 160

Gln Leu Gly Gln Asp Glu Gly Val Ala Asp Ala Ala Gln Thr Phe Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Leu Ala Val Leu His Pro Leu

180 185 190

Arg Val Tyr Leu Arg Ser Gln Asn Leu Thr Leu Pro Ile Thr Ala Cys

195 200 205

Ser Leu Phe Ser Val Leu Leu His Gly Pro Ile Asn Tyr Leu Leu Val

210 215 220

Val Arg Leu Arg Met Gly Val Ala Gly Val Ala Leu Ala Val Ala Leu

225 230 235 240

Thr Asp Leu Asn Leu Leu Leu Ala Leu Leu Cys Phe Leu Ala Ile Ser

245 250 255

Gly Ala His Arg Asp Ser Trp Val Gly Pro Thr Ser Asp Cys Leu Arg

260 265 270

Gly Trp Pro Ala Leu Leu Arg Leu Ala Val Pro Thr Ala Thr Ala Val

275 280 285

Cys Leu Glu Trp Trp Trp Tyr Glu Leu Met Ile Val Leu Ser Gly Leu

290 295 300

Leu Ala Asn Pro Arg Ala Thr Val Ala Ser Met Gly Ile Leu Ile Gln

305 310 315 320

Ala Thr Ser Leu Val Tyr Val Phe Pro Ser Ser Leu Gly Gln Gly Ala

325 330 335

Ser Thr Arg Val Ser His Gln Leu Gly Ala Gly Arg Pro Ala Gly Ala

340 345 350

Arg Arg Ala Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ile Gly Leu Val Val Gly Ala

355 360 365

Ala Ala Ala Thr Phe Met Val Ser Val Arg Ser His Trp Gly Arg Met

370 375 380

Phe Thr Ser Asp Gly Glu Ile Leu Arg Leu Thr Ala Val Ala Leu Pro

385 390 395 400

Ile Ala Gly Leu Cys Glu Leu Gly Asn Cys Pro Gln Thr Ala Gly Cys

405 410 415

Gly Val Leu Arg Gly Ser Ala Arg Pro Ala Ser Gly Ala Arg Ile Asn

420 425 430

Leu Ala Ser Phe Tyr Leu Val Gly Met Pro Val Gly Val Ala Leu Ala

435 440 445

Phe Gly Ala Arg Leu Gly Phe Ala Gly Leu Trp Leu Gly Leu Leu Ala

450 455 460

Ala Gln Ala Ala Cys Ala Val Trp Met Ala Arg Ala Val Ala Ala Thr

465 470 475 480

Asp Trp Asp Val Glu Val Ala Arg Ala Lys Glu Leu Thr Lys Ala Ser

485 490 495

Thr Thr Gly Ser Gly Thr Asn His Gln His Glu Cys Asn Asn Ser Asn

500 505 510

Thr Asn Thr Ala Asn Ala Lys Ala Asn Thr Lys Thr Thr Thr Ser Pro

515 520 525

Ala Ala Asn Asn Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Asn Arg

530 535 540

Gly Tyr Val Pro Ile Ser Glu Ser Gly His Asn Asp Gly Ser Asp Asp

545 550 555 560

Leu Glu Lys Leu Glu Glu Gly Leu Met Val Ala Thr Ser Gly Gly Cys

565 570 575

Cys Gly Cys Gly Asp Ala Leu Gly Val Asp Thr Lys Ala Gly Asp Lys

580 585 590

Gln Gln Cys Ser Asn Gly Gly Ala Gly Thr Ala Glu Gly Asn Ala Gly

595 600 605

Gln Arg Arg Gly Ser Ala Ser Ser Glu Arg Ala Pro Leu Ile Ser Val

610 615 620

Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gly Glu Glu Asn Asp Gly Asp Gly Gly Gly

625 630 635 640

Gly Gly His Val

<210> 2

<211> 1932

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgtgcaact ccggcaccag ctcctcgccg tcggcgcctg cgccgccgcc gccgccgctc 60

acctcgttca agcactcctc ccacctcctc cgcctcgtgg acgatgacgc cgacgacggc 120

catgcgctgc tgctctccaa ggtggccggc gaggcgcagg cgatcgggcg ggtgtcggtg 180

ccgatggcgg tgacggggct cgtcatgtac tcgcgggcgc tcatctcgat gctgttcctt 240

ggccggctcg gcgagctggc cctcgccgga gggtcgctgg cgctcggctt cgccaacatc 300

accggctact cggtgctctc cgggctggcg ctcgggatgg agcccatctg cggccaggcg 360

ttcggcgcgc gccgcgggaa gctgctggcg ctggcgctcc accgcaccgt gctgctgctg 420

ctcgccgtcg cgctgcccat ctccctcctg tgggtgacgt ccacggggta catactgaag 480

cagctcggcc aggacgaggg cgtggcggac gcggcgcaga cgttcgcggc gtacgcgtcg 540

gccgacctgg cggtgctcgc cgtgctgcac ccgctccgcg tctacctccg gtcgcagaac 600

ctgacgctgc ccatcaccgc ctgctcgctc ttctccgtgc tgctgcacgg gcccatcaac 660

tacctcctcg tcgtgcgcct ccgcatgggc gtcgccggcg tcgcgctcgc cgtcgcgctc 720

accgacctta acctgctcct cgcgctcctc tgcttcctcg ccatctccgg ggcccacagg 780

gactcgtggg tggggcccac ctccgactgc ctccgcgggt ggccggcgct gctccgcctc 840

gccgtgccga ccgccaccgc ggtgtgcctc gagtggtggt ggtacgagct catgatcgtg 900

ctgtcgggcc tcctggccaa cccgcgcgcc accgtggcgt ccatgggcat cctcatccag 960

gccacgtcgc tcgtctacgt gttcccgtcc tccctcggcc agggcgcgtc cacgcgcgtc 1020

agccaccagc tcggcgcggg caggcccgcg ggggcgcgcc gcgcggccgg cgccgccctc 1080

tccatcggcc tcgtcgtcgg cgcggcggcc gccaccttca tggtgtcggt ccgcagccac 1140

tggggccgca tgttcacgtc ggacggcgag atcctccgcc tcacggccgt ggcgctcccc 1200

atcgcggggc tctgcgagct cggcaactgc ccgcagacgg ccgggtgcgg cgtcctccgc 1260

ggcagcgccc gcccggccag cggcgcgcgc atcaacctcg cctccttcta cctggtcggc 1320

atgccggtcg gcgtggcgct ggcattcggc gcccgcctag gcttcgccgg gctgtggctg 1380

ggcctccttg ccgcgcaggc tgcctgcgcg gtgtggatgg cgcgcgccgt ggccgccacc 1440

gactgggacg tcgaggtggc gcgtgccaag gagctgacca aggcgtccac tacaggcagc 1500

ggcaccaacc accagcacga gtgcaacaac agcaacacca acaccgccaa cgcaaaggct 1560

aacaccaaaa cgacaacgtc tcccgccgcc aataacatca atgccggtgg cggcggcagc 1620

agcgacaacc gcggttacgt gcccatcagc gagagcggcc acaacgacgg cagcgacgac 1680

ctggagaagc tggaggaagg gctcatggtg gccacgagtg gcggctgctg cggctgcggc 1740

gacgcgttag gcgtcgacac gaaggctggg gacaagcagc agtgcagcaa cggtggtgcc 1800

ggtacggcgg agggaaatgc ggggcagagg aggggctcgg cgtcgtcgga gagggccccg 1860

ctgatcagtg tgggggacga cgaggaggcc ggggaggaga acgacggcga cggcggtgga 1920

ggtggccacg tc 1932

<210> 3

<211> 2594

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

atgtgcaact ccggcaccag ctcctcgccg tcggcgcctg cgccgccgcc gccgccgctc 60

acctcgttca agcactcctc ccacctcctc cgcctcgtgg acgatgacgc cgacgacggc 120

catgcgctgc tgctctccaa ggtaaaacac gcggtacata tgctgtagta atacttaccc 180

gcggcttggt aattttgatg gcgtgaacag aacatgtagg ccattatatc aaagagctaa 240

tgcaagaagc acgcatagcg acatagctgg ctggctggct ggttgtttaa tgcttattta 300

ctagtagcta ggcatcactg gcagtaacag taacgagaaa gaaaaggaaa gctccagctg 360

ttgggaaatg gcagagctga tcaatacgtc catgcacacg aacagctgat cgagacgacg 420

acgacgttgc tttgcttgtt ggtttctaac atgcgtgagt gcgtgtctcc caggtggccg 480

gcgaggcgca ggcgatcggg cgggtgtcgg tgccgatggc ggtgacgggg ctcgtcatgt 540

actcgcgggc gctcatctcg atgctgttcc ttggccggct cggcgagctg gccctcgccg 600

gagggtcgct ggcgctcggc ttcgccaaca tcaccggcta ctcggtgctc tccgggctgg 660

cgctcgggat ggagcccatc tgcggccagg cgttcggcgc gcgccgcggg aagctgctgg 720

cgctggcgct ccaccgcacc gtgctgctgc tgctcgccgt cgcgctgccc atctccctcc 780

tgtgggtgac gtccacgggg tacatactga agcagctcgg ccaggacgag ggcgtggcgg 840

acgcggcgca gacgttcgcg gcgtacgcgt cggccgacct ggcggtgctc gccgtgctgc 900

acccgctccg cgtctacctc cggtcgcaga acctgacgct gcccatcacc gcctgctcgc 960

tcttctccgt gctgctgcac gggcccatca actacctcct cgtcgtgcgc ctccgcatgg 1020

gcgtcgccgg cgtcgcgctc gccgtcgcgc tcaccgacct taacctgctc ctcgcgctcc 1080

tctgcttcct cgccatctcc ggggcccaca gggactcgtg ggtggggccc acctccgact 1140

gcctccgcgg gtggccggcg ctgctccgcc tcgccgtgcc gaccgccacc gcggtgtgcc 1200

tcgagtggtg gtggtacgag ctcatgatcg tgctgtcggg cctcctggcc aacccgcgcg 1260

ccaccgtggc gtccatgggc atcctcatcc aggccacgtc gctcgtctac gtgttcccgt 1320

cctccctcgg ccagggcgcg tccacgcgcg tcagccacca gctcggcgcg ggcaggcccg 1380

cgggggcgcg ccgcgcggcc ggcgccgccc tctccatcgg cctcgtcgtc ggcgcggcgg 1440

ccgccacctt catggtgtcg gtccgcagcc actggggccg catgttcacg tcggacggcg 1500

agatcctccg cctcacggcc gtggcgctcc ccatcgcggg gctctgcgag ctcggcaact 1560

gcccgcagac ggccgggtgc ggcgtcctcc gcggcagcgc ccgcccggcc agcggcgcgc 1620

gcatcaacct cgcctccttc tacctggtcg gcatgccggt cggcgtggcg ctggcattcg 1680

gcgcccgcct aggcttcgcc gggctgtggc tgggcctcct tgccgcgcag gctgcctgcg 1740

cggtgtggat ggcgcgcgcc gtggccgcca ccgactggga cgtcgaggtg gcgcgtgcca 1800

aggagctgac caaggcgtcc actacaggca gcggcaccaa ccaccagcac gagtgcaaca 1860

acagcaacac caacaccgcc aacgcaaagg ctaacaccaa aacgacaacg tctcccgccg 1920

ccaataacat caatgccggt ggcggcggca gcagcgacaa ccgcggttac gtgcccatca 1980

gcgagagcgg ccacaacgac ggcagcgacg acctggagaa gctggaggaa gggctcatgg 2040

tggccacgag tggcggctgc tgcggctgcg gcgacgcgtt aggcgtcgac acgaaggctg 2100

gggacaagca gcagtgcagc aacggtggtg ccggtacggc ggagggaaat gcggggcaga 2160

ggaggggctc ggcgtcgtcg gagagggccc cgctgatcag tgtgggggac gacgaggagg 2220

ccggggagga gaacgacggc gacggcggtg gaggtggcca cgtctagcta gctgctaatc 2280

aaccagcgtg gtcgatccat ccatcgatta attctggaga ggttttgatc gtacgtacgt 2340

aggctatgtt tgacactgat cggccggtct ccatttcatc tttctctcca tcttgatttg 2400

ggggtgaggt ttagttttgt ctgtataacc aagctgagca gctaattaat gagagtattc 2460

aggaaaaaaa aagagggaga aaaaaacata tatattcttc ccttattttt cttaattaat 2520

tatacttcta tgtacaaata ctaattagtt tgggtgtaaa ttataattaa atcaattgat 2580

ggtgattaat taag 2594

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LG2基因检测的上游引物

<400> 4

tcacctcgtt caagcactcc t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LG2基因检测的下游引物

<400> 5

cacgacgagg aggtagttga tg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LG2的靶标序列

<400> 6

gacgcggcgc agacgttcg 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligo F

<400> 7

tgtgtggacg cggcgcagac gttcg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Oligo R

<400> 8

aaaccgaacg tctgcgccgc gtcca 25

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LG2C-F

<400> 9

ggggtaccag gcactgaaat gctacacgtt 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LG2C-R

<400> 10

cgggatccat caaatggttg cgactttatc a 31

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hpt-F

<400> 11

tacacaggcc atcggtccag a 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hpt-R

<400> 12

taggagggcg tggatatgtc 20

Claims

1.一种水稻粒型相关蛋白，命名为LG2，其特征在于所述的蛋白如下：

(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成；

2.权利要求1所述的蛋白在控制水稻粒型上的应用。

3.编码权利要求1所述的水稻粒型相关蛋白的基因，命名为LG2，其特征在于所述的基因具有如下的核苷酸序列：

(a)由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成；

4.权利要求3所述的基因在控制水稻粒型上的应用。

5.用于敲除权利要求3所述的基因的靶点序列，其特征在于所述的靶点序列由SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列组成；即

5’-GACGCGGCGCAGACGTTCG-3’(SEQ ID NO.6)。

6.用于敲除权利要求3所述的基因的sgRNA，其特征在于所述的sgRNA的靶点序列由SEQID NO.6所示的核苷酸序列组成。

7.通过敲除权利要求3所述的基因培育大粒水稻品种的方法，其特征在于所述的敲除权利要求3所述的基因是通过CRISPR/Cas9***实现的；所述的基因由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的CRISPR/Cas9***中，其sgRNA的靶点序列是SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

9.用于检测敲除权利要求3所述的基因的转基因植物的引物对，其特征在于所述的引物对由LG2-F和LG2-R组成；其中所述的LG2-F由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成；所述的LG2-R由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成；即：

LG2-F:5’-TCACCTCGTTCAAGCACTCCT-3’(SEQ ID NO.4)；

LG2-R:5’-CACGACGAGGAGGTAGTTGATG-3’(SEQ ID NO.5)。

10.用于检测敲除权利要求3所述的基因的转基因植物的试剂盒，其特征在于包括由LG2-F和LG2-R组成的引物对；其中所述的LG2-F由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成；所述的LG2-R由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列组成；还包括：10×KOD buffer 2.5μL，2×GCbuffer I 12.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.5μL，Mg²⁺1μL，KOD plus(酶)0.25μL，ddH₂O 1.1μL。