CN112698034B - 一种癌胚抗原cea的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测领域,公开了一种癌胚抗原CEA的检测试剂盒。本发明试剂盒包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R2为包被癌胚抗体的胶乳试剂,所述包被癌胚抗体的胶乳试剂由包括三乙醇胺和干酪素的封闭剂封闭制得。实验表明,本发明利用三乙醇胺和干酪素封闭制备包被癌胚抗体的胶乳试剂,有效地提高了检测灵敏度和试剂盒的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域,具体涉及一种癌胚抗原CEA的检测试剂盒。
背景技术
癌胚抗原CEA是一种分子量为180~200kDa的多糖蛋白复合物,主要存在于直肠,结肠癌组织和胚胎肠粘膜上;因这种抗原也存在于2~6个月胚胎的胃肠、肝脏和胰腺组织中,故名癌胚抗原。CEA在多种肿瘤中表达,是一个广谱性肿瘤标志物,目前在临床主要用辅助恶性肿瘤的诊断、判断肿瘤分期和病变程度、监测治疗和预报复发等。
目前,检测CEA的方法较多,包括酶联免疫法(ELISA)、化学发光(CLIA)免疫分析法、胶乳免疫比浊法等。采用酶联免疫法检测癌胚抗原的主要缺点是检测过程中需要手动操作,耗时长,结果重现性较差;采用化学发光法检测癌胚抗原准确性和可重复性都较好,但试剂成本相对较高;目前胶乳免疫比浊法具有操作简单,测定结果快速准确,成本较低,对疾病的早期诊断和治疗具有重要意义;但癌胚抗原胶乳免疫比浊试剂监测灵敏度是一大难题。
根据健康人群体检数据,血清中CEA含量一般在5ng/mL以下,因此在保证试剂线性范围的基础上,增加胶乳试剂的灵敏度是非常有必要的,否则临床检验时会出现较多的假阳性样本的问题,干扰临床诊断。因此,目前亟需研发一种灵敏度高、稳定性较好、方便快捷、成本较低,可在全自动生化分析仪上使用的癌胚抗原检测试剂盒。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种癌胚抗原CEA的检测试剂盒,使得所述试剂盒能够具有灵敏度高、稳定性好的优点。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种癌胚抗原CEA的检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2;
本发明检测试剂盒在试剂R2制备过程中同时利用三乙醇胺和干酪素进行封闭,三乙醇胺的化学结构式为C6H15NO3,干酪素的化学结构式为NH2RCOOH,三乙醇胺结构中含有3个羟基,其羟基可与胶乳颗粒上未被抗体完全结合的活化羧基及环氧基结合,使颗粒表面更具有亲水性,从而防止生物由来物质的吸附,有效地降低非特异性反应,提高了检测灵敏度;同时,干酪素有利于与胶乳颗粒结合后的抗体的立体构造和/或其方向的稳定性,进而改善抗体结合胶乳颗粒后性能的稳定。实验表明,本发明检测试剂盒具有更高的灵敏度和稳定性。
一些实施方案中,本发明检测试剂盒中,三乙醇胺的工作浓度以质量百分数计为5-10%,干酪素的工作浓度以质量百分数计为5-10%。一些具体实施例中,三乙醇胺的工作浓度以质量百分数计为10%,干酪素的工作浓度以质量百分数计为10%。
一些实施方案中,所述试剂R2由如下步骤制得:
步骤1:将胶乳颗粒稀释、活化,加入癌胚抗体进行偶联,得混合液;
步骤2:向所述混合液中加入封闭剂封闭30min-60min,离心,得沉淀物;
步骤3:向所述沉淀物中加入R2稀释液重悬,经超声分散、老化,获得试剂R2;
所述封闭剂包括三乙醇胺和干酪素。
一些实施方案中,步骤1中,所述稀释具体为:用10-50mM,pH为5.0-10.0的包被缓冲液进行稀释。其中,包被缓冲液的pH优选为6.0-8.0。包被缓冲液选自磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种。
一些具体实施例中,步骤1中,所述稀释具体为:用50mMpH7.0的MOPS缓冲液稀释。
一些实施方案中,步骤1中,所述活化的时间为1~2h。一些具体实施例中,所述活化的时间为1h。进一步的,所述活化采用的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
一些实施方案中,步骤1中加入癌胚抗体进行偶联,所述偶联的时间为2-6h,优选为5h。
一些具体实施例中,步骤2中所述封闭的时间为60min。
一些实施方案中,步骤3中所述老化为25-60℃老化16-72小时。一些具体实施例中,所述老化为42℃老化20小时。
一些实施方案中,步骤3中所述老化后还包括加入R2稀释液稀释的步骤。所述R2稀释液的加入量为:加入R2稀释液使得胶乳反应溶液稀释至0.05-0.2%。一些具体实施例中,所述R2稀释液的加入量为:加入R2稀释液使得胶乳反应溶液稀释至0.1%。
本发明试剂R2的制备中,所述稀释、活化、偶联和封闭均在搅拌条件下进行,搅拌的温度为25-45℃,优选为25-37℃。
一些实施方案中,所述R2稀释液包括糖类和缓冲液R2。
一些实施方案中,所述缓冲液R2选自磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种或几种,所述缓冲液R2的浓度为10-50mM,pH为5.0-8.0。
一些实施方案中,所述糖类为海藻糖、蔗糖和甘露醇中的一种或几种;所述糖类的浓度为50-100g/L。
一些实施方案中,所述R2稀释液还包括蛋白稳定剂;所述R2稀释液中蛋白稳定剂的浓度为1-5g/L。
一些具体实施例中,所述R2稀释液为含5%蔗糖、0.9%NaCl、1%BSA和0.1%PC300的50mM pH7.0的磷酸盐缓冲液。其中,各组分含量%均为质量百分比。
一些实施方案中,所述试剂R1包括缓冲液R1、表面活性剂、防腐剂、电解质和生物稳定剂。
其中,所述缓冲液R1选自磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种。
一些具体实施例中,所述试剂R1为含5%NaCl、10mM EDTA-2Na、1%BSA、1%聚乙二醇6000、0.1%吐温-80和0.1%PC300的50mMpH7.0的磷酸盐缓冲液。
本发明提供的检测试剂盒,还包括校准品溶液,所述校准品溶液包括校准品、校准品缓冲液、表面活性剂、防腐剂和生物稳定剂,所述校准品为CEA重组蛋白或天然CEA蛋白,所述标准品缓冲液选自PB缓冲液、MOPS、Tris、TAPSO、HEPES中一种或几种。其中,表面活性剂、防腐剂和生物稳定剂均为本领域常见的种类,本领域技术人员可以根据实际需要进行常规选择。
一些具体实施例中,所述校准品溶液为含1%BSA、0.1%吐温-20、0.1%PC300和CEA重组蛋白的50mMpH7.0的PB缓冲液。
本发明提供的癌胚抗原CEA的检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R2为包被癌胚抗体的胶乳试剂,所述包被癌胚抗体的胶乳试剂由包括三乙醇胺和干酪素的封闭剂封闭制得。本发明利用三乙醇胺和干酪素封闭制备包被癌胚抗体的胶乳试剂,有效地提高了检测灵敏度和试剂盒的稳定性。实验表明,采用本发明检测试剂盒进行癌胚抗原检测具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优势,可高效快速的检测血清样本中癌胚抗原的含量。
附图说明
图1示实施例1的试剂盒在生化仪上的反应标准曲线;
图2示实施例1的试剂盒的线性考察实验结果;
图3示实施例1的试剂盒与化学发光测值相关性分析图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种癌胚抗原CEA的检测试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1本发明检测试剂盒
试剂R1包括:50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0),5%NaCl,10mM EDTA-2Na,1%BSA,1%聚乙二醇6000,0.1%吐温-80,0.1%PC300。
校准品包括:50mMPB缓冲液(pH7.0),1%BSA,0.1%吐温-20,0.1%PC300和CEA重组蛋白,其中CEA重组蛋白浓度分别为5.5ng/mL,13.7ng/mL,27.7ng/mL,64.7ng/mL,102.9ng/mL。
试剂R2的制备中,R2稀释液包括:50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0),5%蔗糖,0.9%NaCl,1%BSA,0.1%PC300。
试剂R2制备方法:
使用50mM MOPS缓冲液稀释胶乳颗粒,使得胶乳颗粒终浓度为2%,体积为5mL,室温环境下搅拌5分钟。向胶乳颗粒混合液中加入4mg/L的EDC 0.6mL进行活化,活化1h后,使用50mM MOPS缓冲液分别稀释鼠抗人单克隆抗体1、鼠抗人单克隆抗体2,使得各抗体终浓度为0.2mg/mL,体积为1mL,抗体加入活化好的微球中,室温下反应5h,然后加入50uL PB稀释的浓度为10%三乙醇胺和10%干酪素封闭1h,进行离心后的沉淀中加入R2稀释液重悬,超声分散均匀,并于42℃老化20小时,得胶乳反应溶液,然后加入R2稀释液稀释至1%,得到稳定的抗体包被的胶乳颗粒;将两种抗体包被的胶乳颗粒超声混合,4-10℃保存。
按照上述方法制得的检测试剂盒在生化仪上的反应标准曲线如图1所示。
实施例2本发明检测试剂盒的检测方法
在TBA120上定标检测样本,具体参数见表1。
表1检测参数
实施例3不同封闭剂封闭效果的比较
实验组:实施例1的检测试剂盒,其中,R2试剂使用10%三乙醇胺和10%干酪素同时进行封闭。
对照组1~4试剂盒:R2试剂分别使用10%BSA、10%乙醇胺、10%三乙醇胺、10%干酪素进行封闭,其他组分及试剂R2的制备放方法与实施例1相同;
对照组5试剂盒:试剂R2使用10%BSA和10%乙醇胺进行封闭,其他组分及试剂R 2的制备方法与实施例1相同;
对照组6试剂盒:试剂R2使用10%BSA和10%三乙醇胺进行封闭,其他组分及试剂R2的制备方法与实施例1相同;
对照组7试剂盒:试剂R2使用10%干酪素和10%乙醇胺进行封闭,其他组分及试剂R2的制备方法与实施例1相同。
对实施例1、对照组1~7的试剂盒的分析灵敏度和检出限进行测试,测试结果如表2和表3所示。
表2分析灵敏度考察结果
表3检出限考察结果
实施例4本发明试剂盒线性考察
收集高值病人血清样本,与正常人血清按比例稀释成11个不同浓度,使用实施例1试剂测定线性样本,每个浓度重复测定两次,通过计算相关系数考察线性(见图2),结果见表4。
表4实施例1试剂盒线性考察结果
理论值 | 实测值 |
3.40 | 3.60 |
15.64 | 13.30 |
27.88 | 23.50 |
40.12 | 34.30 |
52.36 | 45.60 |
64.60 | 60.80 |
76.84 | 72.70 |
89.08 | 85.70 |
101.32 | 103.90 |
113.56 | 116.40 |
125.80 | 125.50 |
实施例5本发明试剂盒稳定性考察
将实施例1制备的试剂R1和试剂R2分别放置于4℃冰箱中,分别于第1、2、3、4、5、6、9、12、18、24个月取出进行测试。分别测试高/低值质控品,重复测试3次,取平均值,试剂稳定性测试结果比较,计算相对偏差(%)。结果如表5所示。
表5实施例1癌胚抗原试剂盒稳定性考察结果
实施例6本发明试剂盒与市售化学发光法试剂进行相关性考察
同时使用实例1试剂和已上市的对照发光试剂盒检测40例样本(异常样本不少于20例),记录两个试剂盒的检测结果,见图3。
结果显示本发明试剂盒测值准确,与发光试剂相关性良好,可以用于临床癌胚抗原检测。
以上结果表明,本发明试剂盒灵敏度高、特异性强,可在全自动生化分析仪上使用,方便快捷,成本较低。线性范围的评价实验结果表明,本发明试剂盒线性良好。将本发明试剂盒与市售化学发光法试剂进行相关性分析的结果可以看出本发明试剂盒准确性可靠,相关性良好,可以应用于癌胚抗原检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种癌胚抗原CEA的检测试剂盒,其特征在于,包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R2为包被癌胚抗体的胶乳试剂,所述包被癌胚抗体的胶乳试剂由三乙醇胺和干酪素组成的封闭剂封闭制得;
所述三乙醇胺的工作浓度以质量百分数计为10%,所述干酪素的工作浓度以质量百分数计为10%。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2由如下步骤制得:
步骤1:将胶乳颗粒稀释、活化,加入癌胚抗体进行偶联,得混合液;
步骤2:向所述混合液中加入封闭剂封闭30min-60min,离心,得沉淀物;
步骤3:向所述沉淀物中加入R2稀释液重悬,经超声分散、老化,获得试剂R2;
所述封闭剂由三乙醇胺和干酪素组成。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,步骤1中所述稀释具体为:用浓度为10-50mM,pH为5.0-10.0的包被缓冲液进行稀释,所述包被缓冲液选自磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,步骤1中所述活化的时间为1~2h,所述活化采用的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,所述偶联的时间为2-6h。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,步骤3中所述R2稀释液包括糖类和缓冲液R2;所述老化为25-60℃老化16-72小时;
所述缓冲液R2选自磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液和MOPS缓冲液中的一种或几种,所述缓冲液R2的浓度为10-50mM,pH为5.0-8.0;
所述糖类为海藻糖、蔗糖和甘露醇中的一种或几种;所述糖类的浓度为50-100g/L。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,步骤3中所述R2稀释液还包括蛋白稳定剂;所述R2稀释液中蛋白稳定剂的浓度为1-5g/L。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1包括缓冲液R1、表面活性剂、防腐剂、电解质和生物稳定剂。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于,所述缓冲液R1选自磷酸盐缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括校准品,所述校准品为CEA重组蛋白或天然CEA蛋白。
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GR01 | Patent grant | ||
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