CN104237525A

CN104237525A - 一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用

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Publication number: CN104237525A
Application number: CN201310253612.7A
Authority: CN
Inventors: 金鑫; 曾滨
Original assignee: BEIJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd
Current assignee: BEIJING MOKOBIO LIFE SCIENCE CO., LTD.
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN104237525B

Abstract

本发明公开了一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，属于疾病的诊断和检测技术领域。本发明一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了PCT单克隆抗体以及PCT多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。使用本发明的方法分别对PCT单克隆抗体和PCT多克隆抗体进行标记后，得到的大粒径胶乳可以提高检测灵敏度，小粒径胶乳可以拓宽线性范围，因此，本发明的复合胶乳制剂既可以提高检测灵敏度，又可拓宽检测线性范围，对降钙素原的检测来说具有检测快速、敏感度高、特异性强和准确性好等优点。

Description

一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明公开了一种胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，特别涉及一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，本发明属于疾病的诊断或检测技术领域。

背景技术

降钙素原（PCT）是无激素活性的降钙素前肽物质，由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白。PCT的半衰期为25-30小时，在体外稳定性很好。

PCT来自定位于第11号染色体上（11P15，4）的单拷贝基因（与降钙素基因相关肽为同一基因）。该基因由2800个碱基对组成，含6个外显子和5个内含子，基因全长约7.6Kb。转录后经特定剪接产生PCTmRNA，再翻译成降钙素原前体（Pre-PCT），在高尔基复合体及分泌囊中，经一系列水解酶作用最终形成PCT氨基酸多肽（aminoPCT），降钙素（CT）及羧基端21个氨基多肽（CT：CCP-1）。

正常条件下人血清PCT含量极低，约2.5pg/ml（运用高效液相色谱分析），而成熟CT含量约6.3pg/ml。髓质甲状腺肿瘤或其他神经内分泌肿瘤患者血清PCT及其组分均增高，组分相对含量也发生变化。在一些非甲状腺损伤如慢性肾衰、吸入性烧伤、急性细菌感染、中风、败血症等患者血清PCT及其组分也均增高，有些甚至成倍的上升，而CT略微升高，说明除甲状腺髓质细胞分泌贮存PCT外，仍有其他细胞具有这些功能。

PCT选择性地对***性细菌感染、真菌感染及寄生虫感染有反应，而对无菌性炎症和病毒感染无反应或仅有轻度反应。许多学者研究发现，全身性细菌、真菌和寄生虫感染时，PCT水平异常增高，增高的程度与感染的严重程度及预后相关，在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。PCT水平的监测，对于严重威胁生命的感染性疾病过程和跟踪治疗方案是很有用的，PCT浓度的升高标志着炎症反应正在进行中，使用足够的抗生素、炎症灶清除术治疗等，PCT值下降，证明治疗方案正确，预后良好，反之改变治疗方案。

PCT为所有不知病因的炎症性疾病的鉴别诊断提供帮助与支持，如细菌性与毒素性的急性成人呼吸窘迫综合症（ARDS）的鉴别；胆源性与毒素性胰腺炎的鉴别；细菌性与病毒性脑膜炎的鉴别；微生物诱导的发热与非细菌性发热的鉴别，特别是发热待查（FOU）的诊断，病毒感染或自身免疫失调与免疫抑制条件下的急性细菌感染的鉴别，发热的病因的鉴别，如在肿瘤患者中被肿瘤溶解物或化疗诱导与细菌、真菌或其他感染病因区别，早期诊断新生儿和婴儿全身性细菌感染与败血症引起的急性发热；术后常规，包括术后感染预警及用药监测，术后切除感染灶（如腹膜炎、软组织感染）后的治疗指导，监测腹膜炎、吻合口漏和无典型腹部症状的疾病过程；器官移植后的监测，移植前排除急性细菌或其他感染，鉴别急性器官排斥、急性病毒、细菌与真菌感染；长期在ICU的患者及长期机械通气患者的监测，监测疾病过程及指导治疗；监测高危患者，早期获得有关并发症和内环境衰退的信息。

许多临床研究证明，PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息。随着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，PCT作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用。

目前，检测PCT较特异与敏感的分析方法有：双抗夹心免疫化学发光法（双抗夹心法）和放射免疫分析法（RIA）。

双抗夹心法运用双单克隆抗体，其一作为捕获抗体直接结合PCT96-106氨基酸残基即未成熟CT：CCP-1部分，另一作为示踪抗体直接结合PCT70-76氨基酸残基，即未成熟CT分子，人工合成的PCT作为标准。该方法比较特异无交叉反应，其检测最低为10pg·ml-1l，标准曲线线性范围为10-60pg·ml-1。批内、批间变异系数分别为7℅和8℅。该法已有商品试剂，所需时间较短，易自动化，但该法不能检测到正常人血清中PCT。

RIA使用一种对人工合成的aminoPCT特异的多克隆抗体RIB7。RIB7直接作用PCT的aminoPCT部分，故RIA既能检测游离的PCT，又能检测结合型的PCT，也可检测降钙素基因相关前体（Pro-CGRP），此法可信的敏感度为4pg·ml-1。线性范围10-77pg·ml-1，50℅的结合游离比为140pg·ml-1，该法能检测正常人血清PCT，故较双抗夹心法敏感，另一优点是RIA与患者病程呈现正相关（r=0.47，p=0.071）。但是RIA的缺点是所需时间较长。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提出了一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和应用，本发明所建立的用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理可实现对降钙素原快速且准确的检测。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：

本发明公开了一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了PCT单克隆抗体以及PCT多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。

在本发明中，优选的，偶联了PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为76nm，偶联了PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径的187nm。

在本发明中，优选的，所述的稀释液为含有2M NaCl，2％（w/w）PEG20000，0.5%（w/w）BSA，0.1%（w/w）proclin-300的0.05M Tris-HCL缓冲液，pH=8.4。

在本发明中，优选的，所述的胶乳制剂是按照以下方法制备得到的：

（1）羧基化的聚苯乙烯胶乳活化

10mg/ml的羧基化的聚苯乙烯胶乳1ml中加入50mM，PH6.1MES溶解的1mgEDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和10mgNHS（N-羟基琥珀酰亚胺）混匀活化60分钟，离心8000rpm弃去上清，沉淀用PH7.4的50mM PBS重悬；按照上述方法分别制备得到了粒径为76nm和187nm活化后的羧基化的聚苯乙烯胶乳；

（2）偶联了PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

将1mg PCT单克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为76nm胶乳溶液中，室温混匀2-4小时，2-8℃8000rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有5mg BSA的50mM PBS，室温混匀1-2小时；2-8℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混匀30min；2-8℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；

（3）偶联了PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

将0.5mg PCT多克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为187nm的胶乳溶液中，室温混匀2－4小时，2-8℃8000rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有2.5mgBSA的50mM PBS，室温混匀1-2小时；2-8℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混匀30min；2-8℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；

（4）将两种胶乳溶液进行混合。

在本发明中，优选的，步骤（4）中，是将两种粒径的胶乳试剂进行体积比1：1混合，充分混匀后备用。

在本发明中，优选的，所述的缓冲液为含有1%（w/w）BSA，0.05％（v/v）吐温，0.1%（w/w）海藻糖、0.1g/L羧甲基纤维素钠，0.1%（w/w）NaN3的0.05M Tris-HCl缓冲液，pH=7.4。

本发明在胶乳试剂中加入羧甲基纤维素钠，增加了胶乳分散性，加入海藻糖，增加胶乳的蛋白稳定性。

在本发明中，优选的，所述的空白液为0.05M PBS磷酸缓冲液。

在本发明中，优选的，所述的校准品包括降钙素原浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品。

在本发明中，优选的，所述的质控品中降钙素原的浓度为0.21-0.29μg/L。

更进一步的，本发明提出了所述的试剂盒在制备检测降钙素原试剂中的应用。

本发明试剂盒的使用方法：

采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理。样品中的PCT与标记了PCT抗体的乳胶颗粒发生特异性的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸光度的变化。此吸光度的变化与样品中的PCT浓度呈正比。用已知浓度的PCT校准品制作工作曲线，从该曲线上即可计算出样品中的PCT含量。

附图说明

图1为使用本发明的校准品制备得到的标准曲线。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及主要材料及试剂的购买来源：

PCT抗原、抗体均购自杭州启泰生物；

EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）、proclin-300购自SIMGA；

聚苯乙烯胶乳购自美国Bangs；

其他的无机盐试剂及PEG20000，羧甲基纤维素钠等均购自国药试剂。

实施例1本发明的一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备

1、试剂配置

1.1、稀释液R1配制

配方：0.05M Tris-HCl缓冲液，含有2M NaCl，2％（w/w）PEG20000，5%（w/w）BSA，0.1%（w/w）proclin-300，pH=8.4

1.2、胶乳试剂R2的配制

（1）羧基化的聚苯乙烯胶乳活化

10mg/ml的羧基化的聚苯乙烯胶乳1ml中加入50mM，PH6.1MES溶解的1mgEDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和10mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）混匀活化60分钟，离心8000rpm弃去上清，并用50mM PBS重悬；按照上述方法分别制备得到了粒径为76nm和187nm活化后的羧基化的聚苯乙烯胶乳；

（2）偶联了PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

将1mg PCT单克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为76nm胶乳溶液中，室温混匀4小时，4℃8000rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有5mg BSA的50mM PBS，室温混匀2小时；4℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混匀30min；4℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；

（3）偶联了PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

将0.5mg PCT多克隆抗体加入2ml浓度为10mg/ml的粒径为187nm的胶乳溶液中，室温混匀4小时，4℃8000rpm离心15min，收集上清液备用，加入含有2.5mgBSA的50mM PBS，室温混匀2小时；4℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀中加入5ml50mM的甘氨酸，充分混匀30min；4℃8000rpm离心15min，弃掉上清液，沉淀使用5ml Tris-HCl缓冲液复融胶乳；

所述的缓冲液为含有1%（w/w）BSA，0.05％（v/v）吐温，0.1%（w/w）海藻糖、0.1g/L羧甲基纤维素钠，0.1%（w/w）NaN3的0.05M Tris-HCL缓冲液，pH=7.4。

（4）将两种粒径的胶乳试剂进行体积比1：1混合，充分混匀后备用。

1.3、标准品稀释液的配制

0.05M PBS缓冲液

1.4、标准品的配制

以进口的罗氏公司降钙素原标准品为基准，使用混合后的胶乳试剂连续测试20次后取平均值，然后使用标准品稀释液稀释人降钙素原重组蛋白（购自杭州启泰生物）与罗氏公司标准品一致。

1.5、校准品及质控品配制

取大小合适的容器7个，使用标准稀释液稀释含有人降钙素原重组蛋白的标准品配制浓度点依次为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品各点，以及人降钙素原重组蛋白浓度为0.21-0.29μg/L的质控品，各浓度点要使依次加入的原料浓溶液混匀。

质控品的目的：在校准完成以后，首先测试质控品，其浓度应在标示的范围之内，如超出则认为试剂盒定标不成功或者试剂盒失效。

2、确定稀释倍数

取抗体标记剩余上清液体分别用OD260和OD280测量其吸光度值，利用测量结果并根据一下公式计算剩余上清液中抗体的浓度和标记效率；最后根据标记抗体量确定稀释倍数。

抗体浓度=1.45*A280-0.74*A260

标记抗体量＝标记总蛋白量-上清中蛋白量

标记效率=（标记总蛋白量-上清中蛋白量）/标记总蛋白量*100%

通过测量计算出单克隆抗体标记量为0.886mg，故标记效率为88.6%；

通过测量计算出多克隆抗体标记量为0.459mg，故标记效率为91.8%。

3、胶乳颗粒稀释

按照抗体过量原则，根据已定所需标记抗体浓度用缓冲液对标记的抗体进行稀释。对浓缩胶乳颗粒进行1：8、1：9、1：10三个比例进行稀释，分别测量配置完成的校准品，以线性最好且线性范围最大的稀释比例为最佳，通过检测选择的为1：10的比例进行稀释。

4、分装

将检测合格的胶乳微粒工作液进行分装，贴上标签后，置于2～8℃保存。经检验合格后，将配制好的校准品和质控品分装到1ml塑料瓶中，1.0ml/瓶。本发明试剂盒的主要组成成份如表1所示：

表1 本发明试剂盒的主要组成成份

组成	装量	主要成分
			稀释液R1	25mL/瓶	TRIS缓冲液
胶乳试剂R2	5mL/瓶	抗人PCT抗体的乳胶溶液
			空白液	1mL/瓶	0.05M PBS缓冲液
校准品	1mL/瓶*6	降钙素原（PCT）抗原原料
			质控品	1mL/瓶	降钙素原（PCT）抗原原料
说明书	1份

储存条件及有效期：试剂盒应在2-8℃下干燥保存，贮存时避免重压并应防潮、避光、避热；有效期：12个月。

5、对本发明试剂盒的检测灵敏度和线性范围的测定

分别使用本发明的复合胶乳试剂和单一粒径的胶乳试剂对20个样本中的降钙素原浓度进行了测定，其结果如下2所示：

表2

从表2数据可以看出，本发明的复合胶乳制剂既可以提高检测灵敏度，又可拓宽检测线性范围，可实现对降钙素原快速准确的检测。

实施例2本发明所述的试剂盒在制备检测降钙素原试剂中的应用

1、本发明试剂盒的使用方法：

采用免疫比浊法，以乳胶增强免疫比浊法为测定原理。样品中的PCT与标记了PCT抗体的乳胶颗粒发生特异性的抗原抗体反应，形成免疫复合物，从而引起吸光度的变化，此吸光度的变化与样品中的PCT浓度呈正比。用已知浓度的PCT标准品制作工作曲线，从该曲线上即可计算出样品中的PCT含量，本发明的校准品制备得到的标准曲线如图1所示，在校准完成以后，首先测试质控品，其浓度在标示的范围（0.21-0.29μg/L）之内，试剂盒有效。

2、适用仪器：东芝（TBA-40FR）、迪瑞（CS-T300）、劳拉(FAITH-1000)、奥林巴斯(AU-1000)、迈瑞(BS-200)、上海合意CB178血液分析仪等生化分析仪。

3、样本要求：病人标本无需特殊处理，采用常规医用技术收集全血标本，离心分离后吸取血清用于检测。待测血清如在24小时之内使用，可于2～8℃保存，若需长期存放应保存在-20℃以下，并避免反复冻融。请不要使用严重溶血、脂血或黄疸标本。

4、检验方法：

4.1.试剂配置：试剂开瓶即用，缓冲液及乳液试剂在测定前要充分混匀；

4.2.试验条件：

血清标本：5ul

稀释液R1：160ul；胶乳试剂R2：40ul；主波长：570nm；副波长：800nm；反应温度：37℃

方法：先加入R1试剂160ul，再加入血清样本5ul，37℃反应5分钟后加入R2试剂40ul读取OD，反应5分钟后在主波长570nm，副波长800nm下读取数据。

4.3.结果计算：以人降钙素原重组蛋白浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品做标准曲线，样品中的抗原浓度通过标准曲线读出。

5、对典型病例进行诊断

根据临床试验结果，结合文献研究，本发明试剂盒采用以下的诊断指标，本评价以1-10X作为评价细菌感染/脓毒症程度：

PCT浓度<0.05ug/L，为非重症患者，不建议使用抗生素，严重程度为1X;

0.05ug/L<PCT浓度<0.5ug/L，可能为局部细菌感染，发展成为全身感染（脓毒症）的风险很低，严重程度为2-4X；

0.5ug/L<PCT<2ug/L，很可能为全身感染（脓毒症），发展成为严重脓毒症的风险中等，严重程度为5-6X；

2ug/L<PCT<10ug/L几乎可以确认为全身感染（脓毒症）发展成为重度全身感染的风险很高，严重程度为8-9X；

PCT>10ug/L重要的全身炎症应答几乎无一例外的是严重脓毒症或脓毒性休克，严重程度为10X；

根据上述诊断指标对以下典型病例进行了判定，其结果如表3-表6所示：

表3病例1

表4病例2

表5病例3

表6病例4

Claims

1.一种用于测定降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括稀释液、胶乳制剂、空白液、校准品和质控品；其中所述的胶乳制剂中含有分别偶联了PCT单克隆抗体以及PCT多克隆抗体的不同粒径大小的羧基化的聚苯乙烯胶乳。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，偶联了PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为76nm，偶联了PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的粒径为187nm。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的稀释液为含有2M NaCl，2％（w/w）PEG20000，0.5%（w/w）BSA，0.1%（w/w）proclin-300的0.05M Tris-HCl缓冲液，pH=8.4。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的胶乳制剂是按照以下方法制备得到的：

（1）羧基化的聚苯乙烯胶乳活化

（2）偶联了PCT单克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

（3）偶联了PCT多克隆抗体的羧基化的聚苯乙烯胶乳的制备

（4）将两种胶乳溶液进行混合。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤（4）中，是将两种粒径的胶乳试剂进行体积比1：1混合，充分混匀后备用。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤（2）或步骤（3）中所述的缓冲液为含有1%（w/w）BSA，0.05％（v/v）吐温，0.1%（w/w）海藻糖、0.1g/L羧甲基纤维素钠，0.1%（w/w）NaN3的0.05M Tris-HCl缓冲液，pH=7.4。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的空白液为0.05M PBS磷酸缓冲液。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的校准品包括降钙素原浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、30μg/L的校准品。

9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的质控品中降钙素原的浓度为0.21-0.29μg/L。

10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备检测降钙素原试剂中的应用。