JP2588174B2 - 抗原−抗体反応の測定法 - Google Patents
抗原−抗体反応の測定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗原−抗体反応の測定法に関する。更に詳
しくは、抗体又は抗原を感作したラテックス粒子に、感
作した抗体に対する抗原もしくは感作した抗原に対する
抗体を水溶媒中で反応させ、特定波長を照射し、その吸
光度変化を測定する抗原抗体反応の定量法に関する。
しくは、抗体又は抗原を感作したラテックス粒子に、感
作した抗体に対する抗原もしくは感作した抗原に対する
抗体を水溶媒中で反応させ、特定波長を照射し、その吸
光度変化を測定する抗原抗体反応の定量法に関する。
（従来の技術） 現在、免疫診断においてはRIA法（ラジオイムノアッ
セイ法）、EIA法（エンザイムイム（ノアッセイ法）、
ラテックス凝集反応を利用した方法の３つの方法が一般
的である。この中でラテックス凝集反応を利用した方法
は安全性や測定時間が短いという利点を有する（たとえ
ば、特公昭58−11575号公報参照）。
セイ法）、EIA法（エンザイムイム（ノアッセイ法）、
ラテックス凝集反応を利用した方法の３つの方法が一般
的である。この中でラテックス凝集反応を利用した方法
は安全性や測定時間が短いという利点を有する（たとえ
ば、特公昭58−11575号公報参照）。
一般的に行なわれているラテックス凝集反応を光学的
に測定する方法は、ある平均粒径をもつラテックスに定
量しようとする抗原に対する抗体又は定量しようとする
抗体に対する抗原を感作し、この感作ラテックスをプラ
スチックやガラス等を使用したセル内で患者の尿、血清
又は血漿を含む水溶媒中で反応させる。目的とする物質
がセル中に存在する場合、ラテックスは凝集し、セル外
部より0.3〜2.4μｍの波長から選ばれる適当な波長の光
を照射し、吸光度変化を測定することにより、セル中の
抗体又は抗原量を定量できる。実際には、ラテックス凝
集反応を光学的に測定する方法において既知の異なるレ
ベルの検体を測定することによって得られる濃度と平均
反応速度又は濃度と吸光度変化の検量線を使用して、こ
れに未知濃度の検体の反応速度又は吸光度変化を測定す
ることによりその濃度を定量することが可能となる。
に測定する方法は、ある平均粒径をもつラテックスに定
量しようとする抗原に対する抗体又は定量しようとする
抗体に対する抗原を感作し、この感作ラテックスをプラ
スチックやガラス等を使用したセル内で患者の尿、血清
又は血漿を含む水溶媒中で反応させる。目的とする物質
がセル中に存在する場合、ラテックスは凝集し、セル外
部より0.3〜2.4μｍの波長から選ばれる適当な波長の光
を照射し、吸光度変化を測定することにより、セル中の
抗体又は抗原量を定量できる。実際には、ラテックス凝
集反応を光学的に測定する方法において既知の異なるレ
ベルの検体を測定することによって得られる濃度と平均
反応速度又は濃度と吸光度変化の検量線を使用して、こ
れに未知濃度の検体の反応速度又は吸光度変化を測定す
ることによりその濃度を定量することが可能となる。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、近年、免疫診断では尿、血清、血漿等
に含まれる微量物質、例えば癌マーカーであるαフエト
プロテイン（AFP）やカルテイノエンブリオイツクアン
テイジエン（CFA）などは数ng/mlといった濃度まで定量
することが望まれている。物質によって測定を必要とす
る濃度範囲は様々であり、数ng/mlから数μmg/mlまでの
広範囲の濃度を定量しなければならない。ラテックス凝
集反応試薬の高感度測定を行なうには特に （イ）使用するラテックスとして平均粒径の比較的大き
なものを用い、 （ロ）ラテックスに対する抗体又は抗原感作量を多く
し、 （ハ）感作する抗体または抗原の特異性、親和性が高い
ものを用い、 （ニ）感作ラテックス粒子濃度を吸光度の測定が可能な
範囲において高濃度とする ことが有利である。（ロ）、（ハ）、（ニ）については
高価である抗体又は抗原を多量に使用することになり、
試薬コストの上昇を招き、しかも十分な効果は得られな
い。（イ）に関しては例えばAFPの測定では数ng/ml〜50
0ng/mlの濃度範囲を必要とするが、ラテックスの平均粒
径0.2μｍにAFP抗体を感作したラテックスでは測定可能
濃度範囲は25ng/ml〜2000ng/mlであるのに対し、0.5μ
ｍのラテックスでは、測定可能濃度範囲は、10ng/ml〜2
00ng/mlといったように低濃度感度アップは達成される
が高濃度においては検量線の直線性がなくなり、200ng/
mlまでと測定範囲が狭くなるという難点を有する。
に含まれる微量物質、例えば癌マーカーであるαフエト
プロテイン（AFP）やカルテイノエンブリオイツクアン
テイジエン（CFA）などは数ng/mlといった濃度まで定量
することが望まれている。物質によって測定を必要とす
る濃度範囲は様々であり、数ng/mlから数μmg/mlまでの
広範囲の濃度を定量しなければならない。ラテックス凝
集反応試薬の高感度測定を行なうには特に （イ）使用するラテックスとして平均粒径の比較的大き
なものを用い、 （ロ）ラテックスに対する抗体又は抗原感作量を多く
し、 （ハ）感作する抗体または抗原の特異性、親和性が高い
ものを用い、 （ニ）感作ラテックス粒子濃度を吸光度の測定が可能な
範囲において高濃度とする ことが有利である。（ロ）、（ハ）、（ニ）については
高価である抗体又は抗原を多量に使用することになり、
試薬コストの上昇を招き、しかも十分な効果は得られな
い。（イ）に関しては例えばAFPの測定では数ng/ml〜50
0ng/mlの濃度範囲を必要とするが、ラテックスの平均粒
径0.2μｍにAFP抗体を感作したラテックスでは測定可能
濃度範囲は25ng/ml〜2000ng/mlであるのに対し、0.5μ
ｍのラテックスでは、測定可能濃度範囲は、10ng/ml〜2
00ng/mlといったように低濃度感度アップは達成される
が高濃度においては検量線の直線性がなくなり、200ng/
mlまでと測定範囲が狭くなるという難点を有する。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、このような課題を解決することを目的と
し、低濃度の目的物質の測定を可能とするばかりでな
く、希釈等の操作を加えることなくある程度、高濃度の
目的物質の測定を可能とするラテックス凝集反応におけ
る抗原−抗体反応測定法を提供しようとするものであ
る。
し、低濃度の目的物質の測定を可能とするばかりでな
く、希釈等の操作を加えることなくある程度、高濃度の
目的物質の測定を可能とするラテックス凝集反応におけ
る抗原−抗体反応測定法を提供しようとするものであ
る。
すなわち、本発明は平均粒径の異なる２種類または３
種類以上のラテックスを混合することによって低濃度〜
高濃度までの広範囲濃度の抗原又は抗体の測定を可能に
するものであり、その要旨は平均粒径の異なる２種類以
上のラテックスに抗体もしくは抗原を感作して混合した
懸濁液又は平均粒径の異なる２種類以上のラテックスを
混合した後、抗体または抗原を感作した懸濁液と、感作
した抗体に対する抗原、もしくは感作した抗原に対する
抗体とを水溶媒中で反応させ、光を照射し、その吸光度
変化を測定して、抗原−抗体反応を測定する方法におい
て、平均粒径0.05〜0.3μｍの範囲にあるラテックスと
平均粒径0.3〜1.0μｍの範囲にあるラテックスとを混合
すること、及び、混合したラテックスの平均粒径の少な
くとも2.5倍であり、かつ、0.6〜2.4μｍの波長の光を
照射することを特徴とする抗原−抗体反応の測定法にあ
る。
種類以上のラテックスを混合することによって低濃度〜
高濃度までの広範囲濃度の抗原又は抗体の測定を可能に
するものであり、その要旨は平均粒径の異なる２種類以
上のラテックスに抗体もしくは抗原を感作して混合した
懸濁液又は平均粒径の異なる２種類以上のラテックスを
混合した後、抗体または抗原を感作した懸濁液と、感作
した抗体に対する抗原、もしくは感作した抗原に対する
抗体とを水溶媒中で反応させ、光を照射し、その吸光度
変化を測定して、抗原−抗体反応を測定する方法におい
て、平均粒径0.05〜0.3μｍの範囲にあるラテックスと
平均粒径0.3〜1.0μｍの範囲にあるラテックスとを混合
すること、及び、混合したラテックスの平均粒径の少な
くとも2.5倍であり、かつ、0.6〜2.4μｍの波長の光を
照射することを特徴とする抗原−抗体反応の測定法にあ
る。
本発明において、平均粒径の異なる２種類または３種
類以上のラテックスにそれぞれ抗体又は抗原を感作し、
一定の比率で混合するというラテックス試薬調製方法で
は小粒径ラテックスの測定範囲の広さと、大粒径のラテ
ックスの低濃度域での高感度という２つの性質をもった
試薬を提供することができる。これは平均粒径の明らか
に異なる２種類または３種類以上のラテックスを一定な
比率で混合した後、抗体又は抗原を感作しても同様な結
果が得られる。
類以上のラテックスにそれぞれ抗体又は抗原を感作し、
一定の比率で混合するというラテックス試薬調製方法で
は小粒径ラテックスの測定範囲の広さと、大粒径のラテ
ックスの低濃度域での高感度という２つの性質をもった
試薬を提供することができる。これは平均粒径の明らか
に異なる２種類または３種類以上のラテックスを一定な
比率で混合した後、抗体又は抗原を感作しても同様な結
果が得られる。
以下、本発明方法を詳細に説明する。
まず、本発明方法において用いられるラテックス凝集
反応における吸光度の変化を測定し、抗原又は抗体を定
量する方法は、たとえば特公昭58−11575号公報、特開
昭54−109494号公報等に記載された方法によることがで
きる。
反応における吸光度の変化を測定し、抗原又は抗体を定
量する方法は、たとえば特公昭58−11575号公報、特開
昭54−109494号公報等に記載された方法によることがで
きる。
すなわち、好ましくは、平均粒径が1.6μｍ以下の不
溶性担体粒子を用い、これに抗体又は抗原を担持させ
（感作し）、これに被検体中の抗原及び又は抗体を反応
せしめ、その反応混合物の吸光度を、0.6〜2.4μｍの範
囲の波長の光線で測定して求めることにより、該被検体
中の抗原及び／又は抗体の量（乃至濃度）を測定する。
用いる光線は、好ましくは該不溶性担体粒子の平均粒径
の少なくとも2.5倍の波長のものが好適である。
溶性担体粒子を用い、これに抗体又は抗原を担持させ
（感作し）、これに被検体中の抗原及び又は抗体を反応
せしめ、その反応混合物の吸光度を、0.6〜2.4μｍの範
囲の波長の光線で測定して求めることにより、該被検体
中の抗原及び／又は抗体の量（乃至濃度）を測定する。
用いる光線は、好ましくは該不溶性担体粒子の平均粒径
の少なくとも2.5倍の波長のものが好適である。
不溶性担体粒子としては、測定を行う時に用いられる
液体媒体に実質的に不溶性で前記平均粒径を有する有機
高分子物質の微粒子、例えばポリスチレン、スチレン−
ブタジエン共重合体の如き乳化重合により得られる有機
高分子のラテックスが好ましい。
液体媒体に実質的に不溶性で前記平均粒径を有する有機
高分子物質の微粒子、例えばポリスチレン、スチレン−
ブタジエン共重合体の如き乳化重合により得られる有機
高分子のラテックスが好ましい。
かかる不溶性担体粒子（例えばラテックス粒子）に、
測定しようとする被検体中の抗原及び／又は抗体と反応
し得る抗体又は抗原を担持させる（感作する）。この場
合、担体に対して抗体又は抗原を物理的に吸着させても
よいし、及び／又は化学的に吸着させてもよい。
測定しようとする被検体中の抗原及び／又は抗体と反応
し得る抗体又は抗原を担持させる（感作する）。この場
合、担体に対して抗体又は抗原を物理的に吸着させても
よいし、及び／又は化学的に吸着させてもよい。
未知量の抗原及び／又は抗体を含有する被検体（試
料）中の抗原及び／又は抗体を定量するためには、一定
の抗原及び／又は抗体を一定量含有する標準試料を用い
て、これを種々の倍率で稀釈した種々の稀釈標準試料を
用意し、これを一定量の一定抗体又は抗原を感作した不
溶性担体粒子と一定条件下で反応させ、この反応混合物
の吸光度を測定して、一定の抗原及び／又は抗体と感作
担体粒子とについて、該抗原又は抗体の量（濃度）と吸
光度との関係を示す標準曲線を作成しておく。次に、こ
の標準曲線の作成に用いたと同一の感作担体粒子を用い
て、その作成の場合と実質的に一定条件下で未知試料と
該感作担体とを反応させ、その吸光度を測定し、この吸
光度を前記標準曲線と比較、照合することにより、該未
知試料中の抗原及び／又は抗体の量（又は濃度）を定量
することができる。
料）中の抗原及び／又は抗体を定量するためには、一定
の抗原及び／又は抗体を一定量含有する標準試料を用い
て、これを種々の倍率で稀釈した種々の稀釈標準試料を
用意し、これを一定量の一定抗体又は抗原を感作した不
溶性担体粒子と一定条件下で反応させ、この反応混合物
の吸光度を測定して、一定の抗原及び／又は抗体と感作
担体粒子とについて、該抗原又は抗体の量（濃度）と吸
光度との関係を示す標準曲線を作成しておく。次に、こ
の標準曲線の作成に用いたと同一の感作担体粒子を用い
て、その作成の場合と実質的に一定条件下で未知試料と
該感作担体とを反応させ、その吸光度を測定し、この吸
光度を前記標準曲線と比較、照合することにより、該未
知試料中の抗原及び／又は抗体の量（又は濃度）を定量
することができる。
また、別法として、前記標準曲線を作成する場合に、
例えば一定の吸光度に達するに要する反応時間あるいは
吸光度の経時変化（反応速度）と使用した標準試料中の
抗原又は抗体の量（濃度）との関係を示す標準曲線を作
成しておけば、これと実質的に同一条件下で、前記感作
担体粒子と未知試料とを反応させて、前記の一定吸光度
に達するに要する反応時間あるいは反応速度を読みとる
ことにより、該未知試料中の抗原及び／又は抗体の量
（又は濃度）を定量することもできる。
例えば一定の吸光度に達するに要する反応時間あるいは
吸光度の経時変化（反応速度）と使用した標準試料中の
抗原又は抗体の量（濃度）との関係を示す標準曲線を作
成しておけば、これと実質的に同一条件下で、前記感作
担体粒子と未知試料とを反応させて、前記の一定吸光度
に達するに要する反応時間あるいは反応速度を読みとる
ことにより、該未知試料中の抗原及び／又は抗体の量
（又は濃度）を定量することもできる。
本発明方法においては、上記ラテックスとして、平均
粒径の異なる二種類以上を用いることが必要である。
粒径の異なる二種類以上を用いることが必要である。
この平均粒径は、通常0.05〜1.0μｍ程度から選ばれ
る。用いる複数のラテックスの粒径の差は、（ｉ）測定
下限濃度（感度）、（ii）測定範囲（通常、測定下限濃
度の1000倍程度まで）、（iii）ラテックス濃度、（i
v）抗原−抗体の反応性等により異なるが、0.1μｍ以上
の差が選ばれ、好ましくは0.2μｍ以上の差が選ばれ
る。また、少くとも１種は0.05〜0.3μｍと0.3〜１μｍ
の範囲からそれぞれ選ぶのが好適である。
る。用いる複数のラテックスの粒径の差は、（ｉ）測定
下限濃度（感度）、（ii）測定範囲（通常、測定下限濃
度の1000倍程度まで）、（iii）ラテックス濃度、（i
v）抗原−抗体の反応性等により異なるが、0.1μｍ以上
の差が選ばれ、好ましくは0.2μｍ以上の差が選ばれ
る。また、少くとも１種は0.05〜0.3μｍと0.3〜１μｍ
の範囲からそれぞれ選ぶのが好適である。
この複数のラテックスの混合割合（体積比）は1:10〜
10:1、好ましくは1:3〜3:1程度から選ばれる。目的とす
る測定下限（感度）は、抗原、抗体の種類のよっても異
なるが〜1ng/ml程度であり、たとえば、AFPでは５〜10n
g/ml、フエリチンでは10ng/ml程度である。
10:1、好ましくは1:3〜3:1程度から選ばれる。目的とす
る測定下限（感度）は、抗原、抗体の種類のよっても異
なるが〜1ng/ml程度であり、たとえば、AFPでは５〜10n
g/ml、フエリチンでは10ng/ml程度である。
検量線は測定下限の1000倍程度まで作成するのが一般
的である。
的である。
さらに具体的に説明すると、たとえば実施例１に示す
ようにAFP測定において平均粒径0.2μｍのポリスチレン
ラテックスと平均粒径0.4μｍのポリスチレンラテック
スにそれぞれAFP抗体（ヒトAFPを動物に免疫して得られ
る抗AFP特異抗体）を感作し、1:1及び1:2（体積比）の
比率で混合、調製した場合図１に示すように平均反応速
度Ｖ、最大反応速度Vmax（12秒ごとに50点測定した反応
速度の最大値）と濃度との検量線は100ng/ml〜2000ng/m
lの範囲において0.2μｍの平均粒径のラテックスの比率
が増えるにつれて、検量線の傾きが大きくなる。このこ
とは表３に示すように各々の検量線で濃度既知の標準検
体を測定した場合、0.2μｍを多く含むラテックスの試
薬の方が測定範囲の上限が高いことを意味する。各ラテ
ックスの測定範囲の上限を見ると0.2μｍの抗AFPラテッ
クスでは、標準検体濃度2,000ng/mlで変動係数C.V.％が
1.77％と低値であり、上限は2,000ng/mlである。0.4μ
ｍ抗体AFPラテックスでは300ng/mlでC.V.％8.26％を示
し、上限は200ng/mlと狭くなる。一方、0.2μｍ及び0.4
μｍのラテックスを1:1で混合した抗AFP混合ラテックス
では500ng/mlでのC.V.％4.76％であり、1:2混合した抗A
FP混合ラテックスでは、500ng/mlでのC.V.％5.46％であ
る。これらの２種類の混合ラテックスの測定上限は、と
もに500ng/mlである。
ようにAFP測定において平均粒径0.2μｍのポリスチレン
ラテックスと平均粒径0.4μｍのポリスチレンラテック
スにそれぞれAFP抗体（ヒトAFPを動物に免疫して得られ
る抗AFP特異抗体）を感作し、1:1及び1:2（体積比）の
比率で混合、調製した場合図１に示すように平均反応速
度Ｖ、最大反応速度Vmax（12秒ごとに50点測定した反応
速度の最大値）と濃度との検量線は100ng/ml〜2000ng/m
lの範囲において0.2μｍの平均粒径のラテックスの比率
が増えるにつれて、検量線の傾きが大きくなる。このこ
とは表３に示すように各々の検量線で濃度既知の標準検
体を測定した場合、0.2μｍを多く含むラテックスの試
薬の方が測定範囲の上限が高いことを意味する。各ラテ
ックスの測定範囲の上限を見ると0.2μｍの抗AFPラテッ
クスでは、標準検体濃度2,000ng/mlで変動係数C.V.％が
1.77％と低値であり、上限は2,000ng/mlである。0.4μ
ｍ抗体AFPラテックスでは300ng/mlでC.V.％8.26％を示
し、上限は200ng/mlと狭くなる。一方、0.2μｍ及び0.4
μｍのラテックスを1:1で混合した抗AFP混合ラテックス
では500ng/mlでのC.V.％4.76％であり、1:2混合した抗A
FP混合ラテックスでは、500ng/mlでのC.V.％5.46％であ
る。これらの２種類の混合ラテックスの測定上限は、と
もに500ng/mlである。
測定範囲の下限は表１のブランクの平均反応速度Ｖと
標準検体濃度4.2ng/mlの平均反応速度Ｖ値を比較し、こ
の値の差がブランクの平均反応速度Ｖの標準偏差S.D.よ
り大きい程、反応性の高い試薬と言うことができる。表
１に示すように0.4μｍの平均粒径のラテックスの含ま
れる比率が大きくなるにつれ、低濃度の平均反応速度Ｖ
は大きくなる。表３の標準検体の測定値においても0.2
μｍ抗AFPラテックスの下限はC.V.％10％以下を目安に
すれば25ng/mlであり、0.4μｍ抗AFPラテックス4.2ng/m
lである。0.2μｍ及び0.4μｍの1:1、1:2抗AFP混合ラテ
ックスもそれぞれC.V.％7.31％、6.37％であり、測定下
限は4.2ng/mlである。測定範囲を比較すると0.2μｍ抗A
FPラテックスではその測定可能濃度範囲は、25ng/ml〜
2,000ng/mlであり、高濃度については十分であるが低濃
度の感度が不足している。0.4μｍ抗AFPラテックスで
は、その測定可能濃度範囲は、5ng/ml〜200ng/mlであ
り、高濃度域が狭いという欠点を有する。一方、1:1及
び1:2抗AFP混合ラテックスの場合は、ともにその測定可
能濃度範囲は、5ng/ml〜500ng/mlであり、上限、下限と
もに現在の臨床における要求を満足するものである。
標準検体濃度4.2ng/mlの平均反応速度Ｖ値を比較し、こ
の値の差がブランクの平均反応速度Ｖの標準偏差S.D.よ
り大きい程、反応性の高い試薬と言うことができる。表
１に示すように0.4μｍの平均粒径のラテックスの含ま
れる比率が大きくなるにつれ、低濃度の平均反応速度Ｖ
は大きくなる。表３の標準検体の測定値においても0.2
μｍ抗AFPラテックスの下限はC.V.％10％以下を目安に
すれば25ng/mlであり、0.4μｍ抗AFPラテックス4.2ng/m
lである。0.2μｍ及び0.4μｍの1:1、1:2抗AFP混合ラテ
ックスもそれぞれC.V.％7.31％、6.37％であり、測定下
限は4.2ng/mlである。測定範囲を比較すると0.2μｍ抗A
FPラテックスではその測定可能濃度範囲は、25ng/ml〜
2,000ng/mlであり、高濃度については十分であるが低濃
度の感度が不足している。0.4μｍ抗AFPラテックスで
は、その測定可能濃度範囲は、5ng/ml〜200ng/mlであ
り、高濃度域が狭いという欠点を有する。一方、1:1及
び1:2抗AFP混合ラテックスの場合は、ともにその測定可
能濃度範囲は、5ng/ml〜500ng/mlであり、上限、下限と
もに現在の臨床における要求を満足するものである。
実施例２は抗フエリチンラテックスについてである。
表４は0.3μｍと0.5μｍの抗フエリチン混合ラテックス
の検量線データ及び0.5μｍの抗フエリチンラテックス
の検量線データを示す。抗AFPラテックスと同様、粒径
の小さいラテックスを混合すると低濃度の平均反応速度
Ｖは低値となり、300ng/mlと400ng/mlのVmax値の差を比
較すると0.3μｍ及び0.5μｍの抗フエリチン混合ラテッ
クスの方が大きくなり、検量線の傾きが大きく、高濃度
域の測定に適していることが明らかである。表５に0.3
μｍ抗フエリチンラテックス、0.3μｍと0.5μｍの平均
粒径の3:1、1:1抗フエリチン混合ラテックス、0.5μｍ
抗フエリチンラテックスの低濃度標準検体の測定値を示
す。平均反応速度Ｖは0.5μｍラテックスの混合比が増
えるに従って大きくなり、0.5μｍの抗フエリチンラテ
ックスは低濃度域の測定に優れていることがわかる。
表４は0.3μｍと0.5μｍの抗フエリチン混合ラテックス
の検量線データ及び0.5μｍの抗フエリチンラテックス
の検量線データを示す。抗AFPラテックスと同様、粒径
の小さいラテックスを混合すると低濃度の平均反応速度
Ｖは低値となり、300ng/mlと400ng/mlのVmax値の差を比
較すると0.3μｍ及び0.5μｍの抗フエリチン混合ラテッ
クスの方が大きくなり、検量線の傾きが大きく、高濃度
域の測定に適していることが明らかである。表５に0.3
μｍ抗フエリチンラテックス、0.3μｍと0.5μｍの平均
粒径の3:1、1:1抗フエリチン混合ラテックス、0.5μｍ
抗フエリチンラテックスの低濃度標準検体の測定値を示
す。平均反応速度Ｖは0.5μｍラテックスの混合比が増
えるに従って大きくなり、0.5μｍの抗フエリチンラテ
ックスは低濃度域の測定に優れていることがわかる。
以上の結果から、異なる平均粒径をもつ感作ラテック
スを混合した試薬は混合するものとラテックスの性質を
混合比の割合に対応して反映したラテックスということ
ができる。つまり、粒径の異なる感作ラテックスの混合
比を変えることによって目的とする物質の測定に必要と
する測定範囲に近づけることができ、自由度の大きい試
薬を調製することができる。
スを混合した試薬は混合するものとラテックスの性質を
混合比の割合に対応して反映したラテックスということ
ができる。つまり、粒径の異なる感作ラテックスの混合
比を変えることによって目的とする物質の測定に必要と
する測定範囲に近づけることができ、自由度の大きい試
薬を調製することができる。
（実施例） 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発
明はその要旨を越えない限り、以下の実施例によって限
定されるものではない。
明はその要旨を越えない限り、以下の実施例によって限
定されるものではない。
〔実施例１〕 （試薬の調製） １％（w/v）の粒径0.2μｍポリエチレンラテックスに
ヒトAFPを動物に免疫して得られる抗AFP特異抗体を緩衝
液中で十分攪拌しながら感作させ、遠心分離後上清を除
き、沈殿したラテックスを牛血清アルブミン緩衝溶液に
より、再度分散させ、0.2μｍ抗AFPラテックスとする。
同様の操作によって0.4μｍ抗AFPラテックスを調製し、
先に調製した0.2μｍ抗AFPラテックスと体積比1:1及び
1:2で十分に混合し、抗AFP混合ラテックス試薬とする。
ヒトAFPを動物に免疫して得られる抗AFP特異抗体を緩衝
液中で十分攪拌しながら感作させ、遠心分離後上清を除
き、沈殿したラテックスを牛血清アルブミン緩衝溶液に
より、再度分散させ、0.2μｍ抗AFPラテックスとする。
同様の操作によって0.4μｍ抗AFPラテックスを調製し、
先に調製した0.2μｍ抗AFPラテックスと体積比1:1及び
1:2で十分に混合し、抗AFP混合ラテックス試薬とする。
（検量線の作成） 上記抗AFP混合ラテックス試薬を既知の濃度の標準検
体（０、4.2ng/ml、8.3ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100n
g/ml、300ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml）を
“LPIA（登録商標）100"システム（三菱化成工業（現三
菱化学）株式会社製）で測定する。このシステムでは、
10μｌの検体サンプリングを行ない、50μｌの押出しBu
ffer及び200μｌの安定化液、40μｌのラテックス液を
プラスチックセル内で攪拌し、反応させ、950nmの波長
で抗原−抗体反応に基づくラテックス凝集反応による吸
光度変化を平均反応速度Ｖ、最大反応速度Vmaxとして算
出する。
体（０、4.2ng/ml、8.3ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100n
g/ml、300ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml）を
“LPIA（登録商標）100"システム（三菱化成工業（現三
菱化学）株式会社製）で測定する。このシステムでは、
10μｌの検体サンプリングを行ない、50μｌの押出しBu
ffer及び200μｌの安定化液、40μｌのラテックス液を
プラスチックセル内で攪拌し、反応させ、950nmの波長
で抗原−抗体反応に基づくラテックス凝集反応による吸
光度変化を平均反応速度Ｖ、最大反応速度Vmaxとして算
出する。
下記表１に0.2μｍ抗AFPラテックス、0.2と0.4μｍ抗
AFPラテックスを1:1及び1:2で混合した抗AFP混合ラテッ
クス及び0.4μｍ抗AFPラテックスを用いて得られる平均
反応速度Ｖの検量線データを示す。
AFPラテックスを1:1及び1:2で混合した抗AFP混合ラテッ
クス及び0.4μｍ抗AFPラテックスを用いて得られる平均
反応速度Ｖの検量線データを示す。
下記表２に前述の４種の抗AFPラテックスの最大反応
速度Vmaxの検量線データを示す。
速度Vmaxの検量線データを示す。
下記表３に４種の抗AFPラテックスにより、標準検体
を検体とみなし、測定したデータを示した。検量線は0.
2μｍの抗AFPラテックスについては300ng/ml以下を平均
反応速度Ｖで500ng/ml以上を最大反応速度Vmaxでプロッ
トし、0.2μｍと0.4μｍの1:1及び1:2抗AFP混合ラテッ
クスについては100ng/ml以下を平均反応速度Ｖ、300ng/
ml以上を最大反応速度Vmaxでプロットし、0.4μｍ抗AFP
ラテックスについては50ng/ml以下を平均反応速度Ｖ、1
00ng/ml以上を最大反応速度Vmaxでプロットし、それぞ
れ検量線とした。図１は各抗AFPラテックスの検量線を
図示した。
を検体とみなし、測定したデータを示した。検量線は0.
2μｍの抗AFPラテックスについては300ng/ml以下を平均
反応速度Ｖで500ng/ml以上を最大反応速度Vmaxでプロッ
トし、0.2μｍと0.4μｍの1:1及び1:2抗AFP混合ラテッ
クスについては100ng/ml以下を平均反応速度Ｖ、300ng/
ml以上を最大反応速度Vmaxでプロットし、0.4μｍ抗AFP
ラテックスについては50ng/ml以下を平均反応速度Ｖ、1
00ng/ml以上を最大反応速度Vmaxでプロットし、それぞ
れ検量線とした。図１は各抗AFPラテックスの検量線を
図示した。
〔実施例２〕 （試薬の調製） １％（w/v）の粒径0.3μｍポリスチレンラテックスにヒ
トフエリチンを動物に免疫して得られる抗フエリチン特
異抗体を緩衝液中で十分攪拌しながら感作させ、遠心分
離後上清を除き、沈殿したラテックスを牛血清アルブミ
ン緩衝溶液により、再度分散させ、0.3μｍ抗フエリチ
ンラテックスとする。同様の操作によって0.5μｍ抗フ
エリチンラテックスを調製し、先に調製した0.3μｍ抗
フエリチンラテックスと体積比1:3及び1:1で十分に混合
し、抗フエリチン混合ラテックス試薬とする。
トフエリチンを動物に免疫して得られる抗フエリチン特
異抗体を緩衝液中で十分攪拌しながら感作させ、遠心分
離後上清を除き、沈殿したラテックスを牛血清アルブミ
ン緩衝溶液により、再度分散させ、0.3μｍ抗フエリチ
ンラテックスとする。同様の操作によって0.5μｍ抗フ
エリチンラテックスを調製し、先に調製した0.3μｍ抗
フエリチンラテックスと体積比1:3及び1:1で十分に混合
し、抗フエリチン混合ラテックス試薬とする。
（検量線の作成） 上記、抗フエリチン混合ラテックス試薬を既知の濃度
の標準検体（0ng/ml、6.3ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、
50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、400ng/ml）を“LPIA
（登録商標）100"システム〔三菱化成工業（現三菱化
学）製〕で測定する。
の標準検体（0ng/ml、6.3ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、
50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、400ng/ml）を“LPIA
（登録商標）100"システム〔三菱化成工業（現三菱化
学）製〕で測定する。
表４に0.3μｍ及び0.5μｍの1:1抗Ａフエリチン混合
ラテックス及び0.5μｍ抗フエリチンラテックスの検量
線データを示す。検量線は100ng/ml以下では、平均反応
速度Ｖで、200ng/ml以上では最大反応速度Vmaxでプロッ
トした。
ラテックス及び0.5μｍ抗フエリチンラテックスの検量
線データを示す。検量線は100ng/ml以下では、平均反応
速度Ｖで、200ng/ml以上では最大反応速度Vmaxでプロッ
トした。
表５に0.3μｍ抗フエリチンラテックス、0.3μｍ及び
0.5μｍの3:1及び1:1抗フエリチン混合ラテックス及び
0.5μｍ抗フエリチンラテックスの低濃度標準検体の平
均反応速度Ｖの値を示した。
0.5μｍの3:1及び1:1抗フエリチン混合ラテックス及び
0.5μｍ抗フエリチンラテックスの低濃度標準検体の平
均反応速度Ｖの値を示した。
〔実施例３〕 実施例１と同様の方法で平均粒径0.2μｍと0.4μｍの
ラテックスを使用して、AFPの測定可能範囲（AFP濃度の
増加により反応速度Ｖの増加が判別可能な範囲）を調べ
た。
ラテックスを使用して、AFPの測定可能範囲（AFP濃度の
増加により反応速度Ｖの増加が判別可能な範囲）を調べ
た。
測定は、それぞれ、平均粒径0.2μｍのラテックス単
独の場合、平均粒径0.4μｍのラテックス単独の場合、
及び、平均粒径0.2μｍのラテックスと平均粒径0.4μｍ
のラテックスを混合して使用した場合（混合比1:1）に
ついて、測定波長940nm〔ラテックスの平均粒径の2.5倍
（750nm）以上の波長〕および比較例として測定波長650
nm〔ラテックスの平均粒径の2.5倍（750nm）以下の波
長〕で行った。
独の場合、平均粒径0.4μｍのラテックス単独の場合、
及び、平均粒径0.2μｍのラテックスと平均粒径0.4μｍ
のラテックスを混合して使用した場合（混合比1:1）に
ついて、測定波長940nm〔ラテックスの平均粒径の2.5倍
（750nm）以上の波長〕および比較例として測定波長650
nm〔ラテックスの平均粒径の2.5倍（750nm）以下の波
長〕で行った。
その結果を図２（測定波長940nm）および図３（測定
波長650nm）に示す。波長940nmで測定した場合、図２か
ら明らかなとおり、平均粒径0.2μｍのラテックスと平
均粒径0.4μｍのラテックスをそれぞれ単独で使用した
場合の測定可能範囲とそれらを混合して使用した場合の
測定可能範囲を比較すると、混合して使用した場合の測
定可能範囲が広く、その範囲は測定可能最低濃度の約1
0,000倍であった。
波長650nm）に示す。波長940nmで測定した場合、図２か
ら明らかなとおり、平均粒径0.2μｍのラテックスと平
均粒径0.4μｍのラテックスをそれぞれ単独で使用した
場合の測定可能範囲とそれらを混合して使用した場合の
測定可能範囲を比較すると、混合して使用した場合の測
定可能範囲が広く、その範囲は測定可能最低濃度の約1
0,000倍であった。
一方、波長650nmで測定した場合は、図３から明らか
なとおり、平均粒径0.2μｍのラテックスを単独で使用
した場合の測定可能範囲が、平均粒径0.2μｍのラテッ
クスと平均粒径0.4μｍのラテックスを混合して使用し
た場合の測定可能範囲よりも広く、その測定可能範囲
は、波長940nmで測定した場合（図２）の1/2であった。
なとおり、平均粒径0.2μｍのラテックスを単独で使用
した場合の測定可能範囲が、平均粒径0.2μｍのラテッ
クスと平均粒径0.4μｍのラテックスを混合して使用し
た場合の測定可能範囲よりも広く、その測定可能範囲
は、波長940nmで測定した場合（図２）の1/2であった。
（発明の効果） 本発明によれば、広い濃度範囲にわたって抗原抗体反
応の測定が可能となる。
応の測定が可能となる。
図１は、本発明において用いられる抗AFPラテックスを
用いる場合の最大反応速度の検量線を示す図である。 図２は、平均粒径0.2μｍのラテックスと、平均粒径0.4
μｍのラテックスを使用して、測定波長を940nmとした
場合のAFPの測定可能範囲を示す図である。図中、←→
は測定可能範囲を示す。 図３は、平均粒径0.2μｍのラテックスと、平均粒径0.4
μｍのラテックスを使用して、測定波長を650nmとした
場合のAFPの測定可能範囲を示す図である。図中、←→
は測定可能範囲を示す。
用いる場合の最大反応速度の検量線を示す図である。 図２は、平均粒径0.2μｍのラテックスと、平均粒径0.4
μｍのラテックスを使用して、測定波長を940nmとした
場合のAFPの測定可能範囲を示す図である。図中、←→
は測定可能範囲を示す。 図３は、平均粒径0.2μｍのラテックスと、平均粒径0.4
μｍのラテックスを使用して、測定波長を650nmとした
場合のAFPの測定可能範囲を示す図である。図中、←→
は測定可能範囲を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−151264（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−24015（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−109494（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】平均粒径の異なる２種類以上のラテックス
に抗体もしくは抗原を感作して混合した懸濁液又は平均
粒径の異なる２種類以上のラテックスを混合した後、抗
体または抗原を感作した懸濁液と、感作した抗体に対す
る抗原もしくは感作した抗原に対する抗体とを水溶媒中
で反応させ、光を照射し、その吸光度変化を測定して、
抗原−抗体反応を測定する方法において、平均粒径0.05
〜0.3μｍの範囲にあるラテックスと平均粒径0.3〜1.0
μｍの範囲にあるラテックスとを混合すること、及び、
混合したラテックスの平均粒径の少なくとも2.5倍であ
り、かつ、0.6〜2.4μｍの波長の光を照射することを特
徴とする抗原−抗体反応の測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61210913A JP2588174B2 (ja) | 1986-09-08 | 1986-09-08 | 抗原−抗体反応の測定法 |
| EP87402008A EP0263731A1 (en) | 1986-09-08 | 1987-09-08 | Method for measuring antigen-antibody reactions |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61210913A JP2588174B2 (ja) | 1986-09-08 | 1986-09-08 | 抗原−抗体反応の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6365369A JPS6365369A (ja) | 1988-03-23 |
| JP2588174B2 true JP2588174B2 (ja) | 1997-03-05 |
Family
ID=16597139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61210913A Expired - Lifetime JP2588174B2 (ja) | 1986-09-08 | 1986-09-08 | 抗原−抗体反応の測定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0263731A1 (ja) |
| JP (1) | JP2588174B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006025401A1 (ja) | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Denka Seiken Co., Ltd. | 抗原の測定方法及びそのための試薬 |
| EP2023141A2 (en) | 2001-07-02 | 2009-02-11 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Carrier particle latex for assay reagent and assay reagent |
| WO2009066731A1 (ja) | 2007-11-21 | 2009-05-28 | Arkray, Inc. | 測定試薬、それを用いた免疫比濁法および検体分析用具 |
| WO2018181549A1 (ja) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | デンカ株式会社 | 膜担体、並びにそれを用いた液体試料検査キット及びその製造方法 |
| KR20220159382A (ko) | 2020-03-30 | 2022-12-02 | 덴카 주식회사 | 라텍스 응집법에 의한 목적 물질의 측정 방법 및 그 시약 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5290707A (en) * | 1991-11-25 | 1994-03-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for detection of microorganisms |
| GB9326379D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Sinvent As | Method of assay |
| JP3652029B2 (ja) * | 1996-10-16 | 2005-05-25 | 積水化学工業株式会社 | 高感度免疫測定法 |
| EP0898169B1 (en) * | 1997-08-11 | 2002-02-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Microparticle enhanced light scattering assay and microparticle reagents therefor |
| EP1385001A4 (en) * | 2001-03-30 | 2007-07-25 | Mitsubishi Kagaku Iatron Inc | REAGENT AND METHOD FOR THE IMMUNE ANALYSIS OF ELASTASE 1 AND METHOD FOR DETECTING PANCREASCONDUCTIVE DISEASE |
| JP2004325416A (ja) * | 2003-04-28 | 2004-11-18 | Sekisui Chem Co Ltd | 測定試薬用担体粒子ラテックス及び測定試薬 |
| JP4241301B2 (ja) | 2003-09-30 | 2009-03-18 | 和光純薬工業株式会社 | 免疫学的測定用試薬 |
| ITMI20041800A1 (it) * | 2004-09-21 | 2004-12-21 | Univ Degli Studi Milano | Netodo di misurazione di interazioni molecolari con lls |
| JP4883162B2 (ja) | 2009-10-02 | 2012-02-22 | トヨタ自動車株式会社 | Ｃｏ又はｈｃ浄化用の排ガス浄化触媒 |
| CN113092790B (zh) * | 2021-04-02 | 2023-12-15 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2632478A1 (de) * | 1975-07-23 | 1977-02-24 | Coulter Electronics | Verfahren zur erfassung und trennung von antigenen und antikoerperchen im blut und in anderen proben |
| US4184849A (en) * | 1977-12-05 | 1980-01-22 | Technicon Instruments Corporation | Mixed agglutination |
| DE2918342A1 (de) * | 1979-05-07 | 1980-11-20 | Behringwerke Ag | Latex-reagenz |
| DE3322373C2 (de) * | 1983-05-19 | 1986-12-04 | Ioannis Dr. 3000 Hannover Tripatzis | Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern |
-
1986
- 1986-09-08 JP JP61210913A patent/JP2588174B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-09-08 EP EP87402008A patent/EP0263731A1/en not_active Withdrawn
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| WO2006025401A1 (ja) | 2004-08-31 | 2006-03-09 | Denka Seiken Co., Ltd. | 抗原の測定方法及びそのための試薬 |
| WO2009066731A1 (ja) | 2007-11-21 | 2009-05-28 | Arkray, Inc. | 測定試薬、それを用いた免疫比濁法および検体分析用具 |
| WO2018181549A1 (ja) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | デンカ株式会社 | 膜担体、並びにそれを用いた液体試料検査キット及びその製造方法 |
| KR20190127665A (ko) | 2017-03-28 | 2019-11-13 | 덴카 주식회사 | 막 담체와 이를 이용한 액체 시료 검사 키트 및 그 제조 방법 |
| US11162938B2 (en) | 2017-03-28 | 2021-11-02 | Denka Company Limited | Membrane carrier, kit for testing liquid sample using same, and manufacturing method thereof |
| KR20220159382A (ko) | 2020-03-30 | 2022-12-02 | 덴카 주식회사 | 라텍스 응집법에 의한 목적 물질의 측정 방법 및 그 시약 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6365369A (ja) | 1988-03-23 |
| EP0263731A1 (en) | 1988-04-13 |
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