CN116024253B - 一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法 - Google Patents

一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法 Download PDF

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CN116024253B CN202211622584.7A CN202211622584A CN116024253B CN 116024253 B CN116024253 B CN 116024253B CN 202211622584 A CN202211622584 A CN 202211622584A CN 116024253 B CN116024253 B CN 116024253B
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Abstract

本发明涉及一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法，属于植物基因工程技术领域，所述方法通过诱导籽粒苋下胚轴获得毛状根外植体材料，构建可视化编辑载体，将载体转化农杆菌感受态，获得阳性菌株，利用含有载体的阳性菌株制成适用于籽粒苋外植体侵染的侵染液，将外植体放到诱导籽粒苋毛状根的侵染液中，进行传代培养，挑选出带有绿色荧光的阳性毛状根系。利用本发明所述方法能够高效快速的诱导籽粒苋的毛状根，并且能得到基因组编辑的籽粒苋毛状根系。

Description

一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法
技术领域
本发明属于植物组培技术和植物转基因技术领域，具体涉及一种发根农杆菌介导的籽粒苋(Amaranthus hybridus L)毛状根基因组编辑方法。
背景技术
籽粒苋(Amaranthus hybridusL)是一种栽培历史悠久的作物，据有关资料记载，籽粒苋原产于中美洲及东南亚的热带和亚热带地区，我国也是籽粒苋的原产地之一。20世纪70年代，美国南卡罗来纳医科大学的营养学家John Robson在研究中发现籽粒苋的叶片和种子里含有高质量蛋白质，其中赖氨酸的含量尤其较高，具有较高的营养价值。自1982年以来，中国农业科学院作物育种栽培研究所的岳绍先、孙鸿良研究员从美国陆续引进40多个籽粒苋品种，在国内各地进行推广种植，均获得了成功。
然而，由于老品种的种植范围以及产量和品质一直不够理想，且长期缺乏培育的新品种，导致我国籽粒苋种植面积一般都很小。如何培育适应我国不同地区籽粒苋的新品系仍是目前亟待解决的问题。基因编辑技术因其可靶向物种基因组对其进行有效改变，可对作物进行精准改良，已被用于多种植物分子育种中。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒的T-DNA为媒介，将目的基因导入植物中，获得外源基因稳定表达的转基因株系，是研究植物基因功能和遗传改良的主要技术手段之一。除了根癌农杆菌，在自然界中，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒的T-DNA，将诱导发根的基因位点rol基因稳定整合到宿主植物基因组中，产生毛状根。现今已有很多植物实现了该遗传转化途径，例如苜蓿(Medicago sativaL)的毛状根可以经过脱分化和再分化过程形成具有正常育性的完整植株(Qinyi Ye et al.,2021)，也就意味着该遗传转化途径是可以允许在整个植物水平上评价外源基因的功能。另外，通过发根农杆菌诱导产生的毛状根大多数都来自于单一的植物细胞，这样就能保证了其在遗传方面具有很高的稳定性，不会有嵌合体的产生。
CRISPR/Cas9属于Ⅰ类Ⅱ型CRISPR/Cas***，由cas9表达盒和guide RNA表达盒组成。Guide RNA准确模拟了原核生物中存在的crRNA–tracrRNA双链，大大简化了CRISPR/Cas***的操作。Cas9蛋白需要目标位点上游的保守PAM序列来识别目标位点。DNA靶点3’端为PAM序列，化脓链球菌cas9蛋白(SpCAS9)的PAM序列为NGG。近些年来，CRISPR/CAS***的基因组编辑技术，已成功在模式植物拟南芥，以及水稻、玉米、小麦、苜蓿、柳枝稷、棉花、马铃薯、草莓等植物中通过农杆菌介导的方式得到了良好的应用，该技术也成为研究物种基因功能和分子育种的重要工具。但应用该技术的前提是该物种已经拥有成熟的遗传转化平台。然而，一些非模式植物缺少遗传转化体系，这是基因编辑技术无法大范围应用的主要瓶颈问题。因籽粒苋基因编辑未见任何国内外的文章报道。
八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中重要的限速酶，PDS基因被敲除后，转基因的植株会出现白化的表型，易于观察，因此该基因常被作为CRISPR/CAS9、VIGS等体系建立的报告靶基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法。利用本发明所述方法能够高效快速的诱导籽粒苋的毛状根，并且能得到基因组编辑的籽粒苋毛状根系。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法，具体包括以下步骤：
(1)获得诱导籽粒苋毛状根外植体材料：取5-7天的籽粒苋无菌苗的下胚轴；将籽粒苋的下胚轴剪成小段，并使用针头轻轻扎籽粒苋下胚轴，造成伤口，作为诱导籽粒苋毛状根的外植体；
(2)籽粒苋可视化编辑载体的构建：PHSE401-GFP-PDS载体构建方法如下：
第一步、选用PHSE401载体为骨架，使用Hind III限制性内切酶对PHSE401载体进行酶切，所得到的线性化载体PHSE401-Hind III；
第二步、以PHSE401为模板，以Atu6+Target1-F、Atu6+Target1-R为引物扩增Atu6-26+Target1片段，得到扩增产物1；
进一步，扩增产物1的反应体系：DNA(PHES401质粒)250ng；2×Phanta Max MasterMix 25uL，Atu6+Target1-F2.5ul，Atu6+Target1-R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；
扩增产物1的反应程序：95℃3min，95℃15s、51℃15s、72℃30s、29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第三步、以PHSE401为模板，以Target1+U6-26T-F、Target1+U6-26T-R为引物扩增Target1+sgRNA+U6-26T片段，得到扩增产物2；
进一步，扩增产物2的反应体系：DNA(PHES401质粒)250ng，2×Phanta MaxMasterMix 25uL，Target1+U6-26T-F 2.5ul Target1+U6-26T-R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；
所述扩增产物2的反应程序95℃3min；95℃15s、47℃15s，72℃20s，35循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第四步、利用扩增产物1和扩增产物2为模板进行重叠延伸PCR反应，以AtU6+Target1-F、Target1+U6-26T-R为引物扩增AtU6promoter+Target1+sgRNA+AtU6-26T片段，获得扩增产物3，对扩增产物进行胶回收，胶回收后记为AtU6-26+T1；
进一步，扩增产物3的反应体系：DNA(Atu6-26+Target1)2.5ul，DNA(Target1+sgRNA+U6-26T)2.5ul，2×Phanta Max Master Mix25ul，AtU6+Target1-F2.5ul，Target1+U6-26T-R2.5 ul，ddH2O补充到50ul。
扩增产物3的反应程序：95℃3min；95℃15s、65℃15s、72℃1min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第五步、将第一步所得线性化载体PHSE401-Hind III和第四步所得胶回收片段AtU6-26+T1，进行infusion连接；
进一步，所述第五步中的infusion反应体系：DNA(PHSE401-Hind III切)160ng，DNA(AtU6-26+T1)16ng，5×CE II Buffer2ul，Exnase II 1ul，ddH2O补充到10ul；infusion反应程序：37℃反应60min。
第六步、连接产物转化大肠杆菌感受态，利用401JC-F和401JC-R引物进行菌液PCR鉴定，测序，比对测序结果获得第一轮PHSE401-ATU6+Target1骨架载体，记为“pHSE6401-Ⅰ骨架”；
进一步，所述第六步的检测反应体系：DNA(菌液)1ul，2×Taq Max MasterMix10ul，401JC-F1 ul，401JC-R1 ul，ddH2O补充到20ul；
所述第六步的检测反应程序：95℃5min，95℃30s、55℃30s、55℃30s，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第七步、提取pHSE6401-Ⅰ骨架质粒，利用Stu I限制性内切酶对pHSE6401-Ⅰ进行酶切，回收，所得线性化载体记作pHSE6401-ⅠStu I切；
进一步，所述步骤七中的酶切反应体系：DNA(pHSE6401-Ⅰ质粒)1ug，Stu I 1ul，10×M Buffer2ul，ddH2O补充到20ul；Stu I酶切反应反应程序：37℃60min。
第八步、以PHSE401为模板，以AtU6+Target2-F、AtU6+Target2-R为引物扩增AtU6-26+Target2片段；
进一步，所述第八步的扩增反应体系：DNA(PHES401质粒)250ng，2×Phanta MaxMasterMix 25uL，AtU6+Target2-F 2.5ul AtU6+Target2-R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；
所述第八步的扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、51℃15s、72℃30s，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第九步、以PHSE401为模板，以Target2+U6-26T-F、Target2+U6-26T-R为引物扩增Target2+sgRNA+U6-26T片段；
进一步，所述第九步扩增反应体系：DNA(PHES401质粒)250ng，2×Phanta MaxMasterMix 25uL，Target2+U6-26T-F2.5 ul Target2+U6-26T-R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；
所述第九步扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、47℃15s、72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第十步、利用第八步、第九步的扩增产物为模板进行重叠延申PCR反应，以AtU6+Target2-F、Target2+U6-26T-R为引物扩增ATU6promoter+Target2+sgRNA+ATU6-26T片段；
所述第十步的扩增反应体系：DNA(AtU6-26+Target1)
2.5ul，DNA(Target1+sgRNA+U6-26T)2.5ul，2×Phanta Max Master Mix 25ul，AtU6+Target2-F 2.5ul，Target2+U6-26T-R2.5 ul；ddH2O补充到50ul，对扩增产物进行胶回收，胶回收后记为AtU6-26+T2；
所述第十步的扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、65℃15s、72℃1s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第十一步、将第七步所得线性化载体PHSE401-I Stu I切和第十步所得胶回收片段AtU6-26+T2，进行infusion连接；
进一步，所述第十一步的infusion反应体系：DNA(PHSE401-I Stu I切)160ng，DNA(Atu6-26+T2)16ng，5×CE II Buffer2 ul，Exnase II 1ul；ddH2O补充到10ul；infusion反应的反应程序37℃60min。
第十二步、第十一步的连接产物转化DH5a感受态，利用401JC-F、401JC-R引物进行菌液PCR鉴定，测序，比对测序结果获得第二轮PHSE401-ATU6+Target2骨架载体，记为“pHSE6401-Ⅱ骨架”；
进一步，所述第十二步的检测反应体系：DNA(菌液)1ul，2×Taq Max MasterMix10ul，401JC-F 1ul，401JC-R 1ul；ddH2O补充到20ul；
所述第十二步的检测反应程序：95℃5min，95℃30s、55℃30s、72℃2min，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第十三步、提取第十二步获得pHSE6401-Ⅱ骨架质粒，利用Pme I限制性内切酶对pHSE6401-Ⅱ进行酶切，回收，所得线性化载体记作pHSE6401-ⅡPme I切；
第十四步、以合成的Mas promoter+GFP+NOS T基因为模板，401-GFP F、401GFP-R为引物，扩增Mas promoter+GFP+NOS T片段，对扩增产物进行胶回收，记作Mas promoter+GFP+NOS T；
进一步，所述第十四步扩增反应体系：DNA(Mas promoter+GFP+NOS T)250ng，2×PhantaMax MasterMix 25uL，401-GFP F 2.5ul，401-GFP R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；
所述第十四步的扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、66℃15s、72℃1min40s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
第十五步、将第十三步所得线性化载体pHSE6401-ⅡPme I切和第十四步所得胶回收片段Mas promoter+GFP+NOS T，进行infusion连接；
进一步，所述第十五步infusion反应体系：DNA(pHSE6401-ⅡPme I)160ng，DNA(Mas promoter+GFP+NOS T)32ng，5×CE II Buffer2ul，Exnase II 1ul，ddH2O补充到10ul；infusion反应反应程序：37℃60min。
第十六步、连接产物转化DH5a感受态，利用401JC GFP-F和401JC GFP-R引物进行菌液PCR鉴定，测序，比对测序结果获得最终载体PHSE401-GFP-PDS；
进一步，所述第十六步的检测反应体系：DNA(菌液)1ul，2×Taq Max MasterMix10 ul，401JC GFP-F 1ul，401JC GFP-R1 ul，ddH2O补充到20ul；
所述第十六步的检测反应程序：95℃5min，95℃30s、55℃30s、72℃1min50s，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
(3)冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化发根农杆菌LBA9402感受态细胞，冰上融化后，加入3mLPHSE401-GFP-PDS(200ng/ul)质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻2-3分钟；然后37℃水浴3min加入400μL无抗生素的LB培养基，28℃，200rpm，振荡培养2-4h；离心浓缩菌液，取菌液，涂于加卡那霉素及利福平的固体LB培养基上，28℃下倒置培养；长出单克隆后，用JC GFP-F、JC GFP-R为引物鉴定GFP基因，保存阳性菌落；
(4)将保存的阳性菌株菌液接种到含有相应抗性的农杆菌液体LB基础培养基，在28℃的条件下暗培养，转速为200rpm摇菌；当菌液浓度OD600值至0.6到0.8之间时，离心富集菌体；用毛状根液体培养基(SH基础培养基，15g·L-1蔗糖)重悬菌液至OD600值等于0.2-0.3，并加入乙酰丁香酮至100μmol·L-1，作为诱导籽粒苋毛状根的侵染液；
(5)籽粒苋毛状根的获取：将已经剪好的外植体放到诱导籽粒苋毛状根的侵染液中，振荡孵育20min，然后置于无菌的滤纸上晾干；在共培养培养基上(SH基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+100μmol·L-1乙酰丁香酮)共培养，2天之后转移到毛状根诱导培养基(1/2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀)进行毛状根诱导；
(6)毛状根的传代培养：选取生长状态稳定的籽粒苋毛状根，继代在毛状根培养培养基(1/2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀)
(7)籽粒苋毛状根荧光观察及基因组DNA的提取：利用体式荧光显微镜的GFP激发光照射籽粒苋毛状根，挑选出带有绿色荧光的阳性毛状根系。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过发根农杆菌LBA9402介导，通过籽粒苋毛状根***导入外源基因并获得基因编辑毛状根。首先确认了适合籽粒苋基因编辑的载体***并获得了基因编辑的籽粒苋毛状根系。进一步对发根农杆菌介导的Ti和Ri质粒的T-DNA共转化进行了鉴定，首次获得了PHSE401-GFP-PDS基因共转化的毛状根系，为已测序的籽粒苋品种(Amaranthushybridus L)提供了毛状根转化体系，有利于对籽粒苋进行基因功能的研究。后期可对其毛状根进行再生诱导的条件探索，相比于整株植物遗传转化的难度，籽粒苋毛状根生长迅速，周期短，时间成本低，遗传稳定性好，是研究籽粒苋功能的良好体系。
附图说明
图1矮状素对下胚轴过度生长的影响。
(A)未加矮状素的籽粒苋幼苗生长状况；(B)籽粒苋种子分别在0mg·L-1矮状素，0.5mg·L-1矮状素，1mg·L-1矮状素下的生长状况；(C)不同浓度下矮状素下的生长状况柱状图；
图2为LBA9402发根农杆菌诱导籽粒苋不同外植体绿色荧光的毛状根。
(A)籽粒苋种子在1/2MS培养基上萌发；(B)籽粒苋无菌苗下胚轴在共培养培养基上；(C)籽粒苋无菌苗下胚轴在毛状根诱导培养基上产生毛状根；(D)籽粒苋下胚轴产生的毛状根；(E)下胚轴诱导产生的毛状根所带的绿色荧光；(F)籽粒苋无菌苗叶片；(G)籽粒苋无菌苗叶片在共培养培养基上；(H)籽粒苋无菌苗叶片在毛状根诱导培养基上产生毛状根；(I)籽粒苋无菌苗叶片产生的毛状根；(J)籽粒苋无菌苗叶片产生的绿色荧光毛状根。
图3籽粒苋毛状根的DNA分子鉴定。
(A)籽粒苋毛状根rolB基因的琼脂糖凝胶电泳图；(B)籽粒苋毛状根Vir G基因的琼脂糖凝胶电泳图；(C)籽粒苋毛状根GFP基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图4籽粒苋不同外植体的毛状根诱导阳性率统计：(A)籽粒苋无菌苗叶片毛状根诱导统计；(B)籽粒苋无菌苗下胚轴毛状根诱导统计。
图5籽粒苋毛状根载体PHSE401-GFP-PDS骨架示意图。
图6籽粒苋毛状根带有靶位点的PDS基因部分扩增。
(A)AhPDS Target1扩增琼脂糖凝胶电泳图谱；
(B)AhPDS Target2扩增琼脂糖凝胶电泳图谱。
图7为靶位点具体编辑方式图。
(A)Target1编辑的具体方式；(B)Target2编辑的具体方式。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明做进一步详细说明。
实施例1选择适合籽粒苋无菌苗生长的矮壮素浓度
1)籽粒苋种子的消毒：选取20％次氯酸钠(NaClO)溶液1ml(800μl无菌水、200μlNaClO)对种子进行消毒。
2)制备籽粒苋无菌苗生长培养基：以1/2MS培养基为基础培养基，分别以三个浓度梯度(0mg·L-1矮状素、0.5mg·L-1矮状素、1mg·L-1矮状素)加入至培养基中。
3)测量籽粒苋下胚轴长度：
其结果如图1所示，相比较0mg·L-1矮状素，1mg·L-1矮状素和0.5mg·L-1矮状素的效果最好，其下胚轴平均长度约为5.06cm，相较于不加如矮状素的培养基下胚轴平均长度10.67cm和1mg·L-1矮状素培养基下胚轴平均长度为2.73cm来说即可以让籽粒苋下胚轴的长度明显缩短，不至于顶到瓶顶，又令其长度不会太短导致影响植株的正常生长。
实施例2获得带有籽粒苋基因编辑载体的发根农杆菌
1)根据以下步骤，进行籽粒苋可视化编辑PHSE401-GFP-PDS载体的构建，其最终骨架如图5所示。构建方法如下：
第一步、本载体选用PHSE401载体为骨架，使用Hind III限制性内切酶对PHSE401载体进行酶切，所得到的线性化载体使用诺唯赞胶回收试剂盒回收，记为PHSE401-HindIII。
酶切反应体系：
Hind III酶切反应程序：
37℃60min
第二步、以PHSE401为模板，以Atu6+Target1-F、Atu6+Target1-R为引物扩增Atu6-26+Target1片段；
扩增反应体系：
扩增AtU6-26+Target1片段反应程序：
第三步、以PHSE401为模板，以Target1+U6-26T-F、Target1+U6-26T-R为引物扩增Target1+sgRNA+U6-26T片段；
扩增反应体系：
扩增AtU6-26+Target1片段反应程序：
第四步、利用第二步和第三步产物进行重叠延伸PCR反应，取第二步和第三步产物PCR原液1ul,稀释至10ul作为模板，以AtU6+Target1-F、Target1+U6-26T-R为引物扩增AtU6promoter+Target1+sgRNA+AtU6-26T片段。
扩增反应体系：
扩增AtU6 promoter+Target1+sgRNA+AtU6-26T片段反应程序：
对扩增产物进行胶回收，胶回收后记为AtU6-26+T1。
第五步、将第一步所得线性化载体PHSE401-Hind III和第四步所得胶回收片段AtU6-26+T1，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒(购买于诺唯赞公司)进行infusion连接。
infusion反应体系：
infusion反应程序：
37℃反应60min
第六步、连接产物转化大肠杆菌感受态，利用401JC-F和401JC-R引物进行菌液PCR鉴定，并送擎科公司测序，比对测序结果获得第一轮PHSE401-ATU6+Target1骨架载体，记为“pHSE6401-Ⅰ骨架”。
检测反应体系：
检测反应程序：
第七步、选择第六步菌液，利用诺威赞质粒提取试剂盒提取pHSE6401-Ⅰ骨架质粒，利用Stu I限制性内切酶对pHSE6401-Ⅰ进行酶切，使用诺威赞胶回收试剂盒回收，所得线性化载体记作pHSE6401-ⅠStu I切。
酶切反应体系：
Stu I酶切反应反应程序：
37℃60min
第八步、以PHSE401为模板，以AtU6+Target2-F、AtU6+Target2-R为引物扩增AtU6-26+Target2片段；
扩增反应体系：
扩增AtU6-26+Target2片段反应反应程序：
第九步、以PHSE401为模板，以Target2+U6-26T-F、Target2+U6-26T-R为引物扩增Target2+sgRNA+U6-26T片段；
扩增反应体系：
扩增AtU6-26+Target2片段反应反应程序：
第十步、利用第八步、第九步产物进行重叠延申PCR反应，取第八步、第九步PCR原液1ul，稀释至10ul作为模板，以AtU6+Target2-F、Target2+U6-26T-R为引物扩增ATU6promoter+Target2+sgRNA+ATU6-26T片段。
扩增反应体系：
扩增AtU6 promoter+Target2+sgRNA+AtU6-26T片段反应程序：
对扩增产物进行胶回收，胶回收后记为AtU6-26+T2。
第十一步。将第七步所得线性化载体PHSE401-I Stu I切和第十步所得胶回收片段AtU6-26+T2，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒(购买于诺唯赞公司)进行infusion连接。
infusion反应体系：
infusion反应反应程序：37℃60min。
第十二步、连接产物转化DH5a感受态，利用401JC-F、401JC-R引物进行菌液PCR鉴定，并送擎科公司测序，比对测序结果获得第二轮PHSE401-ATU6+Target2骨架载体，记为“pHSE6401-Ⅱ骨架”。检测反应体系：
检测反应程序：
第十三步、选取第十二步的菌液，利用诺威赞质粒提取试剂盒提取pHSE6401-Ⅱ骨架质粒，利用Pme I限制性内切酶对pHSE6401-Ⅱ进行酶切，使用诺威赞胶回收试剂盒回收，所得线性化载体记作pHSE6401-ⅡPme I切。
第十四步、以华大基因合成的Mas promoter+GFP+NOS T基因为模板，401-GFP F、401GFP-R为引物，扩增Mas promoter+GFP+NOS T片段。
扩增反应体系：
扩增Mas promoter+GFP+NOS T片段反应反应程序：
对扩增产物进行胶回收，记作Mas promoter+GFP+NOS T。
第十五步、将第十三步所得线性化载体pHSE6401-ⅡPme I切和第十四步所得胶回收片段Mas promoter+GFP+NOS T，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒(购买于诺唯赞公司)进行infusion连接。
infusion反应体系：
infusion反应反应程序：
37℃60min
第十五步、连接产物转化DH5a感受态，利用401JC GFP-F和401JC GFP-R引物进行菌液PCR鉴定，并送擎科公司测序，比对测序结果获得最终载体PHSE401-GFP-PDS。
检测反应体系：
检测反应程序：
整个PHSE401-GFP-PDS载体构建引物如下表1所示：
表1：载体构建所需引物
(2)带有基因编辑载体的发根农杆菌获取：将所构建的PHSE401-GFP-PDS质粒400-500ng加入至LBA9402发根农杆菌感受态(50ul)中，冰浴30min，将转入质粒的感受态细胞放置于液氮中速冻2-3min，后放置于37℃水浴锅中水浴3min，随后冰浴3min，加入400ul的无抗LB，28℃摇床中震荡孵育2-4h，放入高速离心机中，4500rpm离心10min，去除200ul上清液，用剩下的200ulLB重悬沉淀菌，将重悬后的菌液涂于带有卡那霉素和利福平抗生素的固体LB培养皿上，等待2天长出单克隆后，挑取单克隆于400ulLB(kan+rif)28℃摇床中震荡孵育过夜。随后利用引物JC GFP-F、JC GFP-R进行阳性菌鉴定，引物序列见表2。
表2：载体检测引物
实施例3：籽粒苋毛状根的获取
1)将已经剪好的外植体放到诱导籽粒苋毛状根的侵染液中，振荡孵育20分钟，然后置于无菌的滤纸上晾干。晾的时间不宜过长，防止叶片以及下胚轴失水萎蔫。在共培养培养基上(SH基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+100μmol·L-1乙酰丁香酮)共培养，2天之后转移到毛状根培养培养基(1/2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀)进行毛状根诱导。籽粒苋外植体产生毛状根后，进行继代培养，继代培养基同上(1//2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀)，14-20天毛状根可以稳定增殖生长。
实施例4：筛选出最适诱导毛状根的外植体
1)选取外植体：取35-45天的籽粒苋无菌苗新鲜叶片，将籽粒苋的无菌苗叶片剪成大小约2-3cm2的小段、另取7-10天左右的籽粒苋无菌苗下胚轴部，将其剪成约1cm的小段，留以备用。
2)不同外植体毛状根的诱导：将取好的约2-3cm2的叶片小段以及1cm的下胚轴小段放到诱导籽粒苋毛状根的侵染液中，振荡孵育20分钟，然后置于无菌的滤纸上晾干。晾的时间不宜过长，防止叶片以及下胚轴失水萎蔫。在共培养培养基上(SH基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+100μmol·L-1乙酰丁香酮)共培养，2天之后转移到毛状根培养培养基(1/2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀)进行毛状根诱导。
3)外植体诱导率和阳性率的统计
籽粒苋无菌苗下胚轴诱导及成熟叶片的诱导过程如图2所示，在整个培养过程持续观察发现，籽粒苋无菌苗的无菌苗下胚轴毛状根诱导率较高，且阳性率较高(图4中的(A))，籽粒苋无菌苗成熟叶片的毛状根诱导率较低，同时阳性率较低(图4中的(B))。综合以上，选择籽粒苋下胚轴作为后续基因编辑诱导的毛状根外植体。
实施例5：籽粒苋毛状根PCR检测
1)毛状根DNA提取：取实施例4新鲜的籽粒苋毛状根或再生植株叶片剪碎置于1.5mL离心管中，加入2×CTAB提取液1mL，使用小研杵捣碎后充分混匀，65℃水浴60分钟，在水浴期间轻轻颠倒离心管几次。水浴结束后，待液体冷却至室温加入等体积的氯仿剧烈震荡15秒，12000rpm室温离心10分钟，取上清液转移到新的1.5mL离心管中，然后加入等体积的异丙醇震荡混匀，于-20℃冰箱中沉淀30分钟，12000rpm室温离心10分钟。然后用1mL70％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5分钟，倒掉上清洗涤液。洗涤操作重复1次，最后自然干燥DNA，去除残余乙醇溶液。加入去离子水溶解DNA，超微量仪测定DNA浓度和比值。
2)PCR反应：青岛擎科生物技术有限公司合成rol B基因(AM422760.1)和vir基因、GFP基因的PCR引物，引物序列表3。
表3：毛状根鉴定引物
RCR扩增rolB基因和vir基因以及GFP基因，PCR反应总体系为20μL，分别加入rolB基因、vir G基因和GFP基因的上、下游引物各1μL(终浓度20pmol·L–1)，模板DNA2μL(约200ng)，2×MIX Buffer10μL，6μL的去离子水补齐20μL反应总体系。PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸45秒，28个循环；72℃延伸10min，然后取出PCR反应产物4℃恒温保存。各取10μL rolB基因、vir G基因和GFP基因的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳(1.0％)并拍照，点样时5μL 2000bp LadderMaker作为分子量标准。
通过毛状根的胶图观察得到rolB基因、vir G基因和GFP基因PCR产物大小分别为194bp、529bp和280bp(图3中的(A)、(B)、(C))符合预期。
实施例6：籽粒苋毛状根靶位点的扩增及检测
1)靶位点的选择：因目前基因组编辑靶位点选择网站暂时没有收录籽粒苋基因组，故选择利用phytozome网站找到籽粒苋基因组(Amaranthus hypochondriacus v2.1)，选择keyword search，输入PDS进行查找。根据以下原则进行靶位点的选择：
①GC含量在40％-60％之间为宜；
②避免以TTC或TTT结尾，或在最后的核苷酸中仅包含T和C，超过两个T或至少一个TT和一个T或C。
③序列中应不包含TTTT。该无法用U6/U3启动子转录，因为其终止了转录；
④PAM区应尽量避免GGG/CCC等；
⑤尽可能避免脱靶；
⑥靶位点自身形成的发卡结构要≤4为宜。
2)靶位点的扩增：利用引物PDS JC1 F1:5'-ACTGCTACTGCTAAATTCCA-3',PDS JC1R1:5'-AAGACAACAAGACCCTAATG-3'；PDS JC2 F2:5'-TTCTTGCTCCACAGGTTGCAG-3',PDS JC2R2:5'-ATTGTAAGTGGGGTCATGTC-3'；对靶位点进行扩增检测，其PCR产物大小分别为574bp和494bp(图6)符合预期。
3)基因组编辑检测：将所扩增的靶位点PCR原液送以公司进行Sanger测序，选择双峰PCR原液，将胶回收产物连接至T载体，利用通用引物M13F、M13R进行进一步单克隆测序以确定其编辑方式。其靶位点具体编辑方式如表4所示。靶位点具体编辑方式的基因片段图如图7所示：
表4籽粒苋PDS基因编辑方式汇总
注：不同靶标的突变类型的详细表征：i：***d：删除r:替换c:组合突变(一个等位基因中有一个以上的突变类型)。
总之，本发明建立了籽粒苋毛状根的遗传转化及基因组编辑体系，为苋科苋属植物籽粒苋的遗传育种和基因功能分析等提供了技术支持，籽粒苋毛状根系可以作为研究籽粒苋根基因功能的模型，因此籽粒苋毛状根诱导及其基因组编辑体系的建立有助于快速鉴定籽粒苋根的基因功能。最后，籽粒苋毛状根诱导体系的建立可以为其以后的研究提供技术体系，缩短研究周期，提高实验的可重复性和稳定性。

Claims (10)

1.一种发根农杆菌介导的籽粒苋毛状根基因组编辑方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)获得诱导籽粒苋毛状根外植体材料：取5-7天的籽粒苋无菌苗的下胚轴；将籽粒苋的下胚轴剪成小段，并使用针头轻轻扎籽粒苋下胚轴，造成伤口，作为诱导籽粒苋毛状根的外植体；
(2)籽粒苋可视化编辑载体PHSE401-GFP-PDS的构建：
(3)冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化发根农杆菌LBA9402感受态细胞，冰上融化后，加入3mL 200ng/ul的PHSE401-GFP-PDS质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻2-3分钟；然后37℃水浴3min加入400μL无抗生素的LB培养基，28℃，200rpm，振荡培养2-4h；离心浓缩菌液，取菌液，涂于加卡那霉素及利福平的固体LB培养基上，28℃下倒置培养；长出单克隆后，用JC GFP-F、JC GFP-R为引物鉴定GFP基因，保存阳性菌落；所述的JC GFP-F:5'-ATATATCCTGTCAAACACTG-3'，
JC GFP-R:5'-GCTAGAGCAGCTTGAGCTTG-3'；
(4)将保存的阳性菌株菌液接种到含有相应抗性的农杆菌液体LB基础培养基，在28℃的条件下暗培养，转速为200rpm摇菌；当菌液浓度OD600值至0.6到0.8之间时，离心富集菌体；用毛状根液体培养基重悬菌液至OD600值等于0.2-0.3，并加入乙酰丁香酮至100μmol·L-1，作为诱导籽粒苋毛状根的侵染液；所述的毛状根液体培养基为SH基础培养基+15g·L-1蔗糖；
(5)籽粒苋毛状根的获取：将已经剪好的外植体放到诱导籽粒苋毛状根的侵染液中，振荡孵育20min，然后置于无菌的滤纸上晾干；
在共培养培养基上共培养，2天之后转移到毛状根诱导培养基进行毛状根诱导；所述的共培养培养基为SH基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+100μmol·L-1乙酰丁香酮，所述的毛状根诱导培养基为1/2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀；
(6)毛状根的传代培养：选取生长状态稳定的籽粒苋毛状根，继代在毛状根培养培养基，所述的毛状根培养培养基为1/2MS基础培养基+15g·L-1蔗糖+7.8g·L-1琼脂+300mg·L-1特美汀；
(7)籽粒苋毛状根荧光观察及基因组DNA的提取：利用体式荧光显微镜的GFP激发光照射籽粒苋毛状根，挑选出带有绿色荧光的阳性毛状根系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PHSE401-GFP-PDS载体构建方法如下：
第一步、选用PHSE401载体为骨架，使用Hind III限制性内切酶对PHSE401载体进行酶切，所得到的线性化载体PHSE401-Hind III；
第二步、以PHSE401为模板，以Atu6+Target1-F、Atu6+Target1-R为引物扩增Atu6-26+Target1片段，得到扩增产物1；
第三步、以PHSE401为模板，以Target1+U6-26T-F、Target1+U6-26T-R为引物扩增Target1+sgRNA+U6-26T片段，得到扩增产物2；
第四步、利用扩增产物1和扩增产物2为模板进行重叠延伸PCR反应，以AtU6+Target1-F、Target1+U6-26T-R为引物扩增AtU6promoter+Target1+sgRNA+AtU6-26T片段，获得扩增产物3，对扩增产物进行胶回收，胶回收后记为AtU6-26+T1；
第五步、将第一步所得线性化载体PHSE401-Hind III和第四步所得胶回收片段AtU6-26+T1，进行infusion连接；
第六步、连接产物转化大肠杆菌感受态，利用401JC-F和401JC-R引物进行菌液PCR鉴定，测序，比对测序结果获得第一轮PHSE401-ATU6+Target1骨架载体，记为“pHSE6401-Ⅰ骨架”；
第七步、提取pHSE6401-Ⅰ骨架质粒，利用Stu I限制性内切酶对pHSE6401-Ⅰ进行酶切，回收，所得线性化载体记作pHSE6401-ⅠStu I切；
第八步、以PHSE401为模板，以AtU6+Target2-F、AtU6+Target2-R为引物扩增AtU6-26+Target2片段；
第九步、以PHSE401为模板，以Target2+U6-26T-F、Target2+U6-26T-R为引物扩增Target2+sgRNA+U6-26T片段；
第十步、利用第八步、第九步的扩增产物为模板进行重叠延申PCR反应，以AtU6+Target2-F、Target2+U6-26T-R为引物扩增ATU6promoter+Target2+sgRNA+ATU6-26T片段；
第十一步、将第七步所得线性化载体PHSE401-I Stu I切和第十步所得胶回收片段AtU6-26+T2，进行infusion连接；
第十二步、将第十一步的连接产物转化DH5a感受态，利用401JC-F、401JC-R引物进行菌液PCR鉴定，测序，比对测序结果获得第二轮PHSE401-ATU6+Target2骨架载体，记为“pHSE6401-Ⅱ骨架”；
第十三步、提取第十二步获得pHSE6401-Ⅱ骨架质粒，利用Pme I限制性内切酶对pHSE6401-Ⅱ进行酶切，回收，所得线性化载体记作pHSE6401-ⅡPme I切；
第十四步、以合成的Mas promoter+GFP+NOS T基因为模板，401-GFP F、401GFP-R为引物，扩增Mas promoter+GFP+NOS T片段，对扩增产物进行胶回收，记作Mas promoter+GFP+NOS T；
第十五步、将第十三步所得线性化载体pHSE6401-ⅡPme I切和第十四步所得胶回收片段Mas promoter+GFP+NOS T，进行infusion连接；
第十六步、连接产物转化DH5a感受态，利用401JC GFP-F和401JC GFP-R引物进行菌液PCR鉴定，测序，比对测序结果获得最终载体PHSE401-GFP-PDS；
载体构建所需引物如下：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二步中所述扩增产物1的反应体系：PHES401质粒DNA 250ng；2×Phanta Max Master Mix 25uL，Atu6+Target1-F 2.5ul，Atu6+Target1-R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；扩增产物1的反应程序：95℃3min，95℃15s、51℃15s、72℃30s、29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第三步中扩增产物2的反应体系：PHES401质粒DNA250 ng，2×Phanta Max Master Mix 25uL，Target1+U6-26T-F 2.5ulTarget1+U6-26T-R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；所述扩增产物2的反应程序95℃3min；95℃15s、47℃15s，72℃20s，35循环；72℃延伸5min，4℃保存。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第四步中的扩增产物3的反应体系：Atu6-26+Target1的DNA2.5 ul，Target1+sgRNA+U6-26T的DNA 2.5ul，2×Phanta MaxMaster Mix25ul，AtU6+Target1-F2.5ul，Target1+U6-26T-R2.5 ul，ddH2O补充到50ul；扩增产物3的反应程序：95℃3min；95℃15s、65℃15s、72℃1min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第五步中的infusion反应体系：PHSE401-Hind III切DNA160ng，AtU6-26+T1的DNA16ng，5×CE II Buffer2 ul，Exnase II1ul，ddH2O补充到10ul；infusion反应程序：37℃反应60min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第六步的检测反应体系：菌液DNA1ul，2×TaqMax MasterMix10 ul，401JC-F1 ul，401JC-R1 ul，ddH2O补充到20ul；所述第六步的检测反应程序：95℃5min，95℃30s、55℃30s、55℃30s，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤七中的酶切反应体系：pHSE6401-Ⅰ质粒DNA1ug，Stu I 1ul，10×M Buffer2ul，ddH2O补充到20ul；Stu I酶切反应反应程序：37℃60min。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第八步的扩增反应体系：PHES401质粒DNA250 ng，2×PhantaMax MasterMix 25uL，AtU6+Target2-F 2.5ul，AtU6+Target2-R2.5ul，ddH2O补充到50ul；所述第八步的扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、51℃15s、72℃30s，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第九步扩增反应体系：PHES401质粒DNA250 ng，2×PhantaMax MasterMix 25uL，Target2+U6-26T-F2.5 ul Target2+U6-26T-R2.5ul，ddH2O补充到50ul；所述第九步扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、47℃15s、72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
所述第十步的扩增反应体系：AtU6-26+Target1的DNA2.5 ul，Target1+sgRNA+U6-26T的DNA2.5 ul，2×Phanta Max MasterMix 25ul，AtU6+Target2-F 2.5ul，Target2+U6-26T-R2.5 ul；ddH2O补充到50ul，对扩增产物进行胶回收，胶回收后记为AtU6-26+T2；
所述第十步的扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、65℃15s、72℃1s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
所述第十一步的infusion反应体系：PHSE401-I Stu I切的DNA160ng，Atu6-26+T2的DNA16ng，5×CE II Buffer2 ul，Exnase II 1ul；ddH2O补充到10ul；infusion反应的反应程序37℃60min；
所述第十二步的检测反应体系：菌液DNA1 ul，2×Taq Max MasterMix 10ul，401JC-F1ul，401JC-R 1ul；ddH2O补充到20ul；所述第十二步的检测反应程序：95℃5min，95℃30s、55℃30s、72℃2min，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
所述第十四步扩增反应体系：Mas promoter+GFP+NOS T的DNA 250ng，2×Phanta MaxMasterMix 25uL，401-GFP F 2.5ul，401-GFP R 2.5ul，ddH2O补充到50ul；所述第十四步的扩增反应程序：95℃3min，95℃15s、66℃15s、72℃1min40s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
所述第十五步infusion反应体系：pHSE6401-ⅡPme I的DNA160ng，Mas promoter+GFP+NOS T的DNA32ng，5×CE II Buffer2ul，Exnase II 1ul，ddH2O补充到10ul；infusion反应反应程序：37℃60min；
所述第十六步的检测反应体系：菌液DNA1 ul，2×Taq Max Master Mix10 ul，401JCGFP-F 1ul，401JC GFP-R1 ul，ddH2O补充到20ul；所述第十六步的检测反应程序：95℃5min，95℃30s、55℃30s、72℃1min50s，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
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