CN117431256B - 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx‑2D及其编码的蛋白和应用。来自仪宁小麦TaRx‑2D基因cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，TaRx‑2D基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明TaRx‑2D基因的EMS诱变得到的突变体、CRISPR/Cas9造成的突变体以及BSMV诱导的TaRx‑2D基因沉默在仪宁小麦中使得其小麦黄花叶病抗性降低，因此可将本发明所述基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，进而改变感病小麦的小麦黄花叶病抗性，进而提高小麦产量。

Description

一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用。
背景技术
小麦黄花叶病是由小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）通过土壤中的真菌介体禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）传播和感染。病情发展的适宜气温为5～15℃，一般为每年2月中下旬开始表现症状，3月上中旬是盛期，之后病情停止发展植株隐症。感病小麦表现为叶片发黄、蜷缩，植株矮化，严重时枯死，因此该病对小麦生长、发育、产量及其构成因素均有很大的影响。
病毒病的发生涉及寄主-介体-病毒-环境等多种因素。由禾谷多黏菌传播的小麦黄花叶病毒一旦进入田块很难彻底根除，这是因为禾谷多粘菌产生的休眠孢子堆具有极强的抗逆性，在土壤中甚至干旱、水淹等不良环境下能存活数年，也难以被化学药剂杀死或抑制；并且通过农事操作、病土、病根残体、病田流水,或通过带介体土壤混杂在种子里等进行远距离传播。虽然通过适时轮作、改种非禾谷多黏菌寄主作物、土地休耕、推迟播期、增施有机肥以及春季返青期增施氮肥等措施可以在一定程度上减轻病害发生，但是这些传统农艺措施和化学防治效果往往不明显。
鉴于小麦黄花叶病的频繁发生，对小麦产量造成严重损失，自20世纪90年代，国内多家单位进行了大规模抗病材料的鉴定工作，经过十多年的育种实践，育成一批高抗的品种，如宁麦9号、宁麦13、镇麦5号、苏麦5、6号、扬辐麦9311、扬辐麦4号等，在生产上、特别是病害流行区推广利用，有效控制了这些地区病害的蔓延。大量的实践都证明，选育和种植抗病品种是目前控制小麦黄花叶病唯一的途径。国内许多育种单位将小麦黄花叶病抗性作为一个重要的性状列入各自的育种目标。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供与小麦黄花叶病抗性相关基因TaRx-2D。
本发明的另一目的是提供该基因的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种来自仪宁小麦与小麦黄花叶病抗性相关的基因TaRx-2D，该基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述基因TaRx-2D的基因组序列如SEQ ID NO：2所示。
所述基因TaRx-2D编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
上述TaRx-2D可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
在其他植物中编码上述相似结构域蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述的与小麦黄花叶病抗性相关的基因TaRx-2D，所述来自基因TaRx-2D的含有所述基因TaRx-2D的表达盒、重组载体或重组微生物。
所述基因TaRx-2D的应用如下(A1)或(A2)：(A1)调控普通小麦的小麦黄花叶病抗性；(A2)增强或降低普通小麦的小麦黄花叶病抗性。
具体的，通过降低该基因的表达或者敲除该基因，将导致小麦对小麦黄花叶病抗性的降低或丧失。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为禾本科植物。
所述的表达盒、重组载体或重组微生物的应用，其特征在于，如下(B1)或(B2)：(B1)培育的小麦黄花叶病抗性改变的转基因植物；(B2)培育的小麦黄花叶病抗性增加或降低的转基因植物。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为禾本科植物。
有益效果
本发明TaRx-2D基因通过表达量降低、基因的无义突变和错义突变在小麦中具有明显降低小麦抗性的作用，因此可将本发明所述基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，进而改变小麦黄花叶病抗性，调控植物产量。
附图说明
图1为不同EMS诱变得到的仪宁小麦感病突变体受小麦黄花叶病侵染后的表型和测序突变体中的TaRx-2D鉴定的突变位点。其中A图为感病突变体和抗感材料对照在田间发病后的整株、叶片和病毒分子检测图。横坐标分别为抗病材料仪宁小麦、感病材料扬麦158、仪宁小麦EMS感病突变体YN-Mut1、YN-Mut2、YN-Mut3。B图为三个感病突变体中TaRx-2D基因的gDNA突变位点、cDNA序列突变位点和蛋白突变位点，以及提前终止产生的截短蛋白长度。“ATG”为起始密码子，“TAA”为终止密码子，黑色方框为外显子，折线为内含子，灰色部分为编码蛋白结构域序列区域，“g.”、“c.”、“p.”分别代表了gDNA、cDNA、蛋白序列。
图2为在仪宁小麦中利用大麦条纹花叶病毒诱导的TaRx-2D基因沉默后植株的抗性表型和病毒分子鉴定以及根中TaRx-2D基因表达效率分析和植株。其中A图是TaRx-2D基因的沉默效率分析。采用实时反转录实时定量PCR方法检测TaRx-2D基因在大麦条纹花叶病毒诱导沉默后的表达量；B图是仪宁小麦中用大麦条纹花叶病毒诱导的TaRx-2D基因沉默后植株的小麦黄花叶病的抗性表型；C图为小麦黄花叶病病毒和大麦条纹花叶病毒检测。其中，A、B、C图中的横轴表示不同处理的小麦，其中Mock为仪宁小麦不涂抹大麦条纹花叶病毒的植株在病圃自然发病后的表型，BSMV为接种大麦条纹花叶病毒后的仪宁小麦植株，Yangmai158为感病对照“扬麦158”，I、II、III、IV依次代表BSMV-TaRx-2D CC#1、BSMV-TaRx- 2D CC#2、BSMV-TaRx-2D LRR#1、BSMV-TaRx-2D LRR#2，为沉默的TaRx-2D的CC结构域和LRR结构域片段；A图的纵轴表示大麦条纹花叶病毒诱导沉默的植株相对于未接种大麦条纹花叶病毒的仪宁小麦对照植株的TaRx-2D表达量比值，内参基因为TaTubulin。字母表示显著性差异分析，a表示无显著差异，b表示显著差异。
图3为在转基因受体材料Fielder中通过CRISPR/Cas9敲除TaRx-2D基因的T1代突变体系对小麦黄花叶病的抗感表型和基因序列被编辑情况和造成的蛋白序列突变情况。其中A图为设计的TaRx-2D靶向位点和基因编辑阳性T1代株系中被编辑gDNA基因序列的位置、cDNA序列突变位点、氨基酸突变位点和最终截短蛋白大小；A图上方的“g.”、“c.”、“p.”分别代表了gDNA、cDNA、蛋白序列的突变信息；其中，“del”代表碱基缺失，“fs”代表了蛋白移码突变，“*”以及后面数字代表了移码框从突变蛋白开始到终止蛋白之间的残基数量；A图下方的“ATG”为起始密码子，“TAA”为终止密码子，黑色方框为外显子，折线为内含子，灰色部分为编码蛋白结构域序列区域。B图为基因编辑突变体T1代编辑后的靶点序列。红色序列为靶点的PAM序列，蓝色序列为设计的sgRNA编辑靶点，WT代表野生型。C图是Fielder中利用CRISPR/Cas9***对TaRx-2D基因编辑后的T1代突变体植株叶片WYMV抗性表型（上）和VPg的半定量RT-PCR检测（下）。TaTubulin用作内参。其中Fielder为受体也为抗病对照。Y158为感病小麦品种“扬麦158”，T1-CRTaRx-2D-1-1、T1-CRTaRx-2D-4-2、T1-CRTaRx-2D-6、T1-CRTaRx-2D-8为四个CRISPR突变体系。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
使用的材料为小麦品种仪宁小麦、Fielder，农杆菌介导的遗传转化获得的Fielder背景的转基因材料T1-CRTaRx-2D-1-1、T1-CRTaRx-2D-4-2、T1-CRTaRx-2D-6、T1-CRTaRx-2D-8。
实施例1：利用仪宁小麦EMS感病突变体验证TaRx-2D基因的小麦黄花叶病抗病作用
选取颗粒饱满的仪宁小麦干种子，放置于0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH=7.0）中室温浸泡8 h；加入甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）使终浓度为0.6%，遮光浸泡16 h；流水冲洗2 h后，放置于25℃恒温箱培养至发芽，M1代幼苗移栽至大田，按单株单穗收获。M2代以穗行形式种植于河南驻马店WYMV病圃，通过对小麦黄花叶病发病后的突变体群体进行筛选，对筛选到的三个感病突变体YN-Mut1、YN-Mut2、YN-Mut3（图1中的A图）进行TaRx-2D基因的全长克隆并测序。
在YN-Mut1突变体系中，TaRx-2D基因第2,961位胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，导致编码蛋白NBS结构域上的第306位苏氨基酸（Thr）变成异亮氨酸（Ile）；YN-Mut2在TaRx-2D基因第3,190位发生碱基突变，由胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，造成一个无义突变导致蛋白翻译提前终止，产生一个382 aa的截短蛋白；在YN-Mut3中，通过全长克隆发现在该突变体TaRx-2D基因上位于3,872位的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，导致610位的脯氨酸（Pro）突变成丝氨酸（Ser）。感病突变体中TaRx-2D序列检测结果表明，碱基突变造成的错义变异或翻译提前终止导致仪宁小麦对WYMV的抗性丧失（图1中的B图）。
用于TaRx-2D基因gDNA全长PCR扩增引物如表1所示：
表1.用于TaRx-2D基因gDNA全长PCR扩增引物
实施例2：利用病毒诱导的基因沉默验证TaRx-2D基因对小麦黄花叶病的抗性功能
以本氏烟草为过渡寄主的基于大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaicvirus，BSMV）的VIGS侵染体系，基于TaRx-2D基因位于编码CC结构域序列的第228~398 bp的反向序列和编码LRR结构域序列2,034~2,218 bp的反向序列设计基因沉默靶点引物，序列分别为RxCC-rcseq：5’-TTCACTTTCCTAACTTGGATCTCGATGTCTTTGATGTCATTGGATATTCTATGGTGAACCTTGAGCTTGGTGAGCTTGCCGCGGGTCTTCTTCATGAATCCCTTGATGGTGCTTGACCTGTTTGGCTCAAGACCATCTATGCGCACCATGGAGGAGTCGAGATTATCTTCG-3’，RxLRR-rcseq：5’-AAGGGGGCGCACAATCTTCCCAGATACCAAAGGGAACTATCCGATTCTCTTTGCACGAGATCTCCAGAGTTTGGATTTTACCCAGGTTACGGAGCGAATCCAGCAGAGCTGTCTCTGTGCTCTTGTCCATTTCATCAAAATGGATTTCAAGCACCCTTATCTCTGTCATCTTACCTAGTTCGGAG-3’。在靶点两端加上pCaBS-γb载体上多克隆位点的同源臂序列提交擎科生物公司合成载体构建引物BSMV-r-RxCC-rcseq1-F/R，BSMV-r-RxLRR-rcseq1-F/R，对沉默靶点序列进行扩增并纯化回收。使用限制性核酸内切酶MseI对pCaBS-γb载体进行酶切线性化，37℃酶切6 h，取1 μl反应液及对照在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测是否完全切开，完全酶切产物回收纯化，酶切体系如表2所示：
表2.酶切体系
病毒诱导基因沉默载体构建引物序列如表3所示：
表3.病毒诱导基因沉默载体构建引物序列
采用同源重组方法构建VIGS载体，过程参考南京诺维赞生物公司ClonExpress IIOne Step Cloning Kit说明书，在冰上解冻EHA105感受态细胞，取10 μl重组产物加入100μl感受态细胞中在冰上静置10 min，用液氮冷冻5 min，37℃水浴5 min；加入900 μl LB培养基（不加抗生素），28℃培养4 h（转速120 rpm）；5,000 rpm离心3 min，弃掉上清后重悬菌体，在含有Kan和Rif抗性的平板上涂匀；28℃培养箱倒置培养48~72 h后挑单克隆PCR鉴定。
将构建好的BSMV-γ链重组质粒pCaBS-γb:TaPDS、pCaBS-γb:TaRx-2D CC 、pCaBS-γb:TaRx-2D LRR ，BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ链质粒pCaBS-α、pCaBS-β、pCaBS-γb，以及已构建小麦番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase，PDS）TaPDS基因的BSMV-γ链重组质粒pCaBS-γb:TaPDS分别转化农杆菌EHA105感受态细胞中。分别使用载体鉴定引物通过菌液PCR鉴定阳性转化农杆菌菌株后，取500 μl接种于15 ml LB液体培养基（含25 mg/L利福平，100 mg/L卡纳霉素）28℃摇床培养8~12小时进行扩大培养。至菌液OD600值到达0.6~1.0时，用离心机4,000 rpm离心10 min将菌液收集。倒去上清液后，底部菌体用烟草注射缓冲液重悬至OD600=0.6（200 μl浓度为0.5 M的2-吗啉乙磺酸（MES），100 μl浓度的1 M的MgCl2，）将pCaBS-γb、pCaBS-γb:TaPDS、pCaBS-γb:TaRx-2D CC 、pCaBS-γb:TaRx-2D LRR 的BSMV-γ链重组载体菌液分别与含有pCaBS-α、pCaBS-β质粒的菌液等体积混合，室温避光放置4小时，用无菌注射器注射烟草叶片背面，分别在烟草叶片中共表达产生四种病毒重组粒子BSMV、BSMV-TaPDS、BSMV-TaRx-2D CC 、BSMV-TaRx-2D LRR 。
注射后7天当烟草叶片出现明显病毒症状后取注射后的叶片，每克叶片加3 ml摩擦接种缓冲液，充分研磨后蘸取液汁摩擦接种小麦叶片，接种后避光24 h。接种10天后在小麦上位叶观察到明显的BSMV条纹花叶症状，在接种BSMV-TaPDS的小麦上位叶片观察到明显的漂白表型，表明接种成功该体系可以有效敲低小麦基因。
在感病对照扬麦158出现感病表型后，对接种VIGS的仪宁小麦植株进行WYMV抗性鉴定。与未接种VIGS的仪宁小麦相比，接种VIGS的仪宁小麦的整株和叶片出现明显的WYMV感病表型（图2中的B图），包括植株分蘖减少叶片褪绿等。对接种VIGS的仪宁小麦使用WYMV特异引物WYMV-Vpg和BSMV-γ链的鉴定引物对叶片中的小麦黄花叶病病毒以及大麦条纹花叶病毒进行检测（图2中的C图）。在接种病毒重组粒子BSMV-TaRx-2D CC 、BSMV-TaRx-2D LRR 单株的叶片中检测到WYMV的特异条带，说明接种VIGS的仪宁小麦表现出对WYMV感病。
对接种VIGS的仪宁小麦的根组织进行沉默效率分析，分别提取接种了BSMV、BSMV-TaRx-2D CC 、BSMV-TaRx-2D LRR 的仪宁小麦植株和未接种的仪宁小麦植株的根组织RNA，通过第一链cDNA合成后检测TaRx-2D基因表达水平，对根组织中TaRx-2D表达量进行定量分析，在接种BSMV后仪宁小麦中的TaRx-2D基因表达水平明显降低（图2中的A图），结果表明TaRx-2D的表达被显著沉默。由此得出，TaRx-2D基因沉默后导致仪宁小麦丧失对WYMV抗性。
小麦黄花叶病病毒特异引物WYMV-VPg-F/R，BSMV-γ链鉴定引物BSMV-γ-F/R以及TaRx-2D基因荧光定量分析所用引物表4所示：
表4.小麦黄花叶病病毒特异引物WYMV-VPg-F/R，BSMV-γ链鉴定引物BSMV-γ-F/R以及TaRx-2D基因荧光定量分析所用引物
烟草注射缓冲液配方：2 ml 0.5 M MES+1 ml 1 M MgCl2+100 μl 0.1 M 乙酰丁香酮（As），用ddH2O定容到100 ml；摩擦接种缓冲液：2.8 ml 0.2 M H2NaPO4+7.2 ml 0.2 MHNa2PO4+1 g火山灰，定容到100 ml。
上述植物组织RNA的提取和相对表达量的鉴定方法如下所述：
1、利用TRIpure试剂盒提取总RNA：小麦总RNA提取过程参照北京艾德莱（Aidlab）公司产品TRIpure Reagent（RN0102）说明书提取总RNA，为了减少核酸酶等其他物质对RNA造成的影响，所用枪头和离心管均需用0.1% DEPC（1 L水中加入1 mL的DEPC）水处理，所用研钵、研磨棒和药匙等需要用锡箔纸包裹，置于180℃烘箱中烘烤至少6小时，其具体步骤如下：
(1)将叶片速冻过的小麦组织（叶片或者根组织）置于已经严格灭菌的研钵当中（或研磨仪研磨），加液氮充分研磨至粉末状态后，用预先处理好的药匙将其转移至2.0 mL离心管中，每100 mg样品中加入1 mL的TRIpure；
(2)用涡旋仪将匀浆样品剧烈震荡20秒后，室温放置5 min使核蛋白完全解离；
(3)使用冷冻离心机设置为4℃，以12,000 rpm的转速离心10 min，取上清至DEPC水处理过的1.5 ml离心管中，每1 ml TRIpure中加入200 μL氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡15sec后将其在室温下放置3 min；
(4)在4℃ 12,000 rpm的高速冷冻离心15 min，将上层水样层转移到另一干净的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温放置10 min；
(5)12,000 rpm离心10 min，弃上清，加入75%乙醇洗涤沉淀，每使用1 ml的TRIpure用1 ml的75%乙醇对沉淀进行洗涤；
(6)12,000 rpm离心3 min，弃掉上清，短暂离心后用移液枪吸出；
(7)室温放置3 min晾干后，加入100 µl RNase free water充分溶解RNA；
(8)吸取1 µl溶解后的RNA用于1%琼脂糖凝胶电泳，未降解的RNA电泳后有3条清晰的条带，其中28S rRNA条带的亮度大约是18S rRNA条带亮度的2倍，而且rRNA没有明显拖影；
用紫外分光光度计测定260 nm、280 nm处吸收值计算RNA的浓度衡量RNA的质量：260 nm的吸光值为1的时候RNA的浓度等于40 μg/ml，根据稀释倍数计算相应RNA的原液浓度；纯度较高的RNA样品的A260/A280应接近2.0。
2、利用反转录试剂盒进行第一链cDNA序列合成。cDNA第一链合成，反转录反应体系以及扩增程序参照南京诺维赞公司的HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂说明书，获得cDNA用于后续RT-PCR扩增病毒基因分子标记和qRT-PCR检测基因表达量，具体过程如下：（1）在无RNA酶的干净试管中加入dNTP Mixture、Oligo dTPrimer和模板RNA；（2）轻轻混匀，于65℃条件下温育5 min，迅速置于冰盒冷却并加入5×PrimeScript II Buffer、RNase Inhibitor、PrimeScript II RTase和RNase free ddH2O；（3）轻轻混匀，于42℃温育60 min。（4）于95℃条件下5 min终止反应，致酶失活。反转录样品于-80℃冰箱保存备用。
3、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）程序。qRT-PCR反应体系及程序参照AceQ qPCRSYBR Green MasterMix（Vazyme），具体步骤如下：
(1)以反转录合成cDNA第一链为模板，使用TaRx-2D基因表达引物TaRx-2D-qPCR- F/R进行qRT-PCR定量分析，以小麦TaTubulin基因作为内参，一次平行实验设置3次技术重复，引物序列见附录G。
(2)qRT-PCR反应体系如表5所示：
表5.qRT-PCR反应体系
(3)qRT-PCR反应程序如表6所示：
表6.qRT-PCR反应程序
(4)计算基因的相对表达量：完成qRT-PCR后，根据得到的CT值计算TaRx-2D在BSMV处理前后的相对表达量，即2-ΔΔCT。ΔΔCT=（CT TaRx-2D -CT TaTubulin ）BSMV接种单株-（CT TaRx-2D -CT TaTubulin ）未接种BSMV单株，未接种仪宁小麦经TaTubulin校正后一倍量的目标基因表达，显著性差异用R语言函数包agricolae中的最小显著差异（Least significancedifference，LSD）进行多重比较分析。
实施例3：利用CRISPR/Cas9基因编辑验证TaRx-2D基因对小麦黄花叶病的抗病作用
根据TaRx-2D基因的CDS序列，使用wheatCrispr网站（https://crispr.bioinfo.nrc.ca/WheatCrispr/）对TaRx-2D基因gDNA全长序列进行预测CRISPR编辑靶点，根据位于CC结构域和LRR结构域的反义链的外显子区域两个预测得分高的靶点（452~473 bp，4,068~4,086 bp）分别设计CRISPR载体构建引物TaRx-MT1T2-F、TaRx-MT1T2- R、TaRx-MT1T2-F0、TaRx-MT1T2-R0。靶点一序列为：5’-GATTCATGAAGAAGACCCGCGG-3’，靶点二序列为：5’-CAAACTTCGCCTCCGAACTAGG-3’。
以质粒pCBC-MT1T2为模板，TaRx-MT1T2-F、TaRx-MT1T2-R、TaRx-MT1T2-F0、TaRx- MT1T2-R0为引物组合混合扩增含有靶点sgRNA的DNA片段，其中TaRx-MT1T2-F、TaRx-MT1T2- R引物浓度为10 μM，TaRx-MT1T2-F0、TaRx-MT1T2-R0引物浓度为0.5 μM纯化回收DNA片段，PCR扩增体系、反应程序和DNA片段纯化回收参照实施例2。
PCR反应体系配制如表7所示：
表7. PCR反应体系
PCR反应程序如表8所示：
表8.PCR反应程序
纯化后的靶点片段按照表9所示酶切-连接反应体系进行载体构建：
表9.酶切-连接反应体系
载体构建所用引物如表10所示：
表10.载体构建所用引物
利用农杆菌介导的转基因技术，具体参考CN104745621B专利所述方法。在小麦品种Fielder中敲除TaRx-2D。T0代叶片提取的DNA，通过扩增TaRx-2D基因测序发现，T0-CRTaRx-2D-1-1、T0-CRTaRx-2D-4-2、T0-CRTaRx-2D-6、T0-CRTaRx-2D-8为转基因阳性植株，温室种植获得转基因植株的T1代株系，将衍生的T1代株系在实验室环境下种植于含有WYMV的病土的花盆中，来鉴定其WYMV抗感表型。
在T1代基因编辑植株中筛选出16个WYMV感病单株，包括4株T1-CRTaRx-2D-1-1系，3株T1-CRTaRx-2D-4-2系，3株T1-CRTaRx-2D-6系和6株T1-CRTaRx-2D-8系。在感病单株中克隆TaRx-2D基因全长与野生型TaRx-2D序列进行比对发现，16株感病植株中TaRx-2D基因均被编辑，其中T1-CRTaRx-2D-1株系中的编辑位点在位于基因CC结构域的基因编辑靶点一处造成8 bp的缺失，靶点二上未产生编辑，导致该类型的TaRx-2D基因移码突变，产生一个112aa的截短蛋白。T1-CRTaRx-2D-4-2株系中感病植株在CC结构域的基因编辑靶点一和LRR结构域的靶点二之间造成一个3,623 bp的大段缺失，导致目标基因移码突变，产生一个103aa的截短蛋白。T1-CRTaRx-2D-6株系中感病植株中TaRx-2D在靶点一和靶点二之间也造成了一个3,615 bp序列的大片段缺失，造成移码突变产生一个107 aa的截短蛋白。T1-CRTaRx-2D-8株系中感病植株在位于LRR结构域的靶点二产生一个2 bp的缺失，导致基因移码突变产生一个681 aa的截短蛋白（图3中的A图）。以上CRISPR转基因植株的表型和基因型表明，在Fielder中敲除TaRx-2D基因导致植株丧失WYMV抗性，进一步确认TaRx-2D基因是QYm.nau-2D位点的WYMV抗性基因。

Claims (6)

1.一种与小麦黄花叶病抗性相关的基因TaRx-2D，其特征在于：所述基因TaRx-2D的CDS序列如SEQ ID NO：1所示。
2. 根据权利要求1所述的与小麦黄花叶病抗性相关的基因TaRx-2D，其特征在于：所述基因TaRx-2D的基因组序列如SEQ ID NO：2所示。
3. 权利要求1所述的与小麦黄花叶病抗性相关的基因TaRx-2D编码的蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.含有权利要求1或2所述基因TaRx-2D的表达盒、重组载体或重组微生物。
5.权利要求1或2所述基因TaRx-2D的应用，其特征在于，如下(A1)或(A2)：
(A1)调控普通小麦的小麦黄花叶病的抗性；
(A2)增强或降低普通小麦的小麦黄花叶病抗性。
6.权利要求4所述的表达盒、重组载体或重组微生物的应用，其特征在于，如下(B1)或(B2)：
(B1)培育小麦黄花叶病抗性改变的转基因小麦；
(B2)培育小麦黄花叶病抗性增加或降低的转基因小麦。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116536327A (zh) * 2022-09-26 2023-08-04 中国农业科学院作物科学研究所 一种小麦黄花叶病感病基因TaEIF4E及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Weihua Liu 等.Mapping a resistance gene in wheat cultivar Yangfu 9311 to yellow mosaic virus, using microsatellite markers.《Theor Appl Genet》.2015,第651-657页. *
簇毛麦4VS染色体结构变异体库创制和抗小麦黄花叶病基因Wss1的精细定位;代渴丽;《万方》;20230607;全文 *

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