CN110760601B - 一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域，所述引物组包括Br No1、Br No2、Ch No1、Ch No2、Cl No1和Cl No2；所述Br No1、Br No2、Ch No1、Ch No2、Cl No1和Cl No2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。本发明的引物组和试剂盒具有特异性强、灵敏度高的优点。

Description

一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物 组、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用。
背景技术
马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、流产衣原体(Chlamydia abortus) 和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是羊群中常见的细菌病病原，流行极为广泛。布鲁氏菌可以引起羊的***炎、支气管炎、滑液囊炎、关节炎和***；流产衣原体可以引起羊地方性流产，表现为流产、死产和产弱羔，也可以引起子***、结膜炎和关节炎；产气荚膜梭菌可以引起羊快疫、羊猝疽、羊肠毒血症和羔羊痢疾等急病，可以造成羊的急性死亡，且细菌在羊群中广泛存在，给养羊业生产带来很大威胁。布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌为***共患病病原，对人的健康构成风险，产气荚膜梭菌能产生 12种毒素，对公共卫生安全有潜在风险。
布鲁氏菌和流产衣原体均为胞内寄生菌，近年来在世界范围内的流行趋势不断上升，且一旦发病很难根治；产气荚膜梭菌产生致死性毒素，可以造成动物短时间死亡，所以快速而又准确的诊断出疾病病原极为关键。
目前已存在多种针对布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的PCR检测方法，包括针对单一基因型和多种基因型同时检测的多重PCR方法，但同时对布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌进行检测的多重PCR体系尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用，该引物组和试剂盒能够同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌，且具有检测灵敏度高、特异性强的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组，所述引物组包括BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、Cl No1和Cl No2；
所述BrNo1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述BrNo2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述ChNo1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述ChNo2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述Cl No1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述Cl No2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明提供了一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。
优选的，所述试剂盒还包括2×Taq DNA聚合酶Mix，5×PCR Buffer和无菌双蒸水；所述5×PCR Buffer包括dNTP和MgCl2；所述dNTP的浓度为 2.5mmol/L；所述MgCl2的浓度为25mmol/L。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
优选的，所述阳性对照品包括布鲁氏菌基因组DNA、流产衣原体基因组DNA和产气荚膜梭菌基因组DNA；所述阴性对照品为无菌双蒸水。
本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌多重PCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取待测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物；
3)多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；
若扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阳性，若未扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阴性；
若扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阳性；若未扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阴性；
若扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阳性；若未扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阴性。
优选的，步骤2)中所述多重PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：
BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1和ClNo2各0.5μL，2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCR Buffer 5μL，待测样品的基因组DNA 3μL，无菌双蒸水1.5μL；
所述引物组由以下终浓度的成分组成：BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、 Cl No1和ClNo2的浓度独立为10μmol/L。
优选的，所述多重PCR扩增反应的程序为：95℃5min；95℃30S、55℃ 90S、72℃40S，35个循环；72℃10min。
本发明的有益效果：本发明提供了一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组，所述引物组包括BrNo1、BrNo2、Ch No1、Ch No2、Cl No1和ClNo2。本发明的引物组能够同时扩增出731bp，345bp和 228bp三个特异性片段。以羊组织DNA为模板，利用本发明的引物组对进行特异性验证扩增，未见有PCR扩增产物，表明本发明的引物组特异性强；本多重PCR体系中，DNA模板数量在102拷贝时，亦能扩增出可见条带，表明本发明的引物组灵敏度高；本发明的引物组中的三对引物在一个PCR 反应体系内使用而互不干扰，表明其具有高效性、***性和经济简便性等优点，适用于临床和实验室进行快速准确的病原学鉴定。
附图说明
图1为本发明的马耳他布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌单一特异性检测引物分别对羊布鲁氏菌、羊流产衣原体和产气荚膜梭菌基因组DNA 模板进行PCR扩增时的电泳结果，其中：1,2泳道分别为BrNo1和BrNo2 扩增羊布鲁氏菌基因组DNA模板和阴性对照的PCR结果电泳图；3,4泳道分别为特异性引物ChNo1和ChNo2扩增羊流产衣原体基因组DNA模板和阴性对照的PCR结果电泳图；5,6泳道分别为特异性引物Cl No1和Cl No2 扩增羊产气荚膜梭菌基因组DNA模板和阴性对照的PCR结果电泳图；M为 DNA分子量标准DL2000；
图2为本发明的马耳他布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌单一特异性检测引物分别以羊流产衣原体、羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA 模板进行PCR特异性检测扩增时的电泳结果，其中：1,2,3泳道为特异性引物Ch No1和ChNo2以产羊流产衣原体、羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA模板时的PCR扩增结果电泳图；4,5,6泳道分别为特异性引物Br No1 和BrNo2以羊布鲁氏菌、羊流产衣原体和羊产气荚膜梭菌基因组DNA为模板时的PCR扩增结果电泳图；7,8,9泳道分别为特异性引物Cl No1和Cl No2 以羊产气荚膜梭菌、羊布鲁氏菌和羊流产衣原体基因组DNA为模板时的 PCR扩增结果电泳图；M为DNA分子量标准DL2000；
图3为本发明的马耳他布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌特异性检测引物以羊布鲁氏菌、羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体质粒DNA单一模板进行多重PCR敏感性检测扩增时的结果，其中：1,2,3为特异性引物Br No1、 Br No2、Ch No1、Ch No2、Cl No1和Cl No2分别扩增羊布鲁氏菌(103拷贝)、羊流产衣原体(103拷贝)和羊产气荚膜梭菌(102拷贝)DNA质粒模板时的多重PCR结果电泳图；4泳道为特异性引物Br No1、Br No2、Ch No1、Ch No2、ClNo1和Cl No2扩增时的阴性对照；M为DNA分子量标准 DL2000；
图4为本发明的马耳他布鲁氏菌、产气荚膜梭菌和流产衣原体特异性检测引物以羊布鲁氏菌、羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体DNA复合模板进行多重PCR扩增时的结果，其中：1为Br No1、Br No2、Ch No1、Ch No2、 Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊布鲁氏菌、羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；2为BrNo1、BrNo2、 Ch No1、ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊布鲁氏菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；3为BrNo1、BrNo2、 Ch No1、ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；4为BrNo1、BrNo2、 Ch No1、ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；5为BrNo1、BrNo2、 Ch No1、Ch No2、ClNo1和Cl No2的混合引物扩增羊组织基因组DNA模板时的多重PCR扩增结果；M为DNA分子量标准DL2000；
图5为本发明的马耳他布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌特异性检测引物以临床疑似存在三种病原感染的绵羊粪全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增时的结果，其中：1,2,3,4,5,6,7和8为BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增绵羊粪全基因组DNA模板时的多重PCR扩增结果；M为DNA分子量标准DL2000。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组，所述引物组包括BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1和ClNo2；
所述Br No1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5'-CACTCGTGCTAGCAATTTTCTCGC-3'；
所述Br No2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5'-CGACATTGACCGATACGTTATAGC-3'；
所述Ch No1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：5'-GGGCTAGACACGTGAAACCTAG-3'；
所述Ch No2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：5'-CCTGGTCATAAATAGCTCAC-3'；
所述Cl No1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：5'-CAGCAGGTTGCAAAACTAATG-3'；
所述Cl No2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：5'-CGTGTAAGAATCTATAAATATATCC-3'。
本发明中，所述BrNo1和BrNo2为一对引物；所述BrNo1和BrNo2 针对布鲁氏菌bp26基因进行设计；所述布鲁氏菌bp26基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO：7所示，具体为： CACTCGTGCTAGCAATTTTCTCGCAGCCTCATTTTCCACAATCATGCTC GTCGGCGCTTTCAGCCTGCCCGCTTTCGCACAGGAGAATCAGATGACG ACGCAGCCCGCGCGCATCGCCGTCACCGGGGAAGGCATGATGACGGC CTCGCCCGATATGGCCATTCTCAATCTCTCGGTGCTACGCCAGGCAAAG ACCGCGCGCGAAGCCATGACCGCGAATAATGAAGCCATGACAAAAGT GCTCGATGCCATGAAGAAGGCCGGCATCGAAGATCGCGATCTCCAGAC AGGCGGCATCAATATCCAGCCGATTTATGTCTATCCTGACGACAAGAAC AACCTGAAAGAGCCTACCATCACCGGCTATTCTGTATCCACCAGTCTCA CGGTTCGCGTGCGCGAACTGGCCAATGTTGGAAAAATTTTGGATGAAT CCGTCACGCTCGGTGTTAATCAGGGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATG ATAATCCCTCCGCCGTGATCAACGAGGCGCGCAAGCGCGCAGTGGCCA ATGCCATTGCCAAGGCGAAGACGCTTGCCGACGCTGCAGGCGTGGGG CTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAGTGAACTGAGCCGCCCGCCCATGCCG ATGCCAATTGCGCGCGGACAGTTCAGAACCATGCTAGCAGCCGCACCG GACAATTCCGTGCCGATTGCCGCAGGCGAAAACAGCTATAACGTATCG GTCAATGTCG。
本发明中，所述ChNo1和ChNo2为一对引物；所述ChNo1和ChNo2 针对流产衣原体23S基因进行设计；所述流产衣原体23S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，具体为： GGGCTAGACACGTGAAACCTAGTCTGAATCTGGGGAGACCACTCTCCA AGTCTAAATACTAGTCAATGACCTATAGTGAACCAGTACTGTGAAGGAA AGGTGAAAAGAACCCTTGTTAAGGGAGTGAAATAGAACCTGAAACCA GTAGCTTATAAGCGGTCGAAGACCTATAACTTCTTCGGAAGTCATGGTT GACGGCGTGCCTTTTGCATGATGAGCCAGGGAGTTAAGTTAAACGGCG AGGTTAAGGGATCTACATTCCGGAGCCGAAGCGAAAGCGAGTTTTAAA AGAGCGTTTAGTCGTTTGATTTAGACACGAAACCAAGTGAGCTATTTAT GACCAGG。
本发明中，所述Cl No1和Cl No2为一对引物；所述Cl No1和Cl No2 针对产气荚膜梭菌α毒素基因进行设计；所述产气荚膜梭菌α毒素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，具体为： CAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATCTTAAAAAA CAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAA ACAGGGAAATCAATATACTATAGTCATGCTAGCATGAGTCATAGTTGGG ATGATTGGGATTATGCAGCAAAGGTAACTCTAGCTAACTCTCAAAAAG GAACAGCGGGATATATTTATAGATTCTTACACG。
本发明的具体实施过程中，所述引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明提供了一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组；所述BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、Cl No1和ClNo2的浓度独立优选为10μmol/L；所述试剂盒优选的还包括2×Taq DNA聚合酶Mix(QIAGEN,Germany)，5×PCR Buffer(QIAGEN, Germany)和无菌双蒸水；所述5×PCR Buffer优选的包括dNTP和MgCl2；所述dNTP的浓度优选为2.5mmol/L；所述MgCl2的浓度优选为25mmol/L。
本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选的包括布鲁氏菌基因组DNA、流产衣原体基因组DNA和产气荚膜梭菌基因组DNA；所述阴性对照品优选为无菌双蒸水。
本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌多重PCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取待测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物；
3)多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；
若扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阳性，若未扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阴性；
若扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阳性；若未扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阴性；
若扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阳性；若未扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阴性。
本发明首先提取待测样品的基因组DNA；所述待检样品包括动物组织、分泌物和***物；本发明对所述待测样品的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的基因组DNA提取方法即可。
本发明在提取待测样品的基因组DNA后，以提取待测样品的基因组 DNA为模板，利用上述方案所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物。
本发明中，所述多重PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、Cl No1和Cl No2各0.5μL(10μmol/L)， 2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCR Buffer 5μL，待测样品的基因组DNA 3μL，无菌双蒸水1.5μL；所述待测样品的基因组DNA的浓度优选为100ng/3 μL。
本发明中，所述多重PCR扩增反应的程序为：95℃5min；95℃30S、 55℃90S、72℃40S，35个循环；72℃10min。
本发明在获得多重PCR扩增产物后，多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；
若扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阳性，若未扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阴性；
若扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阳性；若未扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阴性；
若扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阳性；若未扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阴性。
本发明中，所述琼脂糖凝胶由琼脂糖和TAE缓冲液制备获得，所述琼脂糖与TAE缓冲液的质量体积比为1.5g:100mL。
下面结合实施例对本发明提供的技术进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、分别以无菌双蒸水、羊布鲁氏菌基因组DNA为模板，使用以下反应体系进行PCR扩增；反应体系以25μL计：BrNo1和BrNo2各0.5μL、2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCRBuffer 5μL，模板1μL，无菌双蒸水5.5μL；
分别以无菌双蒸水、羊流产衣原体基因组DNA为模板，使用以下反应体系进行PCR扩增；反应体系以25μL计：ChNo1和ChNo2各0.5μL、2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCRBuffer 5μL，模板1μL，无菌双蒸水5.5μL；
分别以无菌双蒸水、产气荚膜梭菌基因组DNA为模板，使用以下反应体系进行PCR扩增；反应体系以25μL计：ClNo1和Cl No2各0.5μL、2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCRBuffer 5μL，模板1μL，无菌双蒸水5.5μL；
反应程序：95℃5min；95℃30S、55℃90S、72℃40S，35个循环；72℃10min。
2、产物经1.5％琼脂糖凝胶(称取琼脂糖1.5g，溶于100mL TAE缓冲液中，加热溶解，制成1.5％琼脂糖凝胶)电泳检测，检测结果参见图1，其中：1,2泳道分别为BrNo1和BrNo2扩增羊布鲁氏菌基因组DNA模板和阴性对照的PCR结果电泳图；3,4泳道分别为特异性引物ChNo1和ChNo2 扩增羊流产衣原体基因组DNA模板和阴性对照的PCR结果电泳图；5,6泳道分别为特异性引物Cl No1和Cl No2扩增羊产气荚膜梭菌基因组DNA模板和阴性对照的PCR结果电泳图；M为DNA分子量标准DL2000。
结果显示：用本发明的各单一检测引物分别对羊布鲁氏菌、羊流产衣原体和羊产气荚膜梭菌基因组DNA模板进行扩增，其PCR结果电泳图中在泳道1、3和5分别出现大小为731bp、345bp和228bp的清晰目的条带，而阴性对照的扩增产物则没有，说明根据各病原基因组设计的引物可以高效的对目的基因进行PCR扩增，而没有DNA模板的空白对照则没有条带。
实施例2
1、分别以无菌双蒸水、羊布鲁氏菌基因组DNA、羊流产衣原体基因组 DNA、产气荚膜梭菌基因组DNA为模板，使用以下反应体系进行PCR扩增；反应体系以25μL计：BrNo1和BrNo2各0.5μL、2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5 μL，5×PCRBuffer 5μL，模板1μL，无菌双蒸水5.5μL；
分别以无菌双蒸水、羊布鲁氏菌基因组DNA、羊流产衣原体基因组DNA、产气荚膜梭菌基因组DNA为模板，使用以下反应体系进行PCR扩增；反应体系以25μL计：ChNo1和ChNo2各0.5μL、2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5 μL，5×PCRBuffer 5μL，模板1μL，无菌双蒸水5.5μL；
分别以无菌双蒸水、羊布鲁氏菌基因组DNA、羊流产衣原体基因组 DNA、产气荚膜梭菌基因组DNA为模板，使用以下反应体系进行PCR扩增；反应体系以25μL计：ClNo1和ClNo2各0.5μL、2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5 μL，5×PCRBuffer 5μL，模板1μL，无菌双蒸水5.5μL；
其余同实施例1；
检测结果参见图2，其中：1,2,3泳道为特异性引物Ch No1和ChNo2 以产羊流产衣原体、羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA模板时的 PCR扩增结果电泳图；4,5,6泳道分别为特异性引物BrNo1和BrNo2以羊布鲁氏菌、羊流产衣原体和羊产气荚膜梭菌基因组DNA为模板时的PCR扩增结果电泳图；7,8,9泳道分别为特异性引物ClNo1和ClNo2以羊产气荚膜梭菌、羊布鲁氏菌和羊流产衣原体基因组DNA为模板时的PCR扩增结果电泳图；M为DNA分子量标准DL2000。
结果显示：用本发明的各单一检测引物均以羊流产衣原体、羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA模板进行扩增，其PCR结果电泳图中在泳道 1、4和7分别出现大小为345bp、731bp和228bp的清晰目的条带，同一引物以其它另外两种病原的基因组为模板时未见有PCR扩增产物出现，说明三对引物的特异性高，在不会对其它另外两种病原DNA模板进行PCR扩增。
实施例3
分别以双蒸水、羊布鲁氏菌质粒DNA、羊流产衣原体质粒DNA、羊产气荚膜梭菌质粒DNA为模板进行PCR扩增；反应体系以25μL计包括：Br No1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1和ClNo2各0.5μL(10μmol/L)， 2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCRBuffer 5μL，待测样品的基因组DNA 3μL，无菌双蒸水1.5μL；
其余同实施例1；
结果参见图3，其中：1,2,3为特异性引物BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、ClNo1和ClNo2分别扩增羊布鲁氏菌(103拷贝)、羊流产衣原体 (103拷贝)和羊产气荚膜梭菌(102拷贝)质粒DNA模板时的多重PCR结果电泳图；4泳道为特异性引物BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1 和ClNo2扩增时的阴性对照；M为DNA分子量标准DL2000。
结果显示：用本发明的混合检测引物分别对羊布鲁氏菌、羊流产衣原体和羊产气荚膜梭菌质粒DNA模板进行敏感性检测扩增，其PCR结果电泳图中在泳道1、2和3分别出现大小为731bp、504bp和345bp的清晰且单一目的条带，阴性对照泳道4没有条带，说明在复合引物的多重PCR体系内三种病原的单一且低拷贝的DNA模板可以高效扩增，不会因为复合引物而出现非特异性扩增条带或不扩增，且没有模板的阴性对照没有扩增产物出现。
实施例4
利用如下反应体系，分别对(羊布鲁氏菌、羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板)、(羊布鲁氏菌和羊流产衣原体基因组DNA 混合模板)、(羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA混合模板)、(羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板)和羊组织基因组DNA 模板进行多重PCR扩增；反应体系以25μL计包括：BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、Cl No1和Cl No2各0.5μL(10μmol/L)，2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCRBuffer5μL，待测样品的基因组DNA 3μL，无菌双蒸水1.5 μL；
其余同实施例1；
结果参见图4，其中：1为BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、Cl No1 和Cl No2的混合引物扩增羊布鲁氏菌、羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；2为BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊布鲁氏菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；3为BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；4为BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊产气荚膜梭菌和羊流产衣原体基因组DNA混合模板时的多重PCR扩增结果；5为BrNo1、BrNo2、ChNo1、 ChNo2、Cl No1和Cl No2的混合引物扩增羊组织基因组DNA模板时的多重PCR扩增结果；M为DNA分子量标准DL2000。
结果显示：用本发明的混合检测引物以羊布鲁氏菌、羊流产衣原体和羊产气荚膜梭菌基因组三种或两两混合DNA模板以及羊组织DNA模板进行扩增，其PCR结果电泳图中在泳道1出现大小为731bp、345bp和228bp 的清晰目的条带，说明在多重PCR体系内，三种病原的DNA模板均得到高效扩增且没有非特异性扩增出现；在泳道2出现大小为731bp和345bp的目的条带，说明多重PCR反应体系内羊布鲁氏菌和羊流产衣原体基因均得到高效扩增；在泳道3出现大小为731bp和228bp的目的条带，说明多重 PCR体系内羊布鲁氏菌和羊产气荚膜梭菌基因均得到高效扩增；在泳道4出现大小为345bp和228bp的目的条带，说明多重PCR体系内羊流产衣原体和羊产气荚膜梭菌基因均得到高效扩增；在泳道5未出现扩增产物，说明以羊组织DNA为模板没有PCR扩增。
实施例5
1、收集疑似有布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌感染的某羊场羊群中绵羊粪便。
2、绵羊粪便全基因组DNA的提取
1)将获取的粪便的于70℃加热30min。
2)粪DNA的制备：根据粪DNA提取试剂盒(TIANamp Stool DNAKit, 离心柱型，购自于天根生化科技(北京)有限公司)说明书提取粪DNA，测定提取DNA浓度后备用。
3、PCR扩增体系的建立
在PCR反应管内配制多重PCR反应液，采用25μL反应体系，加入 5×PCRBuffer 5μL，2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，引物BrNo1、BrNo2、 ChNo1、ChNo2、Cl No1、ClNo2各0.5μL(10μmol/L)，绵羊粪便全基因组DNA模板量为100ng，用水补足25μL。
4、PCR扩增条件
PCR反应程序为：95℃预变性5min，[95℃变性30S、55℃退火90S、 72℃延伸40S，35个循环]，72℃加长延伸10min，反应完成后4℃保存。
5、PCR扩增结果观察及判定
PCR反应产物在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外凝胶成像***观察扩增结果，根据目的条带的大小，判定感染的病原种类。
检测结果参见图5，其中：1,2,3,4,5,6,7和8为BrNo1、BrNo2、Ch No1、ChNo2、ClNo1和ClNo2的混合引物扩增绵羊粪全基因组DNA模板时的多重PCR扩增结果；M为DNA分子量标准DL2000。
结果显示：用本发明的混合检测引物以含有布鲁氏菌、流产衣原体或产气荚膜梭菌的羊粪全基因组DNA为模板进行扩增，其PCR结果电泳图中在泳道1,4出现大小为345bp和228bp的清晰目的条带，说明羊粪中存在流产衣原体和产气荚膜梭菌；泳道2,5出现大小为731bp和345bp的扩增条带，说明羊粪中存在布鲁氏菌和流产衣原体；泳道3,7出现大小为228bp 的扩增条带，说明羊粪中存在产气荚膜梭菌；泳道6,8出现大小为345bp 的扩增条带，说明羊粪中存在流产衣原体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组、试剂盒及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
cactcgtgct agcaattttc tcgc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
cgacattgac cgatacgtta tagc 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
gggctagaca cgtgaaacct ag 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
cctggtcata aatagctcac 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
cagcaggttg caaaactaat g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 6
cgtgtaagaa tctataaata tatcc 25
<210> 7
<211> 731
<212> DNA
<213> 布鲁氏菌(Brucella melitensis)
<400> 7
cactcgtgct agcaattttc tcgcagcctc attttccaca atcatgctcg tcggcgcttt 60
cagcctgccc gctttcgcac aggagaatca gatgacgacg cagcccgcgc gcatcgccgt 120
caccggggaa ggcatgatga cggcctcgcc cgatatggcc attctcaatc tctcggtgct 180
acgccaggca aagaccgcgc gcgaagccat gaccgcgaat aatgaagcca tgacaaaagt 240
gctcgatgcc atgaagaagg ccggcatcga agatcgcgat ctccagacag gcggcatcaa 300
tatccagccg atttatgtct atcctgacga caagaacaac ctgaaagagc ctaccatcac 360
cggctattct gtatccacca gtctcacggt tcgcgtgcgc gaactggcca atgttggaaa 420
aattttggat gaatccgtca cgctcggtgt taatcagggc ggtgatttga acctggtcaa 480
tgataatccc tccgccgtga tcaacgaggc gcgcaagcgc gcagtggcca atgccattgc 540
caaggcgaag acgcttgccg acgctgcagg cgtggggctt ggccgtgtgg tggaaatcag 600
tgaactgagc cgcccgccca tgccgatgcc aattgcgcgc ggacagttca gaaccatgct 660
agcagccgca ccggacaatt ccgtgccgat tgccgcaggc gaaaacagct ataacgtatc 720
ggtcaatgtc g 731
<210> 8
<211> 345
<212> DNA
<213> 流产衣原体(Chlamydia abortus)
<400> 8
gggctagaca cgtgaaacct agtctgaatc tggggagacc actctccaag tctaaatact 60
agtcaatgac ctatagtgaa ccagtactgt gaaggaaagg tgaaaagaac ccttgttaag 120
ggagtgaaat agaacctgaa accagtagct tataagcggt cgaagaccta taacttcttc 180
ggaagtcatg gttgacggcg tgccttttgc atgatgagcc agggagttaa gttaaacggc 240
gaggttaagg gatctacatt ccggagccga agcgaaagcg agttttaaaa gagcgtttag 300
tcgtttgatt tagacacgaa accaagtgag ctatttatga ccagg 345
<210> 9
<211> 228
<212> DNA
<213> 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
<400> 9
cagcaggttg caaaactaat gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaagatttta 60
atgcatggtc aaaagaatat gcaagaggtt ttgctaaaac agggaaatca atatactata 120
gtcatgctag catgagtcat agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactctag 180
ctaactctca aaaaggaaca gcgggatata tttatagatt cttacacg 228

Claims (8)

1.一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的引物组，所述引物组包括BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1和ClNo2；
所述BrNo1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述BrNo2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述ChNo1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述ChNo2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述ClNo1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述ClNo2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.一种同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×Taq DNA聚合酶Mix，5×PCR Buffer和无菌双蒸水；所述5×PCR Buffer包括dNTP和MgCl2；所述dNTP的浓度为2.5mmol/L；所述MgCl2的浓度为25mmol/L。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括布鲁氏菌基因组DNA、流产衣原体基因组DNA和产气荚膜梭菌基因组DNA；所述阴性对照品为无菌双蒸水。
6.权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌、流产衣原体和产气荚膜梭菌多重PCR检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物；
3)多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；
若扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阳性，若未扩增出长度为731bp的特异性片段，检测结果为布鲁氏菌阴性；
若扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阳性；若未扩增出长度为345bp的特异性片段，检测结果为流产衣原体阴性；
若扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阳性；若未扩增出长度为228bp的特异性片段，检测结果为产气荚膜梭菌阴性。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述多重PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：
BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1和ClNo2各0.5μL，2×Taq DNA聚合酶Mix 12.5μL，5×PCR Buffer 5μL，待测样品的基因组DNA 3μL，无菌双蒸水1.5μL；
所述引物组由以下终浓度的成分组成：BrNo1、BrNo2、ChNo1、ChNo2、ClNo1和ClNo2的浓度独立为10μmol/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的程序为：95℃5min；95℃30S、55℃90S、72℃40S，35个循环；72℃10min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549153A (zh) * 2020-05-12 2020-08-18 青海省畜牧兽医科学院 一种双重实时荧光定量pcr引物和探针以及检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242221A (zh) * 2011-07-20 2011-11-16 贵州省畜牧兽医研究所 羊魏氏梭菌pcr检测试剂盒
CN106148548A (zh) * 2016-08-31 2016-11-23 青海省畜牧兽医科学院 一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和b型诺维氏梭菌的多重pcr检测试剂盒及其应用
CN108220461A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒
CN109136396A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 华南农业大学 一种魏氏梭菌病的特异性检测引物和检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242221A (zh) * 2011-07-20 2011-11-16 贵州省畜牧兽医研究所 羊魏氏梭菌pcr检测试剂盒
CN106148548A (zh) * 2016-08-31 2016-11-23 青海省畜牧兽医科学院 一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和b型诺维氏梭菌的多重pcr检测试剂盒及其应用
CN108220461A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒
CN109136396A (zh) * 2018-09-19 2019-01-04 华南农业大学 一种魏氏梭菌病的特异性检测引物和检测试剂盒

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A novel real-time PCR assay for specific detection of Brucella melitensis;Rene Kaden 等;《BMC Infectious Diseases》;20170324;第17卷(第230期);第1-6页 *
Improving the molecular diagnosis of Chlamydia psittaci and Chlamydia abortus infection with a species-specific duplex real-time PCR;Opota, Onya 等;《Journal of Medical Microbiology》;20151231;第64卷(第10期);第1174-1185页 *
Molecular typing of Clostridium perfringens isolated from turkey meat by multiplex PCR;I Erol 等;《Letters in Applied Microbiology》;20081231;第47卷;第31-34页 *
多重PCR方法快速检测粪样中产气荚膜梭菌;文其乙 等;《中国预防兽医学报》;20020131;第24卷(第1期);第48-51页 *
流产衣原体荧光定量PCR方法的建立及小鼠感染菌体载量测定;张志君 等;《中国***共患病学报》;20181231;第34卷(第3期);第224-229页 *
都兰县骆驼布鲁氏菌病、衣原体病检测;祁世荣 等;《湖北农业科学》;20181231;第57卷(第S2期);第158-160页 *

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