CN113092790B - 一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗诊断技术领域,公开了一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法。本发明使用两种粒径不同微球以及两株PCT单抗和一株PCT多抗,大粒径微球用链酶亲核素修饰,小粒径微球不做处理。采用链霉亲和素与生物素放大***,将大粒径微球与链酶亲核素连接,多抗用生物素进行标记,形成大胶乳微球‑链霉亲和素‑生物素‑多抗放大***,从而提高其低值端的灵敏度,同时用小粒径微球标记两株单抗提高其线性,从而获得一个高灵敏度与宽线性的PCT试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医疗诊断技术领域,具体的说是涉及一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
降钙素原(PCT)是一种与炎症感染相关的蛋白,当细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症等多脏功能衰竭时降钙素原在体内中的水平会升高,自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。在临床上PCT是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标,而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器官衰竭的可靠指标,同时也可用于指导抗生素的使用。
目前检测PCT的方法有化学发光法、免疫层析法、免疫比浊法等。化学发光与免疫荧光法其检测灵敏度高,但试剂成本较高。而免疫比浊法试剂相对于化学发光与免疫层析其灵敏度较低,但试剂成本较低。目前市面上免疫比浊法降钙素原试剂普遍存在低值端的灵敏度较低与线性范围较窄的问题,因此这一问题急需被解决。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种降钙素原检测试剂盒及其制备方法,使得所述试剂盒能够提高低值端的灵敏度,并同时保证线性范围维持在较宽的范围。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种降钙素原的检测试剂盒,包括R1试剂与R2试剂;R1试剂包括缓冲液、无机盐、防腐剂、表面活性剂和糖类;R2试剂包括标记PCT多抗的大粒径微球、标记PCT单抗1的小粒径微球、标记PCT单抗2的小粒径微球、缓冲液、无机盐、防腐剂、表面活性剂和糖类;其中,所述PCT多抗通过链酶亲和素与生物素***标记大粒径微球。
本发明一方面通过利用大粒径微球、链酶亲核素生物素***,利用这种放大***提高了PCT项目低值端的灵敏度,但是随着低值端灵敏度的提高,PCT的线性会下降,因此本发明同时采用两株不同的PCT单抗标记小粒径微球,提高其线性宽度,从而获得一个高灵敏度与宽线性的试剂盒。
作为优选,所述大粒径微球粒径在350~450nm,更优选地在400nm±20nm;小粒径微球粒径在100~200nm之间,更优选地在150nm±20nm。
作为优选,所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液、硼酸缓冲液和Tris-HC1缓冲液,缓冲液浓度为50-300mmol/L,pH值5-8。在本发明具体实施方式中,所述R1中的缓冲液为甘氨酸缓冲液,所述R2中的缓冲液为硼酸缓冲液。
作为优选,所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钙、硝酸镁中的一种或两种以上,无机盐浓度为20-500mmol/L。在本发明具体实施方式中,所述R1中无机盐为氯化钙,所述R2中的无机盐为氯化钠。
作为优选,所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300、硫化汞、山梨酸钾中的一种或两种以上,防腐剂的浓度为0.1-0.5%。在本发明具体实施方式中,所述R1和R2中防腐剂均为ProClin300。
作为优选,所述表面活性剂为吐温20、吐温80、SDS中的一种或者两种以上,表面活性剂的浓度为0.1-0.5%。在本发明具体实施方式中,所述R1和R2中表面活性剂均为SDS。
作为优选,所述糖类为蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的一种或者两种以上,糖类的浓度为5-20%。在本发明具体实施方式中,所述R1和R2中糖类均为蔗糖。
作为优选,所述R2中还可以加入脱脂奶粉、酪蛋白或BSA作为保护剂,浓度为0.1%;
作为优选,所述R2中的标记PCT多抗的大粒径微球浓度为0.1%~0.4%,进一步优选为0.3%-0.4%。所述R2中的标记两株PCT单抗的小粒径微球浓度为0.1%~0.3%,进一步优选为0.15%~0.25%;所述标记PCT单抗1的小粒径微球与标记PCT单抗2的小粒径微球的体积比优选为1:1。
同时,本发明还提供了所述检测试剂盒的制备方法,用生物素标记PCT多抗,再与用链霉亲和素偶联的大粒径微球进行标记混合,得到大粒径微球-链酶亲核素-生物素-PCT多抗放大***;用小粒径微球分别标记两株PCT单克隆抗体;将偶联PCT多抗的大粒径微球与偶联单抗的小粒径微球混合;然后与缓冲液、无机盐、防腐剂、表面活性剂和糖类组成试剂R1和R2,获得所述试剂盒。
作为优选,制备过程中还包括在链霉亲和素偶联大粒径微球后用封闭剂封闭,以及在PCT单克隆抗体标记小粒径微球后用封闭剂封闭。
作为优选,所述封闭剂为BSA、脱脂奶粉、酪蛋白中的一种或两种以上。在本发明具体实施方式中,所述封闭剂为BSA或脱脂奶粉。
由以上技术方案可知,本发明使用两种粒径不同微球以及两株PCT单抗和一株PCT多抗,大粒径微球用链酶亲核素修饰,小粒径微球不做处理。采用链霉亲和素与生物素放大***,将大粒径微球与链酶亲核素连接,多抗用生物素进行标记,形成大胶乳微球-链霉亲和素-生物素-多抗放大***,从而提高其低值端的灵敏度,同时用小粒径微球标记两株单抗提高其线性,从而获得一个高灵敏度与宽线性的PCT试剂盒。
附图说明
图1所示为本发明试剂盒与传统方法的定标曲线;
图2所示为本发明试剂盒的线性范围。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。本发明所述检测试剂盒及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的检测试剂盒及其制备方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
在对比实验中,如未特殊说明,各组使用相同的多抗、单抗,以及相关的实验条件保持一致。
以下就本发明所提供的一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法做进一步说明。
实施例1:制备本发明PCT检测试剂盒
1、试剂R1的制备
用分析天平称量0.3400g甘氨酸、0.1g ProClin300,0.1000gSDS,2.0000g氯化钙溶于80mL水中;调节PH7.2,定溶到100mL,即得R1。
试剂R2的制备
2、多抗链酶亲核素多抗标记
取25mmol/LHEPES(PH=7)200ul,加入30ul粒径为400nm的用链酶亲核素标记好的羧基微球,加入浓度为10mg/ml EDAC 15ul,反应20min,再加入50ul用生物素标记的PCT多抗,反应2h,加入封闭液(3%脱脂奶粉溶液,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入2ml的保存液(100mmol/ml氯化钠,0.25%SDS,80mmol/L硼酸盐(PH=7.5),0.1%脱脂奶粉,ProClin300 0.1%,蔗糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
3、用小球标记单抗
取25mmol/LHEPES(PH=7)200ul,加入50ul小粒径(140nm)羧基微球,加入浓度为10mg/ml EDAC 15ul,反应20min,再加入两珠单抗各20ul,反应2h,加入封闭液(3%BSA溶液,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入2ml的保存液(100mmol/ml氯化钠,0.25%SDS,80mmol/L硼酸盐(PH=7.5),脱脂奶粉0.1%,ProClin3000.1%,蔗糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
将用多抗链酶亲核素多抗标记与用小球标记的单抗1:1混合,即得R2。
实施例2:制备本发明PCT检测试剂盒
1、试剂R1的制备
用分析天平称量0.5700g磷酸二氢钠、0.1g叠氮钠,0.1000g吐温20,2.0000g氯化镁溶于80mL水中;调节PH7.2,定溶到100mL,即得R1。
2、试剂R2的制备
多抗链酶亲核素多抗标记
取25mmol/LHEPES(PH=7)200ul,加入30ul用粒径为400nm的用链酶亲核素标记好的羧基微球,加入浓度为10mg/ml EDAC 15ul,反应20min,再加入50ul用生物素标记的PCT多抗,反应2h,加入封闭液(3%BSA溶液,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入2ml的保存液(100mmol/ml氯化钙,0.25%吐温80,80mmol/L硼酸(PH=7.5),BSA 0.1%,NaN3 0.1%,乳糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
3、小球标记单抗
取25mmol/LHEPES(PH=7)200ul,加入50ul小粒径(140nm)羧基微球,加入浓度为10mg/ml EDAC 15ul,反应20min,再加入两珠单抗各20ul,反应2h,加入封闭液(3%BSA溶液,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入2ml的保存液(100mmol/ml氯化钙,0.25%吐温80,80mmol/L硼酸(PH=7.5),BSA 0.1%,NaN3 0.1%,乳糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
将用多抗链酶亲核素多抗标记与用小球标记的单抗1:1混合,即得R2。
实施例3:制备本发明PCT检测试剂盒
1、试剂R1的制备
用分析天平称量0.4200g TRIS、0.1g叠氮钠,0.1000g吐温20,2.0000g氯化钠溶于80mL水中;调节PH7.2,定溶到100mL,,即得R1。
2、试剂R2的制备
多抗链酶亲核素多抗标记
取25mmol/LHEPES(PH=7)200ul,加入30ul用粒径为400nm的用链酶亲核素标记好的羧基微球,加入浓度为10mg/ml EDAC 15ul,反应20min,再加入50ul用生物素标记的PCT多抗,反应2h,加入封闭液(3%酪蛋白溶液,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入2ml的保存液(100mmol/ml氯化镁,0.25%吐温80,80mmol/LTRIS(PH=7.5),酪蛋白0.1%,NaN3 0.1%,海藻糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
3、用小球标记单抗
取25mmol/LHEPES(PH=7)200ul,加入50ul小粒径(140nm)羧基微球,加入浓度为10mg/ml EDAC 15ul,反应20min,再加入两珠单抗各20ul,反应2h,加入封闭液(3%BSA溶液,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入2ml的保存液(100mmol/ml氯化镁,0.25%吐温80,80mmol/L TRIS(PH=7.5),酪蛋白0.1%,NaN3 0.1%,海藻糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
将用多抗链酶亲核素多抗标记与用小球标记的单抗1:1混合,即得R2。
实施例4:灵敏度与线性的比较
1、传统方法标记
取25mmol/L HEPES(PH=7)200ul,加入45ul的400nm的羧基微球,10mg/ml EDAC15ul,反应20min,再加入50ulPCT多抗抗体,反应2h,加入封闭液(3%脱脂奶粉,PH=7,HEPES 25mmol/L),反应2h,在15000ram,4℃条件离心30min,加入3ml的保存液(100mmol/ml氯化钠,0.25%SDS,80mmol/L硼酸盐(PH=7.5),脱脂奶粉0.1%,ProClin300 0.1%,蔗糖8%),用细胞破碎仪破碎分散,2~8度备用。
2、试验方法
采用相同的R1,本发明采用实施例1试剂R2,传统方法采用本实施例上述制备的R2,迈瑞BS390进行测试,R1:R2:S=180:60:20,校准品采用三诺校准品(S1:0ng/ml;S2:0.02ng/ml;S3:1.5ng/ml;S4:10ng/ml;S5:50ng/ml;S6:80ng/ml);
定标曲线(校准曲线)结果见表1和图1;
表1
用浓度接近线性区间下限的样本(0.02)和浓度接近线性区间上限(85.07)的样本,混合成6个稀释浓度(xi),测试每个稀释浓度检测(yi)。以xi为自变量,以yi为因变量,得到线性相关性,结果见表2和图2。
表2本发明线性相关性
理论值(ng/mL) | 测试值(ng/mL) |
0.02 | 0.18 |
17.03 | 18.43 |
34.04 | 32.54 |
51.05 | 53.24 |
68.06 | 65.17 |
85.07 | 85.23 |
结论:由数据可知传统方法到85ng/mL时其信号值比50ng/mL的信号值小,可知其线性无法到达85ng/mL,而本发明随着样本浓度的升高,信号升高,由定标数据及定标曲线可达85ng/mL,线性相关性较好,线性范围为0.02-85ng/ml,而传统方法显然无法达到这么宽的线性范围。
用0.06ng/ml的样本进行倍比稀释到0.015ng/ml,测试方法参照前述,每个样本测试10次。灵敏度结果见表2和表3;
表2
本发明方法 | 0.015ng/ml | 0.03ng/ml | 0.06ng/ml |
1 | 0.015 | 0.031 | 0.058 |
2 | 0.016 | 0.029 | 0.061 |
3 | 0.015 | 0.028 | 0.057 |
4 | 0.016 | 0.031 | 0.062 |
5 | 0.015 | 0.029 | 0.058 |
6 | 0.017 | 0.031 | 0.06 |
7 | 0.015 | 0.028 | 0.059 |
8 | 0.016 | 0.029 | 0.059 |
9 | 0.016 | 0.031 | 0.058 |
10 | 0.015 | 0.031 | 0.061 |
AVE | 0.016 | 0.030 | 0.059 |
SD | 0.0007 | 0.0013 | 0.0016 |
CV | 4.48% | 4.42% | 2.76% |
表3
传统标记方法 | 0.015ng/ml | 0.03ng/ml | 0.06ng/ml |
1 | N/A | 0.031 | 0.061 |
2 | N/A | 0.029 | 0.062 |
3 | N/A | 0.030 | 0.058 |
4 | N/A | 0.027 | 0.059 |
5 | N/A | 0.029 | 0.057 |
6 | N/A | 0.028 | 0.059 |
7 | N/A | 0.031 | 0.058 |
8 | N/A | 0.029 | 0.056 |
9 | N/A | 0.032 | 0.058 |
10 | N/A | 0.029 | 0.059 |
AVE | N/A | 0.030 | 0.059 |
SD | N/A | 0.0015 | 0.0018 |
CV | N/A | 5.12% | 3.01% |
由表2和表3可知,本发明试剂盒的标记方法的信号与灵敏度均好与传统的标记方法。本发明试剂盒的标记方法灵敏度可以达到0.015ng/ml,而传统试剂在0.015ng/ml时无法检出,灵敏度为0.03ng/ml,本发明试剂盒的灵敏度降低了一半。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
Claims (5)
1.一种降钙素原检测试剂盒,其特征在于,包括R1试剂与R2试剂;
R1试剂包括甘氨酸缓冲液、氯化钙、防腐剂、SDS和蔗糖;
R2试剂包括标记PCT多抗的大粒径微球、标记PCT单抗1的小粒径微球、标记PCT单抗2的小粒径微球、硼酸缓冲液、氯化钠、防腐剂、SDS和蔗糖;其中,所述PCT多抗通过链酶亲和素与生物素***标记大粒径微球;所述标记PCT单抗1的小粒径微球与标记PCT单抗2的小粒径微球的体积比为1:1,标记PCT多抗的大粒径微球与标记两种PCT单抗的小粒径微球1:1混合;所述大粒径微球粒径在350~450nm;小粒径微球粒径在100~200nm之间;SDS的浓度为0.1-0.5%;蔗糖的浓度为5-20%。
2.根据权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300、硫化汞、山梨酸钾中的一种或两种以上。
3.权利要求1所述试剂盒的制备方法,其特征在于,包括用生物素标记PCT多抗,再与用链霉亲和素偶联的大粒径微球进行标记混合,得到大粒径微球-链酶亲和素-生物素-PCT多抗放大***;用小粒径微球分别标记两株PCT单克隆抗体;将偶联PCT多抗的大粒径微球与偶联两种PCT单抗的小粒径微球混合;然后与缓冲液、无机盐、防腐剂、表面活性剂和糖类组成试剂R2。
4.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,还包括在链霉亲和素偶联大粒径微球后用封闭剂封闭,以及在PCT单克隆抗体标记小粒径微球后用封闭剂封闭。
5.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述封闭剂为BSA、脱脂奶粉、酪蛋白中的一种或两种以上。
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GR01 | Patent grant | ||
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