CN115327137B - 一种人免疫球蛋白g4亚型化学发光免疫检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒。本发明的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和样本稀释液，其中，R1试剂包括生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体和第一缓冲液，R2试剂包括发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和第二缓冲液，R3试剂包括链霉亲和素磁微粒和第三缓冲液，样本稀释液为第四缓冲液。本发明针对人免疫球蛋白G4亚型蛋白设计了用于化学发光免疫检测的试剂盒，在保证高灵敏度和简便性的同时，有效降低血清样本中IgG1、IgG2和IgG3的干扰，提高了特异性和准确度，并且具有很好的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于化学发光免疫检测试剂盒技术领域，具体涉及一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒。
背景技术
IgG是血清中免疫球蛋白主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75%，其中40~50%分布于血清中，其余分布在组织中。人血清中的IgG主要为单体，正常人的IgG包括4个亚型，其IgG1占60~70%，IgG2占15~20%，IgG3占5~10%，IgG4占1~7%。
与人免疫球蛋白G4亚型蛋白（IgG4）相关的疾病被称为IgG4相关性疾病（IgG4-RD），是一种慢性、进行性炎症伴纤维化的疾病，可累及多个脏器。患者血清IgG4水平常升高，受累组织或器官中有IgG4阳性浆细胞浸润，病变部位出现硬化或纤维化，以及阻塞性静脉炎。本病好发于中老年男性。由于易于形成肿块性病变，常被误诊为恶性肿瘤。
目前定量检测人免疫球蛋白G4亚型蛋白的方法主要有酶联免疫吸附法和免疫散射比浊法。酶联免疫吸附法灵敏、特异，但需多次洗涤和孵育，操作繁琐，且定量测定结果不稳定。免疫散射比浊法具有精确、简便、可重复性强等优点，但脂血或溶血样本会干扰IgG亚类的检测，且灵敏度不高。化学发光法具有灵敏度高、简便、可重复性强的优点，但是目前关于人免疫球蛋白G4亚型蛋白的化学发光免疫检测试剂盒的报道很少，主要是因为化学发光试剂难以有效降低IgG1、IgG2和IgG3的干扰，以及化学发光试剂稳定性较差。因此，开发一款特异性强、灵敏度高且稳定性好的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒对于批量样本人免疫球蛋白G4亚型准确定量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、灵敏度高、准确度高且稳定性好的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和样本稀释液。
所述的R1试剂包括生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体和第一缓冲液，所述的第一缓冲液包括50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、0.1wt%~0.5wt%增稠剂、1wt%~5wt%糖类、0.1~0.5g/L阻断剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.3wt%~0.5wt%动物血清。
所述的R2试剂包括发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和第二缓冲液，所述的第二缓冲液包括50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、0.01~0.1g/L阻断剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.3wt%~0.5wt%动物血清。
所述的R3试剂包括链霉亲和素磁微粒和第三缓冲液，所述的第三缓冲液包括0.5~5mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.1wt%~0.5wt%表面活性剂、0.1wt%~0.5wt%增稠剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.05wt%~0.5wt%卡纳霉素、0.01~0.05g/L四环素。
所述的样本稀释液为第四缓冲液，所述的第四缓冲液包括50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.05wt%~0.5wt%卡纳霉素、0.01~0.05g/L四环素。
其中，所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液中的动物血清分别由胎牛血清、猪血清和马血清组成，所述的胎牛血清、猪血清和马血清的质量比为（2~5）：1：（0.1~0.5）。所述的第一缓冲液中的糖类由蔗糖和海藻糖组成，所述的蔗糖和海藻糖的质量比为（2~5）：1。
优选地，所述的胎牛血清、猪血清和马血清的质量比为（2.5~3.5）：1：（0.2~0.5）。
优选地，所述的蔗糖和海藻糖的质量比为（2.5~3.5）：1。
优选地，所述的第一缓冲液、所述的第二缓冲液、所述的第三缓冲液、所述的第四缓冲液分别独立地选自TRIS缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。
进一步优选地，所述的第一缓冲液和所述的第四缓冲液分别为TRIS缓冲液，所述的第二缓冲液为HEPES缓冲液，所述的第三缓冲液为PBS缓冲液。
优选地，所述的第一缓冲液的pH值为7.5~8.5。
优选地，所述的第二缓冲液的pH值为6.0~7.0。
优选地，所述的第三缓冲液的pH值为6.5~7.5。
优选地，所述的第四缓冲液的pH值为7.0~7.5。
优选地，所述的无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锌中的一种或多种。
优选地，所述的封闭剂为酪蛋白和/或牛血清白蛋白。
优选地，所述的表面活性剂选自吐温-20和/或曲拉通X-100。
优选地，所述的增稠剂为甲基纤维素。
优选地，所述的阻断剂为HBR-1和/或碱性磷酸酶突变蛋白（AP-Mutein）。
优选地，所述的防腐剂为ProClin 300、ProClin 950或叠氮钠中的一种或多种。
根据一些具体实施方式，所述的第一缓冲液和所述的第四缓冲液中的无机盐分别为氯化钠，所述的第二缓冲液中的无机盐为氯化钠、氯化镁和氯化锌的组合物，所述的第三缓冲液中的无机盐为氯化镁。
根据一些具体实施方式，所述的第一缓冲液和所述的第四缓冲液中的封闭剂分别为酪蛋白和牛血清白蛋白的组合物，所述的第二缓冲液中的封闭剂为酪蛋白，所述的第三缓冲液中的封闭剂为牛血清白蛋白。
根据一些具体实施方式，所述的第一缓冲液中的表面活性剂为吐温-20和曲拉通X-100的组合物，所述的第二缓冲液和所述的第三缓冲液中的表面活性剂为吐温-20。
根据一些具体实施方式，所述的第一缓冲液中的阻断剂为HBR-1，所述的第二缓冲液中的阻断剂为碱性磷酸酶突变蛋白。
根据一些具体实施方式，所述的第一缓冲液和所述的第三缓冲液中的防腐剂分别为ProClin 300，所述的第二缓冲液中的防腐剂为ProClin 950，所述的第四缓冲液中的防腐剂为叠氮钠。
优选地，所述的生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体在所述的R1试剂中的含量为0.15~1.0µg/mL。
优选地，所述的发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体在所述的R2试剂中的含量为0.05~0.12µg/mL。
优选地，所述的链霉亲和素标记的磁微粒占所述的R3试剂的总质量的0.2%~1%。
优选地，所述的生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体中生物素和抗人免疫球蛋白G4包被抗体的质量比为1：8~20。
优选地，所述的发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体中抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和发光标记物的质量比为1：1~6。
优选地，所述的发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体中的发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、碱性磷酸酶或三联吡啶钌。
优选地，所述的链霉亲和素磁微粒的粒径为0.8~1.5µm。
优选地，所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒还包括校准品，所述的校准品浓度分别为0μg/mL、200μg/mL、800μg/mL、2400μg/mL、6400μg/mL、16000μg/mL的免疫球蛋白G4的标准品。
进一步优选地，所述的校准品由样本稀释液对高纯度人免疫球蛋白G4亚型蛋白进行稀释得到。
优选地，所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液，所述的化学发光底物液为APS-5缓冲液。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明针对人免疫球蛋白G4亚型蛋白设计了用于化学发光免疫检测的R1试剂、R2试剂、R3试剂和样本稀释液，在保证高灵敏度和简便性的同时，有效降低血清样本中IgG1、IgG2和IgG3的干扰，提高了特异性和准确度，并且上述试剂和样本稀释液具有很好的稳定性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了提供一种能够准确定量人免疫球蛋白G4亚型蛋白的化学发光免疫检测试剂盒，发明人通过大量的研究和实验验证意外发现，通过调整优化第一缓冲液组分，尤其是动物血清及糖类，可对生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体的稳定性的提高以及对降低血清样本中的IgG1、IgG2和IgG3的交叉反应有积极作用。此外，对于血清样本中免疫球蛋白G4检测，使用特定配方的样本稀释液处理样本并结合其他试剂应用时，能够进一步降低血清样本中IgG1、IgG2和IgG3的干扰，提高线性及检测结果准确度。由此，开发了一款灵敏度高、特异性好、准确度高、重复性高、稳定性好的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒。本发明的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测仪器，完成人免疫球蛋白G4亚型定量检测。这种化学发光免疫分析试剂盒与仪器配套，缩短了临床检测所需的时间。
具体地，本发明的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和样本稀释液。
所述的R1试剂包括生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体和第一缓冲液，所述的第一缓冲液包括50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、1wt%~5wt%糖类、0.1~0.5g/L阻断剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.3wt%~0.5wt%动物血清。所述的R2试剂包括发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和第二缓冲液，所述的第二缓冲液包括50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、0.01~0.1g/L阻断剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.3wt%~0.5wt%动物血清。所述的R3试剂包括链霉亲和素磁微粒和第三缓冲液，所述的第三缓冲液包括0.5~5mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.05wt%~0.5wt%卡纳霉素、0.01~0.05g/L四环素。所述的样本稀释液为第四缓冲液，所述的第四缓冲液包括50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.05wt%~0.5wt%卡纳霉素、0.01~0.05g/L四环素。其中，所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液中的动物血清分别由胎牛血清、猪血清和马血清组成，所述的胎牛血清、猪血清和马血清的质量比为（2~5）：1：（0.1~0.5）。所述的第一缓冲液中的糖类由蔗糖和海藻糖组成，所述的蔗糖和海藻糖的质量比为（2~5）：1。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
以下实施例和对比例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。
以下实施例和对比例中，链霉亲和素磁微粒购自安捷伦科技有限公司(货号PL6727-1001)。抗人免疫球蛋白G4包被抗体购自北京爱博生生物技术有限公司(货号K06216M03D08C)。抗人免疫球蛋白G4捕获抗体购自北京爱博生生物技术有限公司，货号为(K06087M09G12C)。
实施例1
本实施例提供一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、样本稀释液以及校准品。
R1试剂包括生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体和第一缓冲液。
第一缓冲液包括如下组分：TRIS缓冲液（pH值为7.5）1L，NaCl 5.82g，酪蛋白0.5wt%，吐温-20 0.1wt%，甲基纤维素 0.2wt%，胎牛血清 0.3wt%，猪血清 0.1wt%，马血清0.02wt%，蔗糖 1.5wt%，海藻糖 0.5wt%，牛血清白蛋白（BSA） 0.2wt%，HBR-1 0.2mg/mL，曲拉通X-100 0.5wt%，ProClin 300 0.05wt%。
R1试剂的制备方法：
生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体的标记工艺：取440µL DMSO加入到2mg活性生物素瓶内，混匀，再取1mg待标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体于超滤管中，并加入适量体积的标记缓冲液定容至0.5mL，使终浓度为2mg/mL，混匀后，高速冷冻离心机离心，转速12000r/min，温度为2～8℃，时间10分钟，离心后在超滤管中加入6.7µL生物素溶液和473.3µL标记缓冲液，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30分钟，温育后离心，转速12000r/min，温度为2～8℃，时间10分钟。离心后在超滤管中加入500µL标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，转速12000r/min离心10分钟。此步骤重复操作3次，最后一次离心后在超滤管中加入250µL标记缓冲液并轻轻吹打混匀，转移到离心管内，再加入250µL保存液，即得到0.5ml浓度为2mg/mL生物素标记抗人免疫球蛋白G4包被抗体，2～8℃保存。本实施例中使用的生物素为NHS-PEG4。
根据第一缓冲液的组分配制第一缓冲液，然后将生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体与第一缓冲液混合得到R1试剂，灌封于试剂瓶中。本实施例中，生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体在R1试剂中的浓度为0.8μg/mL。
R2试剂包括发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和第二缓冲液。
第二缓冲液包括如下组分：HEPES缓冲液（pH值为6.5）1L，NaCl 8.76g，1M MgCl·6H2O 1mL，0.1M ZnCl2 1mL，酪蛋白 0.6wt%，胎牛血清 0.3wt%，猪血清 0.08wt%，马血清0.02wt%，碱性磷酸酶突变蛋白（AP-Mutein） 0.05mg/mL，吐温-20 0.5wt%，ProClin 9500.05wt%。
R2试剂的制备方法：
化学发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体标记工艺：将1mg抗人免疫球蛋白G4捕获抗体放入离心管中，加入碳酸缓冲溶液，终浓度为2mg/mL，充分混匀，混匀后加入三联吡啶钌的DMF溶液（发光标记物和所述的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体的质量比为1:3），高速冷冻离心机离心30s，转速12000r/min。将离心管用封口膜密封后放入气浴恒温振荡器(23℃)，混匀4h。再加入0.5mL 30％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(23℃)，混匀后，封闭2h。将封闭好的抗体用葡聚糖凝胶G250柱纯化，用PBS缓冲液洗脱，收集。将化学发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体溶液放置于2～8℃保存。
根据第二缓冲液的组分配制第二缓冲液，然后将发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体溶液与第二缓冲液混合得到R2试剂，灌封于试剂瓶中。本实施例中，发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体在R2试剂中的浓度为0.1µg/mL。
R3试剂包括链霉亲和素磁微粒和第三缓冲液。
第三缓冲液包括如下组分：PBS缓冲液（pH值为7.0）1L，1M MgCl·6H2O 1mL，甲基纤维素 0.5wt%，BSA 0.5wt%，吐温-20 0.1wt%，ProClin 300 0.05wt%，卡那霉素 0.1wt%，四环素 0.03g。
R3试剂的制备方法：
链霉亲和素磁微粒预处理：取浓度为100mg/mL的链霉亲和素磁微粒溶液1mL，加入10mL的TBST溶液充分混匀15分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，重复此过程清洗3次。加入10mL含吐温-20 0.05wt%、Proclin300 0.05wt%，pH值为6.5的MES缓冲液中，标定浓度为10mg/mL，2～8℃保存。本实施例中使用的链霉亲和素磁微粒的粒径是1μm。
根据第三缓冲液的组分配制第三缓冲液，然后将预处理的链霉亲和素磁微粒与第三缓冲液混合得到R3试剂。本实施例中，链霉亲和素磁颗粒占R3试剂总质量的1%。
样本稀释液为第四缓冲液，其包括如下组分：TRIS缓冲液（pH值为7.0）1L，NaCl6.98g，酪蛋白 0.5wt%，BSA 0.2wt%，叠氮钠 0.1wt%，卡那霉素0.1wt%，四环素 0.03g。按比例称取上述组分混合均匀，2～8℃保存。
校准品的制备：
采用样本稀释液配制人免疫球蛋白G4浓度为0μg/mL、200μg/mL、800μg/mL、2400μg/mL、6400μg/mL、16000μg/mL的人免疫球蛋白G4校准品，2～8℃保存。
对比例1
本对比例提供一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其基本同实施例1，区别在于R1试剂中动物血清为胎牛血清 0.5wt%和马血清 0.1wt%，不含猪血清；R2试剂中动物血清为胎牛血清 0.3wt%和马血清 0.3wt%，不含猪血清。
对比例2
本对比例提供一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其基本同实施例1，区别在于R1试剂和R2试剂中的动物血清分别为胎牛血清 0.3wt%、猪血清 0.3wt%、马血清 0.3wt%。
对比例3
本对比例提供一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其基本同实施例1，区别在于R1试剂中的区别蔗糖 0.5wt%和海藻糖 1.5wt%。
对比例4
本对比例提供一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其基本同实施例1，区别在于不含样本稀释液。
对实施例1和对比例1~4制备的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒进行性能测试，若无特殊说明，采用的测试方法均为本领域中的常规方法。
本发明的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒可以配合全自动化学发光免疫分析仪(i2900)进行检测，测定原理是双抗体夹心法，根据大量试验摸索及样本验证，将对血清样本测试方法总结如下：先用样本稀释液对血清样本及各个校准品进行稀释，具体是将5µL血清样本及各个校准品分别和195µL样本稀释液混合，震荡稀释后，从中取出5µL初步稀释液与195µL样本稀释液混合，震荡稀释后，再次从中取出5µL稀释液，然后依次加入60µL R1试剂和30µL R3试剂，反应8min后，进行磁分离并清洗未被结合的物质，再加入60µL R2试剂，再次反应8min后，进行磁分离并清洗未被结合的物质，最后加入发光底物液进行反应，记录相对光单位(RLU)，以校准品的RLU值为纵坐标，校准品的浓度（稀释前）为横坐标绘制标准曲线，将血清样本的RLU值代入对应的标准曲线计算得到血清样本的人免疫球蛋白G4含量。当然，本发明并不局限于i2900和上述样本测试方法，在实际应用中，可根据选择的仪器自行调整测试方法。
1、线性评价
将接近线性范围上限的人免疫球蛋白G4高值（16000μg/mL）血清样本和接近线性范围下限的人免疫球蛋白G4低值（16μg/mL）血清样本按一定比例混合得到理论浓度分别为16000μg/mL、4000μg/mL、1000μg/mL、250μg/mL、63μg/mL和16μg/mL的线性样本。分别采用实施例1及对比例1~4的试剂盒对每一浓度的线性样本分别重复检测3次得到测量浓度，计算测量浓度的平均值，将测量浓度的平均值与理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，结果如表1所示。按照上文记载的测试方法进行测试，其中对比例4的试剂盒不包括稀释步骤。
2、空白限评价：采用实施例1及对比例1~4的试剂盒分别对样本稀释液进行20次测定相对光（RLU）单位，取其平均值减去两倍的标准差后，带入对应的标准曲线计算得到空白限，结果如表2所示。按照上文记载的测试方法进行测试，对比例4的试剂盒不包括稀释步骤。
3、重复性评价：采用实施例1及对比例1~4的试剂盒分别对重复性低值(850μg/mL)血清样本和重复性高值(6500μg/mL)血清样本各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M、标准差SD以及CV值，结果如表3所示。按照上文记载的测试方法进行测试，其中对比例4的试剂盒不包括稀释步骤。
4、交叉干扰评价：实验样本：将高浓度交叉反应物IgG1、IgG2、IgG3的蛋白原液分别使用样本稀释液稀释至IgG1：40000μg/mL、IgG2：20000μg/mL、IgG3：10000μg/mL，对照样本为样本稀释液，每个实验样本和对照样本重复测试3次。结果如表4所示。按照上文记载的测试方法进行测试，其中对比例4的试剂盒不包括稀释步骤。
5、样本评价：采用新生牛血清对高浓度天然人免疫球蛋白G4亚型蛋白进行稀释得到20个不同浓度的实验样本，采用实施例1及对比例1~4的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒分别对实验样本进行人免疫球蛋白G4亚型的含量检测，结果表5所示。
6、稳定性评价：将实施例1及对比例1~4的试剂盒分别在2～8℃条件下贮存，分别在贮存3个月、6个月、9个月、12个月、15个月时采用以上评价方法对空白限、线性、重复性指标进行评价，并进行样本评价，结果如表6所示。
以上结果显示：
1、线性评价：实施例1和对比例1、2性能相近，均优于对比例3、4。
2、空白限评价：实施例1的空白限最低，与对比例4空白限相近，但实施例1的CV优于对比例4。
3、重复性评价：实施例1优于对比例1~4。
4、交叉干扰评价：免疫球蛋白亚型的交叉干扰在实施例1中可以被屏蔽掉，但在对比例2~4中均存在交叉干扰，尤其在对比例4中，样本未经过稀释液的稀释，所造成的干扰极大。
5、样本评价：实施例1的样本比对中，R2为0.99，高于对比例2~4，说明实施例1准确度更高。
6、稳定性评价：将试剂盒放在2~8℃保存，在3、6、9、12、15月分别进行性能验证，随着保存时间加长，实施例1和对比例4的各项性能基本无明显变化；对比例2~4的性能随着时间的延长，呈现下降趋势；在对比例3中，重复性低、高值的偏差在第15个月已下降10%。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：其包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和样本稀释液，
所述的R1试剂包括生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体和第一缓冲液，所述的第一缓冲液中含有50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、0.1wt%~0.5wt%增稠剂、1wt%~5wt%糖类、0.1~0.5g/L阻断剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.3wt%~0.5wt%动物血清，
所述的R2试剂包括发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和第二缓冲液，所述的第二缓冲液中含有50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.5wt%~1wt%表面活性剂、0.01~0.1g/L阻断剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.3wt%~0.5wt%动物血清，
所述的R3试剂包括链霉亲和素磁微粒和第三缓冲液，所述的第三缓冲液中含有0.5~5mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.1wt%~0.5wt%表面活性剂、0.1wt%~0.5wt%增稠剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.05wt%~0.5wt%卡纳霉素、0.01~0.05g/L四环素，
所述的样本稀释液为第四缓冲液，所述的第四缓冲液中含有50~500mmol/L无机盐、0.5wt%~1wt%封闭剂、0.01wt%~0.1wt%防腐剂、0.05wt%~0.5wt%卡纳霉素、0.01~0.05g/L四环素，
其中，所述的第一缓冲液和所述的第二缓冲液中的动物血清分别由胎牛血清、猪血清和马血清组成，所述的胎牛血清、猪血清和马血清的质量比为（2~5）：1：（0.1~0.5），
所述的第一缓冲液中的糖类由蔗糖和海藻糖组成，所述的蔗糖和海藻糖的质量比为（2~5）：1。
2.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的胎牛血清、猪血清和马血清的质量比为（2.5~3.5）：1：（0.2~0.5），和/或，所述的蔗糖和海藻糖的质量比为（2.5~3.5）：1。
3.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的第一缓冲液的pH值为7.5~8.5；和/或，所述的第二缓冲液的pH值为6.0~7.0；和/或，所述的第三缓冲液的pH值为6.5~7.5；和/或，所述的第四缓冲液的pH值为7.0~7.5。
4.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的无机盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锌中的一种或多种；
和/或，所述的封闭剂为酪蛋白和/或牛血清白蛋白；
和/或，所述的表面活性剂选自吐温-20和/或曲拉通X-100；
和/或，所述的增稠剂为甲基纤维素；
和/或，所述的阻断剂为HBR-1和/或碱性磷酸酶突变蛋白；
和/或，所述的防腐剂为ProClin 300、ProClin 950或叠氮钠中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的第一缓冲液和所述的第四缓冲液中的无机盐分别为氯化钠，所述的第二缓冲液中的无机盐为氯化钠、氯化镁和氯化锌的组合物，所述的第三缓冲液中的无机盐为氯化镁；
和/或，所述的第一缓冲液和所述的第四缓冲液中的封闭剂分别为酪蛋白和牛血清白蛋白的组合物，所述的第二缓冲液中的封闭剂为酪蛋白，所述的第三缓冲液中的封闭剂为牛血清白蛋白；
和/或，所述的第一缓冲液中的表面活性剂为吐温-20和曲拉通X-100的组合物，所述的第二缓冲液和所述的第三缓冲液中的表面活性剂为吐温-20；
和/或，所述的第一缓冲液中的阻断剂为HBR-1，所述的第二缓冲液中的阻断剂为碱性磷酸酶突变蛋白；
和/或，所述的第一缓冲液和所述的第三缓冲液中的防腐剂分别为ProClin 300，所述的第二缓冲液中的防腐剂为ProClin 950，所述的第四缓冲液中的防腐剂为叠氮钠。
6.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体在所述的R1试剂中的含量为0.15~1.0µg/mL；
和/或，所述的发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体在所述的R2试剂中的含量为0.05~0.12µg/mL；
和/或，所述的链霉亲和素标记的磁微粒占所述的R3试剂的总质量的0.2%~1%。
7.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的生物素标记的抗人免疫球蛋白G4包被抗体中生物素和抗人免疫球蛋白G4包被抗体的质量比为1：8~20；
和/或，所述的发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体中抗人免疫球蛋白G4捕获抗体和发光标记物的质量比为1：1~6；
和/或，所述的发光标记物标记的抗人免疫球蛋白G4捕获抗体中的发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、碱性磷酸酶或三联吡啶钌；
和/或，所述的链霉亲和素磁微粒的粒径为0.8~1.5µm。
8.根据权利要求1所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒还包括校准品，所述的校准品包括浓度为0μg/mL、200μg/mL、800μg/mL、2400μg/mL、6400μg/mL、16000μg/mL的免疫球蛋白G4标准品；和/或，所述的人免疫球蛋白G4亚型化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液，所述的化学发光底物液为APS-5缓冲液。
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