CN112063615A - 一种基因组dna提取液、基因组dna提取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因组DNA提取液、基因组DNA提取方法及其应用。其中，基因组DNA提取液，包括5~10 mM Tris、1~5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、1~2.5mM的硫酸镁和无菌水，Tris的pH值为8.0~9.0。本发明提供的基因组DNA提取液配制简单，操作中不涉及换管移液、无需纯化、可有效避免基因组丢失、操作快捷而且原料便宜，与样本孵育后，可直接用于后续普通PCR或者荧光PCR，以及基因检测、分子克隆、序列分析、分子杂交等下游实验。

Description

一种基因组DNA提取液、基因组DNA提取方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种基因组DNA提取液、基因组DNA提取方法及其应用。
背景技术
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是人类牙周炎重要的致病菌，已有研究表明其在口腔内的水平可预测疾病进展或活动性。我们课题组前期研究表明，P.gingivalis可能是食管癌的高危因素。河南是中国食管癌高发省，为了摸清食管鳞癌高危人群、癌前病变及食管癌患者中P.gingivalis感染的流行病学特点，大样本量的流行病学调查活动势在必行。因此，一种能够简便而又准确地检测口腔P.gingivalis感染状态的方法显得十分必要。
检测P.gingivalis感染的方法主要有培养法及基因检测法等。培养法结果具有高度特异性，然而，该法缺乏敏感性，培养成功率低，且需要5～7天时间。因此不适于大规模分子流行病学筛查。PCR为代表的基因检测方法目前已发展成熟，实时荧光定量PCR法更是广泛用于定量检测唾液、牙菌斑、舌背等新鲜来源样本中的P.gingivalis DNA检测。
而荧光定量PCR法以及其他不同类型基因检测一般均涉及基因组的提取和纯化过程，而抽提后的核酸质量及完整性直接决定后续的实验结果。由于从样本中提取和纯化基因组耗时长且繁琐，因此，基因组的提取和纯化步骤一直以来是整个基因检测速度及应用范围的限制因素。
样本中基因组的提取主要包括两个步骤：裂解细胞和提取核酸。裂解细胞使核酸释放出来，常用方法包括：物理法(煮沸、冻融、微波、超声、研磨等)、化学方法(高盐、表面活性剂、苯酚、强碱等)和酶消化法(溶菌酶、蛋白酶K等)。现有的提取方法均存在各种缺陷：
1)酚-氯仿抽提法、异丙醇沉淀法及甲酰胺裂解法是提取DNA最经典的方法，均利用蛋白酶K和十二烷基磺酸钠(SDS)消化裂解细胞。在前两种方法中，裂解液中包含的苯酚-氯仿等用于去除蛋白质，乙醇或异丙醇用于沉淀基因组DNA。甲酰胺裂解法是利用高浓度甲酰胺破坏聚蛋白质与染色体DNA的结合，透析后获得DNA样本。这些经典方法在不考虑样本量情况下，能得到较高纯度的DNA，可满足各种实验要求，但操作繁琐，用时较长，且所用试剂具有一定的毒性。
2)碱裂解法是在NaOH提供的碱性条件下(pH 12.0左右)，用强阳离子去垢剂SDS对细胞壁的破坏作用，裂解细胞，使细胞内蛋白质变性，释放出基因组DNA。由此产生的细胞壁碎片、变性蛋白质等形成复合物，在裂解液高钾盐条件下，有效沉淀析出，从而将基因组保留在上清中，再结合无水乙醇或乙醇沉淀、洗涤步骤，去除蛋白质复合物，纯化基因组。但是，采用该方法所用到的去垢剂、高盐溶液等成分，容易残留在基因组中并影响后续PCR结果。
3)煮沸裂解法，是在含有蛋白酶K等的裂解缓冲液作用下，通过煮沸裂解细胞，破坏蛋白质与染色体的结合，将DNA释放出来，再经离心沉淀，得到纯化的基因组DNA，用于PCR扩增。该方法的加热、离心等步骤需要特定设备，且高温煮沸引起蛋白质凝固，易导致部分核酸被变性的蛋白质包裹而随离心沉淀丢失，直接导致上清中初始模板基因组量减少；另外，虽经煮沸并高速离心，上清液中仍可能含有少量扩增抑制剂如蛋白质、肝素及微量血红蛋白等，影响PCR反应。
4)磁珠法提取核酸，是在细胞裂解液的作用下，裂解细胞后游离的核酸分子被特异的磁性颗粒吸附，而蛋白质等杂质不被吸附仍留在溶液中。在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收磁颗粒并洗脱，得到纯化的DNA。由于系列试剂中不含氯仿、苯酚等毒性有机溶剂，提取步骤较简单，对核酸样本的回收率高，得到核酸纯度好而得到广泛应用。但是，特异的磁珠及配套的磁珠缓冲液多数为国外垄断，价格昂贵，从而限制了其在我国自动化及高通量检测使用的可能。
5)临床样本来源珍贵，且样本量一般都较少，例如拭子、穿刺洗液等，通过上述核酸抽提及纯化方法，多步骤操作容易造成样本基因组丢失，影响结果准确性，这限制了高通量样本的检测与研究。
因此，迫切需要开发一种能快速释放基因组的试剂，一方面能够尽可能多的保留初始基因组量，减少扩增前造成的基因组丢失或污染，另一方面组成成分简单，不影响后续反应，适合大规模样本的基因检测需求。
发明内容
为了解决现有技术中基因组DNA提取纯化耗时长、费力，试剂和时间成本高、提取所用耗材和试剂昂贵，且实验过程中容易造成核酸丢失等问题。
本发明的目的之一在于提供一种基因组DNA提取液，包括5～10mM Tris、1～5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1～2.5mM的硫酸镁和无菌水，Tris的pH值为8.0～9.0。
进一步地，所述EDTA的浓度为1mM。
本发明的目的之二在于提供一种基因组DNA提取方法，包括如下步骤：
收集样本；
以任意体积比混合如权利要求1至3任一项所述的基因组DNA提取液和样本，得到混合液；
混匀所述混合液，静置，获得样本处理液；
对所述样本处理液90～100℃变性处理，获得基因组DNA。
进一步地，所述基因组DNA提取液和所述样本的体积比为5:1～1:1。
进一步地，采用漩涡震荡或者移液枪头吹打中的任意一种方式混匀所述混合液。
进一步地，收集到所述样本后，对所述样本进行离心处理，获得所述样本的沉淀物。
进一步地，所述样本来自人类或者细菌中的一种或者两者的混合。
进一步地，所述样本来自人类，包括漱口水、龈沟液、口腔或鼻咽拭子以及组织穿刺洗脱液中的任意一种或者任意两种及以上的混合物。
进一步地，所述样本来自细菌，包括细菌培养物。
本发明的目的之二在于提供一种牙龈卟啉单胞菌的检测方法，采用上述的基因组DNA提取方法提取牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA。。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：(1)本发明提供的基因组DNA提取液配制简单，操作中不涉及换管移液、无需纯化、操作快捷而且原料便宜，与样本孵育后，可直接用于后续普通PCR或者荧光PCR，以及基因检测、分子克隆、序列分析、分子杂交等下游实验。(2)基于本发明提供的基因组DNA提取液提取DNA的方法在进行基因检测时，可缩短检测时间、降低试剂成本，适用于大规模高通量样本。(3)本发明提供的基因组DNA提取液及其应用，解决了现有基因组抽提纯化技术耗时、费力、试剂成本较高、易造成基因组丢失或污染，影响基因检测速度和效率等问题。
附图说明
图1是本发明提供的基因组DNA提取液用于人类漱口水、口腔拭子样本中牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测结果图；
图2a是本发明提供的基因组DNA提取液用于细菌培养物样本中牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测扩增曲线图；
图2b是本发明提供的基因组DNA提取液用于细菌培养物样本中牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测标准曲线图；
图3是本发明提供的基因组DNA提取液用于龈沟液、鼻咽拭子及组织穿刺洗脱液样本中牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测结果图；
图4是本发明提供的基因组DNA提取液用于漱口水、口腔拭子样本中人类PGT基因的荧光PCR检测结果图；
图5是采用本发明提供的基因组DNA提取液提取DNA的方法与裂解煮沸法、试剂盒抽提法三种方法处理口腔拭子样本，进行牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测结果图；
图6是采用本发明提供的基因组DNA提取液提取DNA的方法对比裂解煮沸法，用于人类口腔拭子样本中牙龈卟啉单胞菌的普通PCR检测；其中，N表示阴性对照，P表示阳性对照。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例一：
本发明实施例提供一种基因组DNA提取液，包括5～10mM Tris、1～5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、浓度为1～2.5mM的硫酸镁和无菌水，其中Tris的pH值为8.0～9.0。
本发明实施例提供的基因组DNA提取液中Tris和EDTA具有保护基因组的作用，并且对后续扩增实验无影响，硫酸镁起到促进后续扩增反应中DNA聚合酶活性的作用。而且，Tris的pH值为8.0～9.0，提供了一个偏碱性的环境，通过高温变性处理，可快速裂解细胞、病毒、细菌等蛋白结构，释放出基因组DNA。这里的高温变性处理通常为PCR反应中第一步的预变性处理。另外，本发明实施例提供的基因组DNA提取液配制简单，操作中不涉及换管移液、无需纯化，与样本孵育后，可直接用于后续普通PCR或者荧光PCR，以及基因检测、分子克隆、序列分析、分子杂交等下游实验。
实施例二：
制备细菌培养物、人类漱口水、人类龈沟液、人类口腔/鼻咽拭子以及人类组织穿刺洗脱液的样本处理液。
1、制备漱口水的样本处理液：漱口水样本(大约20mL)直接于4000rpm离心20min，收集沉淀物；加入2倍于沉淀物体积的DNA提取液，漩涡震荡充分混匀(也可用移液枪头吹打辅助混匀)，以重悬沉淀，室温静置，获得样本处理液。其中，DNA提取液由7mM Tris、1mM乙二胺四乙酸、浓度为2mM的硫酸镁以及无菌水组成，Tris的pH值为8。
2、制备口腔/鼻咽拭子的样本处理液：对口腔/鼻咽拭子样本(取样后，拭子放置于保存液中)，漩涡震荡混匀，使保存液(iCleanhcy，深圳华晨阳科技有限公司)充分溶解并洗脱拭子中的细胞成分；转移全部保存液至新的1.5mL无菌离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液，瞬时离心，用枪头吸弃残余上清，并尽量避免吸走沉淀物；加入2倍于沉淀物体积的DNA提取液，漩涡震荡充分混匀(也可用移液枪头吹打辅助混匀)，以重悬沉淀，室温静置，获得样本处理液。其中，DNA提取液由10mM Tris、1mM乙二胺四乙酸、浓度为1mM的硫酸镁以及无菌水组成，Tris的pH值为9。
3、制备牙龈卟啉单胞菌菌液的样本处理液：取复苏后传代培养过夜的牙龈卟啉单胞菌菌液适量，测定OD600，取相当于109拷贝/mL的菌液(按OD值＝1.0相当于109拷贝/mL计算)至1.5mL无菌离心管中，12000rpm离心10min，弃上清；加入5倍于菌体体积的DNA提取液，漩涡震荡充分混匀，以重悬细菌沉淀物；对所得样本处理液按10倍比加入生理盐水，进行梯度稀释，一直稀释至102拷贝/mL的浓度；室温静置，获得细菌培养物的浓度梯度的样本处理液。其中，DNA提取液由10mM Tris、2mM乙二胺四乙酸、浓度为1mM的硫酸镁以及无菌水组成，Tris的pH值为9。
4、制备龈沟液的样本处理液：对牙周炎个体，按常规方法抽取龈沟液，等比例加入DNA提取液，漩涡震荡充分混匀，室温静置，获得样本处理液。其中，DNA提取液由8mM Tris、1mM乙二胺四乙酸、浓度为1mM的硫酸镁以及无菌水组成，Tris的pH值为8。
5、制备组织穿刺洗脱液的样本处理液：将组织穿刺洗脱液注入1.5mL无菌离心管中，12000rpm离心10min，弃上清；加入等体积的DNA提取液，漩涡震荡充分混匀，室温静置，获得样本处理液。其中，DNA提取液由8mM Tris、1mM乙二胺四乙酸、浓度为1.5mM的硫酸镁以及无菌水组成，Tris的pH值为9。
实施例三：
牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测：
分别取2μL实施例二中步骤1至5获得的样本处理液进行荧光PCR反应体系的配制，瞬时离心后，于BioRad CFX96TM实时PCR***上进行实时荧光定量PCR扩增分析。AceQ PCRProbe Master Mix(Vazyme,Q112-03)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；所有引物探针序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
PCR反应体系(总20μL)如下：
成分 体积(μL)
上游引物 0.5
下游引物 0.5
TaqMan荧光探针(10μM) 0.2
AceQ PCR Probe Master Mix(2×) 10
DEPC水 6.8
其中：
上游引物：5’-ACCTTACCCGGGATTGAAATG-3’
下游引物：5’-CAACCATGCAGCACCTACATAGAA-3’
探针：5’-FAM-ATGACTGATGGTGAAAACCGTCTTCCCTTC-TARMA-3’
PCR反应条件为：
95℃，10min；
95℃，10s，60℃，60s(采集信号)；40个循环。
实验结果分析：PCR扩增完成后，利用CFX MaestroTM software软件分析扩增结果，如图1～3。从图1～3扩增曲线上看，基线平稳，指数区明显，扩增曲线呈典型的S型，阴性阳性区分明确。其中，图2b示出牙龈卟啉单胞菌菌液梯度稀释后，不同浓度样本间线性关系良好，R2＝99.9％，扩增效率86.8％。因此，本发明实施例提供的基因组DNA提取液可用于提取细菌的基因组。
实施例四：
漱口水、口腔拭子样本中人类PGT基因的荧光PCR检测：
分别取2μL实施例二中步骤1和2获得的样本处理液进行荧光PCR反应体系的配制，瞬时离心后，于BioRad CFX96TM实时PCR***上进行实时荧光定量PCR扩增分析。引物探针序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
PCR反应体系与实施例三中的PCR反应体系相同。
其中：
上游引物：5’-ATCCCCAAAGCACCTGGTTT-3’
下游引物：5’-AGAGGCCAAGATAGTCCTGGTAA-3’
探针：5’-FAM-CCATCCATGTCCTCATCTC-TARMA-3’
PCR反应条件为：
95℃，10min；
95℃，10s，60℃，60s(采集信号)；40个循环。
实验结果分析：PCR扩增完成后，利用CFX MaestroTM software软件分析扩增结果，请参阅图4，人类PGT基因扩增基线平稳，指数区域明显，扩增曲线呈典型S型。因此，本发明实施例提供的基因组DNA提取液可用于提取人类的基因组。
本发明提供的基因组DNA提取液配制简单、原料便宜、操作快捷，可用于快速释放细菌培养物、龈沟液、漱口水、口腔拭子、鼻咽拭子及组织穿刺洗脱液等样本的基因组DNA，无需纯化，提高检测效率。基于本发明提供的基因组DNA提取液提取DNA的方法在进行基因检测时，可缩短检测时间、降低试剂成本，适用于大规模高通量样本。
实施例五：
采用三种方法提取口腔拭子样本基因组DNA的对比试验(对牙龈卟啉单胞菌进行荧光PCR检测)：
本实施例对采用本发明实施例提供的基因组DNA提取液提取DNA的方法与裂解煮沸法、试剂盒抽提法进行对比。具体步骤如下：
1、样本分装：分别取口腔拭子样本3例，每例口腔拭子样本与1份细胞保存液(iCleanhcy，深圳华晨阳科技有限公司)混匀，并将每份混合液分装于3个离心管中。每例口腔拭子样本的分装步骤具体为：准备3个1.5mL离心管，1mL含有口腔脱落细胞的保存液充分混匀后，分别取300μL至每个1.5mL离心管中，并进行分别命名。其中，第一例样本分装于3个离心管中，分别标记为Q-01、L-01、K-01；第二例样本分装于3个离心管中，分别标记为Q-02、L-02、K-02；第三例样本分装于3个离心管中，分别标记为Q-03、L-03、K-03。
2、样本离心处理：对分装后的9个样本进行13000rpm离心10min，弃上清(尽量将上清去除干净)。
3、不同方法进行DNA提取：
3.1、采用本发明提供的基因组DNA提取液制备样本处理液
取编号Q-01、Q-02、Q-03样本，向离心管中各加入等体积本发明提供的基因组DNA提取液，旋涡震荡混匀，以重悬沉淀物，瞬时离心后，室温静置，即获得第一组样本处理液。其中，DNA提取液由10mM Tris、1mM乙二胺四乙酸、浓度为1mM的硫酸镁以及无菌水组成，Tris的pH值为9。
3.2、裂解煮沸法提取DNA
取编号L-01、L-02、L-03样本，向离心管中各加入30μL细胞裂解液(#18LS11001，深圳亚能生物)，轻弹或旋涡震荡，以重悬沉淀物；放于金属恒温器，100℃加热10min；常温下12 000r/min离心10min，取出静置，上清用于后续PCR。
3.3、试剂盒抽提法提取DNA
取编号K-01、K-02、K-03样本，按照MicroElute Genomic DNA Kit(#D3096-02,OMEGA)说明书进行离心柱法核酸抽提纯化。包括以下步骤：
A.溶解；
B.核酸释放；
C.离心柱吸附；
D.洗涤纯化；
E.洗脱；用30μL经70℃预热的Elution Buffer洗脱DNA；
F.保存；直接进行后续PCR扩增。
4、对不同方法获得的基因组DNA进行牙龈卟啉单胞菌的荧光PCR检测：
分别取2μL经本实施例试验步骤3.1-3.3获得的样本基因组DNA进行荧光PCR反应体系的配制，漩涡震荡混匀，于BioRad CFX96TM实时PCR***上进行实时荧光定量PCR扩增分析。
PCR反应体系与实施例三的PCR反应体系相同。
其中：
引物探针与实施例三的引物探针相同；
PCR反应条件为：
95℃，10min；
95℃，10s，60℃，60s(采集信号)；40个循环。
实验结果分析：PCR扩增完成后，利用CFX MaestroTM software软件分析扩增结果，请参阅图5，通过对三种方法提取的DNA的荧光PCR检测结果分析可发现，第一例样本Q-01、Q-02、Q-03的Ct值分别比第二例样本L-01、L-02、L-03的Ct值小，也比第三例样本K-01、K-02、K-03的Ct值小。其中，表1示出了对三种提取方法获得的DNA产物进行荧光PCR检测的Ct值，每个样本的Ct值大小请参阅表1。Ct值是荧光定量PCR反应中用于衡量初始模板DNA量的参数，在同等扩增条件下，样本Ct值越小，说明扩增反应中该样本含有的初始模板DNA量越多。采用本发明提供的DNA提取液提取DNA的方法未经任何管间转移步骤，无纯化过程，是在样本中加入DNA提取液后，直接进行后续PCR扩增反应，通过对比Ct值，可说明，与裂解煮沸法与试剂盒提取法相比，本发明提供的DNA提取液在提取过程更多地保持了样本基因组DNA的量。由此可得，本发明提供的DNA提取液能有效地释放样本中的核酸，降低核酸DNA丢失。
表1
Figure BDA0002666780350000121
实施例六：
采用两种方法提取口腔拭子样本基因组DNA的对比验证(对牙龈卟啉单胞菌进行普通PCR检测)：
本实施例对采用本发明提供的基因组DNA提取液提取DNA的方法与裂解煮沸法进行对比。具体步骤如下：
1、样本分装：分别取口腔拭子样本6例，每例口腔拭子样本与1份细胞保存液(iCleanhcy，深圳华晨阳科技有限公司)混匀，并将每份混合液分装于2个离心管中。每例口腔拭子样本的分装步骤具体为：准备2个1.5mL离心管，1mL含有口腔脱落细胞的保存液(iCleanhcy，深圳华晨阳科技有限公司)充分混匀后，平均分装至每个1.5mL离心管中，并进行分别命名。其中，第一例样本分装于2个离心管中，分别标记为Q-01和L-01；第二例样本分装于2个离心管中，分别标记为Q-02和L-02；第三例样本分装于2个离心管中，分别标记为Q-03和L-03；第四例样本分装于2个离心管中，分别标记为Q-04和L-04；第五例样本分装于2个离心管中，分别标记为Q-05和L-05；第六例样本分装于2个离心管中，分别标记为Q-06和L-06。
2、样本离心处理：对分装后的12个样本进行13000rpm离心10min，弃上清(尽量将上清去除干净)。
3、不同方法进行DNA提取：
3.1、采用本发明提供的基因组DNA提取液提取DNA
取编号Q-01、Q-02、Q-03、Q-04、Q-05、Q-06样本，进行DNA的提取，提取方法与实施例五3.1的方法相同。
3.2、裂解煮沸法提取DNA
取编号L-01、L-02、L-03、L-04、L-05、L-06样本，进行DNA的提取，提取方法与实施例五3.2的方法相同。
4、对不同方法获得的基因组DNA进行牙龈卟啉单胞菌的普通PCR检测：
分别取1μL经本实施例实验步骤3.1和3.2获得的样本基因组DNA进行普通PCR反应体系的配制，漩涡震荡混匀，于BioRad CFX96TM实时PCR***上进行实时荧光定量PCR扩增分析。2×Taq Plus Master Mix(Vazyme，P-212-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；普通PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
普通PCR反应体系(总25μL)如下：
成分 体积(μL)
上游引物(10μM) 0.5
下游引物(10μM) 0.5
Taq Plus Master Mix(2×) 12.5
DEPC水 10.5
其中：
上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’；
下游引物：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。
PCR反应条件为：
95℃，10min；95℃，20s，60℃，20s，72℃，20s，36个循环；72℃，10min。
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，90V，30分钟。在凝胶成像***中，拍摄电泳图，结果如图6所示。
结果分析：通过对两种方法提取样本基因组进行普通PCR检测发现，图6中阳性样本的Q-03、Q-04条带亮度与L-03、L-04基本相当，Q-05、Q-06条带亮度略强于L-05、L-06。由此可得，本发明提供的DNA提取液能有效地释放样本中的核酸，降低核酸DNA丢失。
本发明提供的基因组DNA提取液及其应用，解决了现有基因组抽提纯化技术耗时、费力、试剂成本较高、易造成基因组丢失或污染，影响基因检测速度和效率等问题，采用本发明提供的基因组DNA提取液和提取DNA的方法，无需单独提取、纯化基因组，只需将待测样本与所述核酸释放剂按比例形成混合液，即可达到释放基因组的目的。本发明在很大程度上减少了操作步骤，基本保留了样本中的初始基因组量，增加了检测灵敏度，降低了时间和试剂成本；按此方法处理可直接进行后续基因检测，不会影响检测结果的稳定性和灵敏度，因此更利于微量样本及大规模样本量基因组的检测分析。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基因组DNA提取液，其特征在于，包括5~10 mM Tris、1~5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、1~2.5mM的硫酸镁和无菌水，Tris的pH值为8.0~9.0。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取液，其特征在于，所述EDTA的浓度为1 mM。
3.一种基因组DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
收集样本；
以任意体积比混合如权利要求1至3任一项所述的基因组DNA提取液和样本，得到混合液；
混匀所述混合液，静置，获得样本处理液；
对所述样本处理液90~100℃变性处理，获得基因组DNA。
4.根据权利要求3所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，其中，所述基因组DNA提取液和所述样本的体积比为5:1~1:1。
5.根据权利要求3所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，采用漩涡震荡或者移液枪头吹打中的任意一种方式混匀所述混合液。
6.根据权利要求3至5任一项所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，收集到所述样本后，对所述样本进行离心处理，获得所述样本的沉淀物。
7.根据权利要求3至5任一项所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，所述样本来自人类或者细菌中的一种或者两者的混合。
8.根据权利要求7所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，所述样本来自人类，包括漱口水、龈沟液、口腔或鼻咽拭子以及组织穿刺洗脱液中的任意一种或者任意两种及以上的混合物。
9.根据权利要求7所述的基因组DNA提取方法，其特征在于，所述样本来自细菌，包括细菌培养物。
10.一种牙龈卟啉单胞菌的检测方法，其特征在于，采用如权利要求3至9任一项所述的基因组DNA提取方法提取牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111621497A (zh) * 2020-05-29 2020-09-04 广西大学 一种鸡血液dna快速提取方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597647A (zh) * 2009-07-09 2009-12-09 广州金域医学检验中心有限公司 军团菌种快速检测试剂盒及其检测方法
CN105567678A (zh) * 2016-03-18 2016-05-11 中国科学院南海海洋研究所 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101597647A (zh) * 2009-07-09 2009-12-09 广州金域医学检验中心有限公司 军团菌种快速检测试剂盒及其检测方法
CN105567678A (zh) * 2016-03-18 2016-05-11 中国科学院南海海洋研究所 细菌噬菌体基因组dna提取试剂盒及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KHOSRAVINIA, H等: "Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction", 《AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
刘其伟等: "慢性牙周炎口腔变黑普雷沃氏菌分离鉴定及促进食管鳞癌演进", 《中华微生物学和免疫学杂志》 *
谷变利等: "直接PCR法在口腔牙龈卟啉单胞菌检测中的应用", 《食管疾病》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111621497A (zh) * 2020-05-29 2020-09-04 广西大学 一种鸡血液dna快速提取方法及其应用

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