CN112194713B - 一种与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白fse5及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5及其编码基因和应用，属于基因工程领域。本发明提供的水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；提供所述蛋白FSE5，或其编码基因、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育改善淀粉颗粒发育的水稻中的应用。将本发明蛋白FSE5的编码基因导入淀粉淀粉颗粒发育异常的植物中，可以培育淀粉颗粒正常的转基因植物。本发明对于进一步阐明禾本科植物胚乳淀粉颗粒发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段对谷物品质的遗传改良具有重要的理论意义和现实意义。

Description

一种与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白FSE5及其编码基因 和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
水稻是我国三大重要的粮食作物之一，有超过一半的人口以稻米为主食。“绿色革命”的兴起和杂交稻的大面积推广，使水稻的产量有了大幅度的提高，基本满足人们的粮食需求。随着生活水平的提高，人们即要求能吃的饱，又要吃的好，对稻米品质提出了更高的要求。淀粉占稻米干重90%左右，以淀粉颗粒的形式于胚乳细胞中，其发育决定了稻米的产量、食味品质和最终的用途。到目前为止，淀粉合成的酶促反应过程研究的基本清楚，但是人们还是不能在体外合成淀粉。因此，深入研究水稻淀粉合成及淀粉颗粒的形成，将有助于我们通过基因工程的手段对稻米品质和产量进行改良。
水稻胚乳中含有的是复合型淀粉颗粒，即一个造粉体中含有多个亚颗粒。淀粉在造粉体中经过酶催化加工形成复合型淀粉颗粒，其直径为10-20 μm。当前水稻淀粉主要用于人们的日常主食以及米酒和糕点的制作。淀粉颗粒的大小影响其用途，小的淀粉颗粒在溶解性，流动性，膨胀势和糊化性方面都比大的淀粉颗粒有应用优势，可以作为添加剂用于食品工业，化妆品和生物工程等领域。小淀粉颗粒的制备主要由机械破碎和从植物原料中直接提取两种方法，如果能从水稻胚乳中直接获取小的淀粉颗粒将大大增加水稻淀粉的工业用途。
水稻粉质胚乳突变体是一类因淀粉合成、积累异常而导致胚乳呈现粉质不透明表型的突变体，是研究胚乳发育及其调控网络的理想遗传材料。到目前为止，水稻中至少已经克隆了30个突变后造成胚乳粉质表型的基因。这些基因大部分是直接参与淀粉合成过程中的合成酶，另一些则通过其它途径间接参与淀粉合成。PPR（Pentatricopeptide repeat）蛋白广泛存在于植物中，亚细胞常定位于叶绿体或是线粒体中，参与RNA的转录、剪切、编辑和稳定性等转录后的调控过程。有研究表明，PPR对植物的种子和胚乳发育具有重要作用。FSE5属于PPR蛋白家族的一个成员，但其在水稻中的功能还未被研究。
发明内容
本发明的目的是提供与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白及其编码基因与应用。将本发明蛋白FSE5的编码基因导入淀粉淀粉颗粒发育异常的植物中，可以培育淀粉颗粒正常的转基因植物。本发明对于进一步阐明禾本科植物胚乳淀粉颗粒发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段对谷物品质的遗传改良具有重要的理论意义和现实意义。
本发明提供水稻淀粉颗粒发育相关的蛋白（FSE5），来自稻属水稻（Oryza sativa
var. Kitaake)，是如下(a)或(b)的蛋白质：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷蛋白分选相关的由序列1衍生的蛋白质。
序列表中的序列1由395个氨基酸残基组成，自氨基末端第82至330位为PPR结构域。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的FSE5的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述淀粉颗粒相关蛋白的基因（FSE5）也属于本发明的保护范围。
所述基因FSE5可为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：
1）序列表中序列2所示的DNA分子；
2）序列表中序列3所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码淀粉颗粒发育相关蛋白的DNA分子。
序列表中的序列2由1188个核苷酸组成。
所述严格条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。
含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305-35S载体的多克隆位点EcoRI之间重组***所述基因（FSE5）得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305-FSE5；所述pCAMBIA1305-FSE5是将由FSE5编码区序列以及上游2730 bp的启动子区和下游742 bp的片段通过重组技术***到pCAMBIA1305-35S多克隆位点EcoRI之间得到的(南京诺唯赞公司，非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒)。
含有以上任一所述基因（FSE5）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述基因（FSE5）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。因此，本发明还提供扩增如SEQ ID NO.2所示序列的编码基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示；扩增如SEQ ID NO.3所示序列的基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
本发明提供的培育淀粉颗粒发育正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入淀粉颗粒发育异常的植物中，得到淀粉颗粒发育正常的转基因植物；所述淀粉颗粒发育异常植物为淀粉颗粒变小的植物；所述淀粉颗粒发育正常的转基因植物为胚乳恢复成透明外观，淀粉颗粒变成复合型淀粉的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入造粉体发育异常植物中；所述淀粉颗粒发育异常植物可为fse5。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
本发明具有如下有益效果：
本发明的淀粉颗粒发育相关蛋白影响水稻胚乳中淀粉颗粒的形成过程。将所述蛋白的编码基因导入淀粉颗粒变小的植物中，可以得到淀粉颗粒发育正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于谷物的遗传改良。
附图说明
图1为野生型Kitaake和突变体fse5的糙米以及扫描电镜观察。
图2为野生型Kitaake和突变体fse5发育时期胚乳淀粉颗粒的形态观察，其中A为野生型灌浆9天胚乳的半薄切片观察；B为突变体灌浆9天胚乳的半薄切片观察；C为野生型灌浆15天胚乳的半薄切片观察；D为突变体灌浆15天胚乳的半薄切片观察；A1为图A方框位置的放大；B1为图B方框位置的放大；C1为图C方框位置的放大；D1图D方框位置的放大。
图3为FSE5精细定位示意图，其中A为突变基因的精细定位；B为突变基因的结构示意图、C为突变位点的测序峰图；D为酶切标记对突变位点的验证。
图4为转基因植株PCR阳性检测结果。
图5为转pCAMBIA1305-FSE5的阳性植株T1代糙米表型。
图6为突变体和转pCAMBIA1305-FSE5的T1代糙米断面的扫描电镜。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、植物淀粉颗粒发育相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻粉质胚乳突变体fse5的表型分析
前期实验室在粳稻品种Kitaake突变体库中筛选获得了一个稳定遗传的粉质胚乳突变体家系，命名为fse5(Floury shrunken endosperm5)。
野生型（WT）糙米种子呈现透明状，突变体fse5种子呈现粉质不透明表型。利用扫描电子显微镜对两者的种子横断面的淀粉颗粒进行观察，发现野生型中淀粉颗粒排列致密，呈现多角形，而突变体中淀粉颗粒排列疏松，淀粉颗粒之间空隙较大（图1）。随后我们又通过半薄切片-光镜观察技术对野生型和突变体发育9天和15天的胚乳中淀粉颗粒进行了观察。结果显示，野生型胚乳细胞中含有的是复合型淀粉颗粒，每个淀粉体中含有多个亚颗粒（图2A, C, A1和C1），而突变体中胚乳中出现大量的小的单淀粉颗粒（图2B, D, B1和D1）。
综上所述，在突变体fse5在发育过程中，由于胚乳中形成小的单淀粉粒，造成淀粉颗粒之间空隙较大，成熟种子呈现粉质不透明表型。
二、目的基因定位
1、目的基因初步定位
将突变体fse5与广亲和籼稻品种Dular进行杂交(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)，从fse5/Dular的F2分离群体中随机选取20粒呈现粉质表型的糙米，无菌条件下进行种子发芽。利用生长一星期大小的幼苗提取DNA，测定DNA的浓度后，等量混匀构建混合基因组池。利用覆盖水稻全基因组的Indel引物进行fse5和Dular的多态性筛选，从中每间隔10cM左右挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本fse5和Dular的DNA连同混池DNA共计三个模板，分别利用挑选好的覆盖水稻12条染色体的且具有多态的引物进行连锁分析，最后将FSE5定位在第5染色体标记ZL5-7和ZL5-3之间。
上述Indel标记分析的方法如下所述：
（1）利用CTAB法提取上述选取单株的DNA，操作如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
取0.1 g左右的水稻幼嫩叶片，置于2 ml的Eppendorf管中，加上钢珠盖紧盖子放入液氮5min，置于上下震荡研磨机（上海净信）中粉碎样品1min。
Figure 690746DEST_PATH_IMAGE002
加入500 μl提取液（含100mM Tris-Hcl（PH 8.0），20mM EDTA（PH 8.0），1.4MNaCl, 0.2g/ml CTAB溶液），漩涡器上剧烈涡旋混匀，65℃水浴30 min，期间每隔10min上下颠倒样品混匀。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
加入500 μl氯仿/异戊醇（体积比为24:1），充分混匀，静置10 min后，12000rpm离心10 min。
Figure 483253DEST_PATH_IMAGE004
小心吸去300 μl的上清（不要洗到分层处的沉淀）到新的1.5 mL Eppendorf管中，加入600 μl的纯酒精，混匀后置于负20℃冰箱中30 min。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
12000 rpm离心10 min，去上清，加入70%的酒精将沉淀洗两遍，室温下吹干。
Figure 574575DEST_PATH_IMAGE006
加入100 μl的超纯水溶解DNA。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
取1 μl溶解后的DNA，利用One Drop微量分光光度计测定DNA的浓度。
Figure 32101DEST_PATH_IMAGE008
最后将20个粉质表型的单株DNA混匀到一个2 mL Eppendorf管中构建混合基因组池，每个样品在混样中的终浓度为100 ng/μl。
（2）分别以fse5，Dulaer和混合基因组池，作为模板分别进行全染色体组多态引物的PCR扩增。
PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul) 1 ul，前引物(2pmol/ul) 1 ul，后引物(2pmol/ul) 1 ul，10xBuffer(MgCl2 free) 1ul，dNTP(10 mM) 0.2 ul， MgCl2 (25mM) 0.6ul，rTaq酶(5 u/ul) 0.1 ul，ddH2O 5.1 ul，共10 ul。
PCR反应程序：98.0℃变性5 min；98.0℃变性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸40 s，共循环33次；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR反应在朗基A100热循环仪中进行扩增。
（3）Indel标记的PCR产物检测
扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50 bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
2、突变基因精细定位
根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发Indel标记，以便在初定位区段内筛选更多标记用于精细定位。从fse5/Dular杂交组合获得的F2分离群体中挑出确认为突变表型的F2种子，作为精细定位的群体。精细定位的引物是根据美国NCBI数据库中公布的水稻亚种籼稻和粳稻的基因组序列，比对两者之间的序列差异设计Indel标记，具体方法如下：
（1）Indel标记开发
将水稻公共遗传图谱与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。将序列逐段在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列（9311）进行比较，如果两者的序列有4个及4个以上碱基的差异（可以是碱基***也可以是碱基缺失），初步推断该Indel引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计Indel引物，并由北京博迈德生物技术有限公司合成。将自行设计的Indel成对引物等比例混合，检测其在FSE5和Dular之间的多态性，表现多态的引物用作FSE5基因的精细定位分子标记。精细定位的引物见表1。
表1 用于精细定位的分子标记
标记 前引物 后引物 所在克隆
I5-3 5’ GCTCCCCTCAACTTTTCCTC 3’ 5’ TCGGTTGCCTGAATACCTTT 3’ OSJNOa0023G10
Z5-1 5’ TTTTCTTCCTCCTCCAGAGCC 3’ 5’ GCGTCCTCCTGTCGTCTCAT 3’ OSJNBb0067H15
Z5-8 5’ ACCATCTGCTAGTGTGGCTT 3’ 5’ GCTGGTTGTTTGGTGTTAGC 3’ OSJNBa0017O06
Z5-14 5’ GCATACTTTGTCGCTCCACA 3’ 5’ TCCTCATCATCAGTGCTGCT 3' OSJNBb0016G07
Z5-18 5’ TGCCTTCCTCCATAGCTCTG 3’ 5’ CCAGGAAACCGAGCAAAGAG 3’ OJ1430B02
标记分析的PCR反应体系： DNA(20 ng/ul) 2 ul，前引物(10 pmol/ul) 2 ul，后引物(10 pmol/ul) 2 ul，10xBuffer(MgCl2 free) 2 ul，dNTP(10mM) 0.4 ul， MgCl2 (25mM) 1.2ul，rTaq(5 u/ul) 0.4 ul，ddH2O 10 ul，总体积20 ul。
Indel引物扩增反应在朗基A100热循环仪PCR仪上进行：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ （引物不同，有所调整）40 s，72℃ 1 min，33个循环；72℃ 10 min。
根据F2群体中胚乳粉质单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法，最终把FSE5基因精细定位在PAC克隆OJ1430B02的标记Z5-14和Z5-18之间，物理距离约为85 kb（图3A）。候选区段含有10个预测的开放阅读框（ORF）。对10个ORF的基因组序列进行测序发现，突变体中ORF6基因Os05g0207200中存在一个碱基G的缺失（图3B, C），在此位点设计了CAPS酶切标记再次证实了缺位位点的存在（图3D）。单碱基G的缺失造成突变体翻译的蛋白提前终止。
(3）突变基因的获得
根据定位的位点设计引物，序列如下所述：
primer1：
5'-ATGGAGTCCGTCCTCGCCCG-3'（SEQ ID NO.4）
primer2：
5'-TCAAGCCAAGCTCAAATT-3'（SEQ ID NO.5）
以primer1和primer2为引物，以Kitaake的胚乳的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。
扩增反应在朗基A100热循环仪PCR仪上进行：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，33个循环；72℃ 7 min。将PCR产物琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，克隆到中间载体pEASY-Blant上(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京全式金公司CD201），挑选阳性克隆后，进行测序。
序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的CDS核苷酸序列，编码395个氨基酸残基组成的蛋白质（从ATG到TGA）（见序列表的SEQ ID NO.1）。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为FSE5（即为精细定位中所述的Os05g0207200基因），将SEQID NO.1所示的蛋白的编码基因命名FSE5。
实施例2、转基因植物的获得和阳性鉴定
一、重组表达载体构建
以粳稻Kitaake(购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库)的DNA为模板，进行PCR扩增获得FSE5基因，PCR引物序列如下：
primer3 (下划线所示的序列为EcoRI酶切位点)：
5' CCATGATTACGAATTCCTAGGATGCCATGTCAACGAA 3'（SEQ ID NO.6）
primer4 (下划线所示的序列为EcoRI酶切位点)：
5' TACCGAGCTCGAATTCTTTCCCGATGTTAGCGACTG 3'（SEQ ID NO.7）
上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的上游2730 bp和下游742 bp，扩增产物包含了该基因的启动子部分，将PCR产物回收纯化，采用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（南京诺唯赞公司）将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1305-35S中，构建成pCAMBIA1305-FSE5。
重组反应体系(20.0 μL)：PCR产物1 μL(50-100 ng)，EcoR1单酶切后的pCAMBIA1305-35S载体2 μL(30-50 ng)，5×CE II buffer加4.0 μL，Exnase II酶2.0 μL，ddH2O加11.0 μL。反应体系配完后，使用移液枪上下轻轻吹打混匀，置于37℃反应30 min。反应后立即取出放入冰水浴中5 min，取10 μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京全式金公司CD201）。将全部转化细胞均匀涂布在含50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养过夜，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的基因的重组表达载体，将含有FSE5的pCAMBIA1305命名为pCAMBIA1305-FSE5，FSE5基因***在多克隆位点EcoRI之间。
二、重组农杆菌的获得
利用热激法将pCAMBIA1305-FSE5转化农杆菌EHA105菌株（购自美国英骏公司），得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1305-FSE5。
三、转基因植物的获得
将EH-pCAMBIA1305-FSE5转化突变体fse5，具体方法如下：
（1）28℃摇床上活化并培养重组菌株EH-pCAMBIA1305-FSE5，16 h后，4000 g离心5min收集菌体，并稀释到含有100 μmol/L乙酰丁香酮的N6液体培养基（Sigma公司，C1416）中至浓度为OD600≈0.5；
（2）将培养至一个月的fse5水稻成熟胚的胚性愈伤组织与步骤（1）的菌液混合侵染30 min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基（N6固体共培养培养基，Sigma公司）中，24℃共培养3 d；
（3）将步骤(2)的愈伤接种在含有100 mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选（20 d）；
（4）挑取健康愈伤转入含有100 mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每20 d继代一次；
（5）挑取健康愈伤转入含有50mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每20 d继代一次；
（6）挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；
得到分化成苗的T0代阳性植株。
四、转基因植株的鉴定
1、PCR分子鉴定
将步骤三获得的T1代植株提取基因组DNA,以基因组DNA为模板，利用Primer5和Primer6为引物对进行扩增（Primer5：TACGGCGAGTTCTGTTAGGTC（SEQ ID NO.8）和Primer6：GGATTGCACGCAGGTTCTC（SEQ ID NO.9））。PCR反应体系：DNA(50 ng/ul) 2 ul， Primer5(10pmol/ul) 2ul，Primer6(10 pmol/ul) 2ul，10xBuffer(MgCl2 free) 2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2 (25mM) 1.2ul，rTaq(5u/ul) 0.4ul，ddH2O 10ul，总体积20ul。扩增反应在朗基A100热循环仪PCR仪上进行：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1.5 min，33个循环；72℃ 8 min。
PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测，图4中泳道1和2为未转基因植株野生型和突变体fse5扩增产物(Primer5引物在基因组上和Primer6在载体上，因此未转基因的植株扩增不出来)；泳道3-5为转基因阳性株系，作为阳性对照。
2、转基因糙米表型鉴定
分别将转pCAMBIA1305-FSE5的T1代植株，野生型Kitaake和fse5种植在中国农科院转基因试验田内。种子成熟后分单株收种，然后去掉种子颖壳获得糙米。观察结果显示pCAMBIA1305-FSE5阳性植株的糙米中出现了透明的种子（图5，L1、L2、L3是三个不同的转基因株系），糙米横截面扫描电镜结果也表明互补株系L1和L2淀粉形态恢复正常（图6）。由此验证了转基因前的籽粒粉质不透明和胚乳淀粉颗粒变小的性状是由FSE5基因控制的，即FSE5基因为淀粉颗粒发育相关基因。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120>一种与水稻胚乳淀粉颗粒发育相关的蛋白FSE5及其编码基因和应用
<160> 9
<210> 1
<211> 395
<212> PROTEIN
<213> 稻属水稻（Oryza sativa L. japonica. cv. Kitaake）
<223> 淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5氨基酸序列
<400> 1
Met Glu Ser Val Leu Ala Arg Leu Pro Ser Ser Leu Arg Pro Arg Glu Pro Leu Leu Cys
Arg Val Ile Ser Ala Tyr Gly Arg Ala Arg Leu Pro Ala Ala Ala Arg Arg Ala Phe Ala
His Pro Ala Phe Pro Ala Pro Arg Thr Ala Arg Ala Leu Asn Thr Leu Leu His Ala Leu
Leu Ala Cys Arg Ala Pro Leu Pro Glu Leu Leu Ser Glu Cys Arg Gly Ser Gly Ile His
Pro Asp Ala Cys Thr Tyr Asn Ile Leu Met Arg Ala Ala Val Ala Asp Ser Gly Ser Val
Asp Asn Ala Cys Leu Leu Phe Asp Glu Met Leu Gln Arg Gly Ile Ala Pro Thr Val Val
Thr Phe Gly Thr Leu Val Thr Ala Phe Cys Glu Ala Gly Arg Leu Glu Glu Ala Phe Lys
Val Lys Glu Val Met Ser Leu Gln Tyr Asn Ile Arg Pro Asn Ala His Val Tyr Ala Ser
Leu Met Lys Ala Leu Cys Glu Lys Gly Lys Val Asp Asp Ala His Arg Leu Lys Glu Glu
Met Val Ser Asn Ser Glu Pro Leu Val Asp Ser Gly Ala Tyr Ala Thr Leu Ala Arg Ala
Leu Phe Arg Leu Gly Lys Lys Gly Glu Val Val Ser Leu Leu Glu Glu Met Lys Glu Lys
Gly Ile Lys Val Gly Arg Glu Val His Asn Ser Met Ile Ala Gly Phe Cys Glu Asp Glu
Gly Asp Leu Asp Ala Ala Phe Ala Ala Leu Asp Asp Met Gln Lys Gly Gly Cys Lys Pro
Asp Ser Val Ser Tyr Asn Thr Leu Val Gly Gly Leu Cys Lys Met Gly Arg Trp Arg Asp
Ala Ser Glu Leu Val Glu Asp Met Pro Arg Arg Gly Cys Arg Pro Asp Val Val Thr Tyr
Arg Arg Leu Phe Asp Gly Ile Cys Asp Ala Gly Gly Phe Ser Glu Ala Arg Arg Val Phe
Asn Glu Met Val Phe Lys Gly Phe Ala Pro Ser Lys Asp Gly Val Arg Lys Phe Val Ala
Trp Ile Glu Arg Glu Gly Asp Ala Ala Ser Leu Glu Ser Val Leu Cys Gln Leu Ala Ser
Val Asn Ala Leu Glu Ser Ser Glu Trp Glu Lys Ala Met Ser Gly Val Leu His Asp Pro
Ala Glu Gln Lys Ile Val Lys Leu Leu Asp Asn Leu Ser Leu Ala
<210> 2
<211> 1188
<212> DNA
<213> 稻属水稻（Oryza sativa L. japonica. cv. Kitaake）
<223> 淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的CDS序列
<400> 2
ATGGAGTCCG TCCTCGCCCG GCTCCCCTCC TCGCTCCGCC CGCGCGAGCC CCTCCTGTGC 60
CGCGTCATCT CCGCGTACGG CCGCGCCCGC CTCCCCGCCG CCGCCCGCCG CGCCTTCGCG 120
CACCCGGCGT TCCCGGCGCC GCGCACCGCC CGCGCCCTCA ACACGCTCCT CCACGCCCTC 180
CTCGCCTGCC GCGCGCCCCT CCCGGAGCTC CTCTCCGAGT GCCGCGGCTC CGGCATCCAC 240
CCCGACGCGT GCACCTACAA CATCCTAATG CGCGCCGCGG TGGCCGACTC TGGCTCCGTC 300
GACAACGCCT GCCTCCTGTT CGACGAAATG CTGCAGCGGG GGATCGCCCC GACTGTCGTC 360
ACGTTTGGCA CCCTCGTCAC TGCTTTCTGC GAGGCAGGAC GTCTAGAGGA GGCATTCAAG 420
GTTAAGGAGG TGATGTCTTT GCAGTACAAC ATTAGGCCGA ACGCTCATGT GTATGCGAGC 480
CTGATGAAGG CGCTCTGCGA GAAGGGGAAG GTGGATGATG CGCACAGACT CAAGGAGGAG 540
ATGGTGAGCA ATTCAGAACC TTTGGTGGAT TCAGGAGCTT ATGCGACGCT GGCAAGGGCA 600
TTGTTCCGGT TAGGGAAGAA AGGAGAGGTT GTTAGTTTGC TGGAAGAGAT GAAGGAAAAG 660
GGAATCAAGG TTGGTAGAGA AGTTCATAAT TCGATGATTG CAGGGTTTTG TGAGGATGAA 720
GGGGATCTGG ATGCTGCATT TGCAGCGCTC GATGACATGC AGAAGGGTGG GTGCAAGCCG 780
GACTCGGTGA GCTATAATAC ACTGGTTGGT GGTCTATGCA AGATGGGGCG GTGGCGGGAT 840
GCAAGTGAGT TGGTTGAGGA TATGCCACGA AGGGGATGCC GTCCTGATGT AGTCACCTAC 900
AGGAGGCTGT TTGATGGGAT TTGTGATGCT GGGGGGTTCA GCGAGGCGAG GAGGGTTTTC 960
AATGAGATGG TATTCAAGGG CTTTGCACCA AGCAAGGATG GTGTGAGGAA ATTTGTTGCA 1020
TGGATTGAGA GGGAAGGAGA TGCGGCGTCA CTGGAGTCAG TGTTGTGCCA ATTGGCTAGC 1080
GTTAACGCCT TGGAATCAAG TGAGTGGGAG AAGGCAATGA GTGGTGTGCT CCATGATCCT 1140
GCAGAGCAGA AGATTGTGAA GTTGCTGGAT AATTTGAGCT TGGCTTGA 1188
<210> 3
<211> 4658
<212> DNA
<213> 稻属水稻（Oryza sativa L. japonica. cv. Kitaake）
<223> 淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的基因序列
<400> 3
CTAGGATGCC ATGTCAACGA AATTAACCAG GCATCTATAC TACTGTGGAA CCTAAATTAC 60
ACGGTTTGGT ATAGTTTAGA GGTAAAGATT TCTGATATTG AGGATAAGGG ATATCAAACA 120
AACTCGGTGT AAAGTTGAGG GACAGCATGT GAACTTATTC CATTGAGAAA TAGCGAGACT 180
CGATCCGGCA CTTTAACCTT TTCATTTTTG AGGTTTTTGT CCCTCTCTTA GCACCACGTG 240
GCGCAGTTTC GTAGGCCCAA CAGAGGGCCA ATCAGTCGGC GCCGGCTTTA GATAAATAGA 300
TAGATTTGCA TTACATTATA ATGTCATGTG GGCTAGTTTC CTTTGTACTA AGCCATAGCT 360
TTATTACCTC ATGCCATTGA TAACTTGGGA ATCAATATAA TATGACTAGA TGTTGGTTTA 420
GAAAATGCTT AGTTATGCTT AGATCAACTA GCATACTATA CTATCTCTGT CCTAGAAAGA 480
CCACAATTTT GCTCCAATGT TTGACCGTCC ATCTTATTTG AAAAAAATTA TGATTAGTAT 540
TTTATTGCTA TTAGATGGTA AAATATGAAT AATACTTTAT GTGTGACTAC TTTTTTTATT 600
TTTGCATAAA GTTTTGAAAT AAAACGGACG GTCAAATGTT GAACACGGAA ATCCATAACT 660
GCACTAAAAT TGGGACGGAG ATATACCGTG GTGATGACAT TAGACATGTA CCATTGTGTT 720
TGTAATTCAA CTAAAACATG ACTTAATGAT TGCGCTGTGA GTACATCGTT TTGCTAGACG 780
TGCCCATGGC AGTTGATGAC TGGTTCACGT GAAACCTCTC GAAGATATAC CGTGCTTAAG 840
CAAGCATGGG CAACTACTGG ACTTGTAGTA TGACTCGACC CTTTTCTAGG CACCGAGGCA 900
AGGGTGCGCG TGATAGAGTT GGGTTGTCCC CGATTTAAGG GTTGATTGGA TGTCAGAGTC 960
ACCACGGCAC ACGAGGAGGG GCTGTCCACC CCGATTTAAG GGTGGGTAAA ACCTCGGTGT 1020
GGTGTGCATG GTTATGGGAG GGTTATGCGA AGGGGCCTGT TACGATTTTT CCCTTTACAG 1080
TACCATGGTG GTACTTTGGG GCATGGCAAC ATGCGTGGAA TCATGTCTCG TGAGTATAAT 1140
TGTACACCTC CGCCTAGAGT AGAACTATTT GAATAGCCGT GCGTATGGTT ATGGGCGATC 1200
AACCAACTTC GTCATGATTA GTCTCACCTT AATAAGTTTA GGTGGATGGT TGGGCTTGTC 1260
ATAACGTGGT GTAGCGTTGG ACAGCGATGA TTAATATTGC TTAATTTTGA TTTAACATTT 1320
TTACTGCTTT CAACTGCTGC TTTACCCTAA AAAAAAACTA GCCTCCTTAG AAATGCCTGC 1380
ATCATACCTT CTCTTATTAT GACTTGCTGA GTATAGTGAG TACCACTCAA TCTTTATTTT 1440
TCCCCAACCT CAAAGCTGGA GAATTCCTCA GACGAAGGCA AGTCGGAGGA GTAAGCTTCA 1500
TCCGTACCGT AAAGGATGCG TATGGAGTGG AGTCATGTGC TGCTAGCATC AGTTACCTTA 1560
GTTTAGCTAG CTTTTACCTT TTCTCGTGGC ATTTGTAAGA CTTTCTATAT GTTGTGTAAG 1620
ACGTGCGGAT GTTTGTCAGC TTTATCATTT GTGTACCCTA GTCGGTCCTG GACAGAGGTT 1680
TAATGTACAT TCTGCTTGGA ATTCTGGTTC ATGAATTTCT GAGCGTGACA CCGATGACAT 1740
CACTAAAAGA AACTAGTACT CCCTTCGTCC CAAAATAAGT ATAGTTTTGT ACTATTCATG 1800
TCCAATGTTT GACTGTTCGT CTTATTTGAA AACTTTTTAT GATTAATATT TTATTGTTAT 1860
TAGATGATAA AACATGAATA GTACTTTATG TGTATGTGTG ACGTGACTAT TTTCTTTTAA 1920
TTTTTTCATA AAATTTTCAA ATAAGATGGG TGGTAAAATG TTGGACACGG ATACCCACAG 1980
CTGCACTTAT TTTGGGACGG ATGGAGTAGG ATTTTGGGCT ATTCCAATTG TTTTTAGTTT 2040
CCTTGTTGAG TATTGCCTTC GTACGAACGC ACATCCTCTG CAGTACTGCT AATGCAGTAG 2100
CAGCGGCTGA CATGTGGGCC TGCTACTGCA TTAGCAGTAC TGCAGATAAT CTCCACTGAC 2160
CTTCGTACAT ATTACAATAC ACTTCGAATT TTTTAAGTAA AACTTTTTTA AGTTTAACCA 2220
AATTTATAAA AAAACATATC AATACTTTTA CATAAAAAAC AGTATAAAAA TATTTAATAT 2280
TTTATTTAAT GACACTATTC CCTTGCTATG AAAGTTGTTT TTCTTTTTAC AAACTTAATC 2340
AAACATATGG AAGTTTGAAA AAACAAATCG AACCGTATAA ACGGAGGGAG TGGTAGGCCT 2400
TGGGCTGCGT TGGGCTACTT ACCGCCAGGA AGCCCAATAG AGGTGTACGG CTTCAAAGCT 2460
TGCGCACGCC ACGTCGCCGG CCTCGAGTCG ACGACGCCGT AGCCCACCGA CATGAGCGGC 2520
GCCACCGCCA AGTTCTCTTC CTCCTACCAC CTCGCCGCCG CGCTCCGCCG CGAGCCCGAC 2580
CCGGCGGCCG CGCTCCGCCT CTTCCTCAGC CCCACCCCGA CCGCCGCCGC CGGGCCATCC 2640
TCCTCCCCCG CGCCGCCGTT CCGCTACTCC CTCCGCTGCT ACGACATCAT CGTCTGCAAG 2700
CTCGCCGCCG CGCGCCTCTT CCCGGCCATG GAGTCCGTCC TCGCCCGGCT CCCCTCCTCG 2760
CTCCGCCCGC GCGAGCCCCT CCTGTGCCGC GTCATCTCCG CGTACGGCCG CGCCCGCCTC 2820
CCCGCCGCCG CCCGCCGCGC CTTCGCGCAC CCGGCGTTCC CGGCGCCGCG CACCGCCCGC 2880
GCCCTCAACA CGCTCCTCCA CGCCCTCCTC GCCTGCCGCG CGCCCCTCCC GGAGCTCCTC 2940
TCCGAGTGCC GCGGCTCCGG CATCCACCCC GACGCGTGCA CCTACAACAT CCTAATGCGC 3000
GCCGCGGTGG CCGACTCTGG CTCCGTCGAC AACGCCTGCC TCCTGTTCGA CGAAATGCTG 3060
CAGCGGGGGA TCGCCCCGAC TGTCGTCACG TTTGGCACCC TCGTCACTGC TTTCTGCGAG 3120
GCAGGACGTC TAGAGGAGGC ATTCAAGGTT AAGGAGGTGA TGTCTTTGCA GTACAACATT 3180
AGGCCGAACG CTCATGTGTA TGCGAGCCTG ATGAAGGCGC TCTGCGAGAA GGGGAAGGTG 3240
GATGATGCGC ACAGACTCAA GGAGGAGATG GTGAGCAATT CAGAACCTTT GGTGGATTCA 3300
GGAGCTTATG CGACGCTGGC AAGGGCATTG TTCCGGTTAG GGAAGAAAGG AGAGGTTGTT 3360
AGTTTGCTGG AAGAGATGAA GGAAAAGGGA ATCAAGGTTG GTAGAGAAGT TCATAATTCG 3420
ATGATTGCAG GGTTTTGTGA GGATGAAGGG GATCTGGATG CTGCATTTGC AGCGCTCGAT 3480
GACATGCAGA AGGGTGGGTG CAAGCCGGAC TCGGTGAGCT ATAATACACT GGTTGGTGGT 3540
CTATGCAAGA TGGGGCGGTG GCGGGATGCA AGTGAGTTGG TTGAGGATAT GCCACGAAGG 3600
GGATGCCGTC CTGATGTAGT CACCTACAGG AGGCTGTTTG ATGGGATTTG TGATGCTGGG 3660
GGGTTCAGCG AGGCGAGGAG GGTTTTCAAT GAGATGGTAT TCAAGGGCTT TGCACCAAGC 3720
AAGGATGGTG TGAGGAAATT TGTTGCATGG ATTGAGAGGG AAGGAGATGC GGCGTCACTG 3780
GAGTCAGTGT TGTGCCAATT GGCTAGCGTT AACGCCTTGG AATCAAGTGA GTGGGAGAAG 3840
GCAATGAGTG GTGTGCTCCA TGATCCTGCA GAGCAGAAGA TTGTGAAGTT GCTGGATAAT 3900
TTGAGCTTGG CTTGATTATA TATCCCTATG GATTGTTGTC ACTGTACTGG TTGTTTTTCT 3960
GATCTGCCAC AGTAGTTTAC TGATTTAAAT TTGATGACTC TTGAGTAATT ATCATGGGAA 4020
GGAAAGAGAT ACAACATCAT CAATACGAGG AGTTTGTCAT TAAAAATACA TGCCAATCTA 4080
ACATCAATGG TGCATTCTTG AAGCAAATGA AGCAAGGAGT CATAGGGATG ATTGCAAGTG 4140
ATGATACAGA CCAAGTCTTA TTTTTCATAA CGCTGCCGTC TTCAGCAATG ATTGCAAACA 4200
GAGTTTGAGC ATGCAAATAT GCTCTGTCCT TGGCAAAGAT TTGGATCAAC CGCCTAATCA 4260
TCGTTGAGTA AGGCACTGCA AATCCAGTTG AGCTTCTATT TCTCTACGAT GTGGCATGGA 4320
GTCCATCCAA ATTTTTTACA CCGAAGAAAG ATGTCTGAAA ACTTGCAGCG GAGATATCAA 4380
AATTAAGAAA AAAAAAACTC GGTAGAGTAG GACATGAAAT TGCCTGGAAT GCAAAATTAT 4440
CAGGACTTAA TGCTGTTATG TTGTATTTTC AGTCCAAGTT CAGGGTTGTA TATAGCAATA 4500
TGAGCTCCGG GATTGTACCC CCTATACCCG TGATATCTAA TACTCCTAAA GATCTCTCTT 4560
TTCCCATAAT GAGGTAACTA GCCGAGATCA GCGAAAAGAA GAACAACACG AGTGCAACAG 4620
ATCTGGTGAC ATTTTTGTCA GTCGCTAACA TCGGGAAA 4658
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Primer1
<400> 4
atggagtccg tcctcgcccg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Primer2
<400> 5
tcaagccaag ctcaaatt 18
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Primer3
<400> 6
ccatgattac gaattcctag gatgccatgt caacgaa 37
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Primer4
<400> 7
taccgagctc gaattctttc ccgatgttag cgactg 36
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Primer5
<400> 8
tacggcgagt tctgttaggt c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> Primer6
<400> 9
ggattgcacg caggttctc 19

Claims (7)

1.一种水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5，或其编码基因、重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育改善淀粉颗粒发育的水稻中的应用，其特征在于，所述水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；且被改善的水稻存在水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的功能缺失。
2.一种培育淀粉颗粒发育正常的转基因水稻的方法，其特征在于将编码SEQ ID NO.1所示的水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的基因导入淀粉颗粒发育异常的水稻中，得到淀粉颗粒发育正常的转基因水稻；所述淀粉颗粒发育异常水稻为胚乳内淀粉颗粒呈现单一的小的颗粒的水稻，其存在水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的功能缺失；所述淀粉颗粒发育正常的转基因水稻为胚乳恢复透明状，淀粉颗粒形态变为大的复合型的转基因水稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于编码SEQ ID NO.1所示的水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的基因通过含有该基因的重组表达载体导入淀粉颗粒发育异常水稻中。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的水稻胚乳淀粉颗粒发育相关蛋白FSE5的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为双元农杆菌载体，或可用于植物微弹轰击的载体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体为在pCAMBIA1305-35S载体的多克隆位点EcoRI之间重组***所述基因得到的重组质粒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的重组表达载体中，还包含所述基因的3’端非翻译区域；在其转录起始核苷酸前具有增强型启动子或组成型启动子。
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