CN107356743B - 一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒，其特征在于，试剂盒包括包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒、酶标记的肌红蛋白抗体、肌红蛋白校准品、化学发光底物，所述纳米磁微粒的粒径为20～40nm，所述酶为辣根过氧化物酶。本发明提供的肌红蛋白测定试剂盒检测简单而快速、抗干扰能力强，同时具有检测结果准确性和稳定性以及灵敏度高等优点。

Description

一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体地，涉及一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白。分子量为16700，由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和一个血红素辅基构成，呈紧密球形。
由于肌红蛋白分子量小，当肌细胞受损时，肌红蛋白会释放至循环***中，1～2小时升高，12小时达到峰值，24小时后逐渐下降，是早期诊断急性心肌梗塞等疾病的重要参考指标。
目前肌红蛋白的免疫检测方法主要有胶体金免疫层析法、酶联免疫测定法和化学发光免疫测定法等。胶体金免疫层析法具备操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需要特殊设备等优点，但由于灵敏度不高，难以实现定量等缺点限制了这种方法的使用。酶联免疫测定法由于具备操作简单，试剂有效期长，无污染、高于胶体金的敏感性、特异性好、结果可用仪器测定等特点，但由于敏感性相对较低，所用标记酶与底物可定量测定范围窄及仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应用。
化学发光免疫测定法起步于80年代初，快速发展应用于90年代，为当今最为敏感的微量免疫测定法。主要特点是高敏感性、可测定浓度范围宽、样品无需稀释即可检测、试剂有效期长、操作简单、检测自动化程度高、数据自动生成处理能力强、测定仪器兼容性好、无环境污染等，因而得到了迅速发展与应用。但是检测灵敏度、测值准确度、稳定性、抗干扰能力等方法仍需进一步加强。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的化学发光免疫测定法仍然存在检测灵敏度、准确度、稳定性、抗干扰能力等方面仍然存在问题的缺陷，提供一种新的肌红蛋白测定试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒，其中，试剂盒包括包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒、酶标记的肌红蛋白抗体、肌红蛋白校准品、化学发光底物、缓冲溶液，所述纳米磁微粒的粒径为20～40nm，所述酶为辣根过氧化物酶。
肌红蛋白校准品可以通过市售获得，也可以是自行配制；其中包含已知浓度的肌红蛋白。标准品目的在于绘制一条标准曲线。因此，任何可以覆盖检测范围的校准品浓度都可以使用。肌红蛋白的浓度例如可以为0、10、50、100、300、800、1500、2000ng/ml等的人肌红蛋白。
在本发明中，优选情况下，包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒的制备方法包括：将纳米磁微粒与活化剂在缓冲溶液中接触，然后与肌红蛋白抗体偶联得到包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒，所述活化剂为碳二亚胺。
在本发明中，优选情况下，包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒的制备方法包括：
1)将纳米磁微粒用MES缓冲液分散，使纳米磁微粒的浓度为10～30mg/mL；
2)将碳二亚胺加入至步骤1)的溶液中，搅拌加入肌红蛋白抗体，室温下搅拌过夜；
3)将纳米磁微粒与反应体系分离后用MES缓冲液分散，加入1％BSA封闭液，室温封闭反应2～4小时，将纳米磁微粒分离；
4)将步骤3)分离的纳米磁微粒用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散，使纳米磁微粒的浓度为5～20mg/mL，得到包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒。
在本发明中，优选情况下，纳米磁微粒的制备方法包括以下步骤：
1)将纳米Fe2O3粉体分散于体积分数为50％的乙醇水溶液中，机械搅拌20～30min，沉淀，分离，固相水洗，加入蒸馏水，调节pH至5.5～6，加入油酸，50～70℃机械搅拌1～1.5小时，冷却至室温，磁分离，无水乙醇、去离子水反复洗涤除去游离的油酸，干燥得到改性的纳米Fe2O3磁性粉体。
2)将改性的Fe2O3磁性纳米粉与聚苯乙烯-聚丙烯酸加入到四氢呋喃中，机械搅拌的条件下缓慢滴加四氢呋喃1～3倍体积的水，搅拌反应2～3小时，静置，过滤，石油醚洗涤，干燥得纳米磁微粒。
在本发明中，所述纳米Fe2O3粉体以及聚苯乙烯-聚丙烯酸可以参照本领域的方法制备，例如《聚苯乙烯-聚丙烯酸嵌段共聚物及磁性纳米复合材料的制备》(肖成龙，2010年山东轻工业学院硕士学位论文)。
在本发明中，优选情况下，所述酶标记的肌红蛋白抗体的制备方法包括步骤如下：
1)将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中；
2)向所述步骤1)得到的溶液中加入0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液，并将其装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；
3)向所述步骤2)得到的透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为7.5～8，加入肌红蛋白抗体，室温下搅拌反应8～10小时，然后加入NaBH4溶液，混匀，静置反应，混合液转入透析袋中于PBS缓冲液中搅拌过夜；
7)取出透析袋中的液体，加入饱和硫酸铵，离心，将沉淀物溶于PBS缓冲液中并装入透析袋中透析取上清液即为酶标记的肌红蛋白抗体。
在本发明中，优选情况下，所述化学发光底物由化学发光液A液和B液组成，A液为含有0.7g/L的鲁米诺和0.165g/L的对碘酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.6；B液为0.675g/L过氧化脲。
本发明提供的肌红蛋白测定试剂盒使用方便，例如使用测试方法可以为：
(1)取10μL待检测样本于反应杯中，后加入140μL辣根过氧化物酶标记癌胚抗原单克隆抗体，充分混匀，并于37℃温育10min，同时准备校准样板和空白样本；
(2)向反应体系中加入50μL纳米磁微粒试剂，充分混匀，并于37℃温育10min，后清洗分离磁珠；向纳米磁微粒中加入100μL发光底物A液和B液的混合溶液，反应并测定各管的光强度；
(3)根据校准品的浓度与光强度的关系绘制标准工作曲线，样本光强度在标准工作曲线上相对应的浓度值即为待测样品的测定浓度。
与现有技术相比，本发明的肌红蛋白测定试剂盒具有以下优点：
1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、抗干扰能力强。
2.本发明试剂盒中的对纳米磁微粒进行了改性处理，抗体结合力强，不易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，提升了检测结果的准确性和稳定性；并且，改性的纳米磁微粒，不易发生团聚，灵敏度大大提高。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是对本发明的保护范围的进一步限定。
实施例1
一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒，试剂盒包括包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒、酶标记的肌红蛋白抗体、肌红蛋白校准品、化学发光底物、缓冲溶液，所述酶为辣根过氧化物酶，所述化学发光底物由化学发光液A液和B液组成，A液为含有0.7g/L的鲁米诺和0.165g/L的对碘酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.6；B液为0.675g/L过氧化脲。
其中，纳米磁微粒的制备：
1)将10g纳米Fe2O3粉体分散于100ml体积分数为50％的乙醇水溶液中，机械搅拌20～30min，沉淀，分离，固相水洗，加入蒸馏水，调节pH至5.5～6，加入6g油酸，65℃机械搅拌1小时，冷却至室温，磁分离，无水乙醇、去离子水反复洗涤除去游离的油酸，干燥得到改性的纳米Fe2O3磁性粉体；
2)将2g改性的Fe2O3磁性纳米粉与4g聚苯乙烯-聚丙烯酸加入到15ml四氢呋喃中，机械搅拌的条件下缓慢滴加40ml水，搅拌反应2～3小时，静置，过滤，石油醚洗涤，干燥得纳米磁微粒，平均粒径为40nm。
包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒的制备方法包括：
1)将30mg纳米磁微粒用MES缓冲液分散，使纳米磁微粒的浓度为30mg/mL；
2)将碳二亚胺(0.8mg)加入至步骤1)的溶液中，搅拌加入500μL肌红蛋白抗体(2mg/mL水溶液)，室温下搅拌过夜；
3)将纳米磁微粒与反应体系分离后用MES缓冲液分散，加入1％BSA封闭液，室温封闭反应2～4小时，将纳米磁微粒分离；
4)将步骤3)分离的纳米磁微粒用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散，使纳米磁微粒的浓度为18mg/mL，得到包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒。
所述酶标记的肌红蛋白抗体的制备方法包括步骤如下：
1)将10mg辣根过氧化物酶溶解于2ml蒸馏水中；
2)向步骤1)得到的溶液中加入0.5mL NaIO4溶液(0.1M)，室温下避光搅拌30分钟，得到混合溶液，并将其装入透析袋中用醋酸钠缓冲液(pH为4.4)透析过夜；
3)向步骤2)得到的透析液中加入碳酸盐缓冲液(pH为9.5)至pH值为7.5～8，加入20mg肌红蛋白抗体，室温下搅拌反应8小时，然后加入0.2mL NaBH4溶液(4mg/mL)，混匀，静置反应，混合液转入透析袋中于PBS缓冲液(pH为7.4)中搅拌过夜；
4)取出透析袋中的液体，加入等体积饱和硫酸铵，离心，将沉淀物溶于PBS缓冲液(pH为7.4)中并装入透析袋中透析取上清液即为酶标记的肌红蛋白抗体。
对比实施例1
如实施例1的肌红蛋白测定试剂盒，所不同的是，纳米磁微粒不经改性的纳米Fe2O3磁性粉体而直接由Fe2O3磁性纳米粉与聚苯乙烯-聚丙烯酸制备，平均粒径为42nm。
测试例
1、将实施例1、对比实施例1的肌红蛋白测定试剂盒与美国雅培公司生产的肌红蛋白试剂盒(2K43型)对浓度为30ng/mL的肌红蛋白校准品进行检测，并通过分析检测结果对这两种检测定剂盒的重复性和准确度进行分析和比较。具体结果如表1所示。
表1
Figure BDA0001365816590000041
Figure BDA0001365816590000051
其中，每个试剂盒对校准品重复测定10次，分别计算测定均值(M)和标准差(S)，变异系数的计算方法为S/M×100％，相对偏差的计算方法为(1-M/样本浓度)×100％。
上述测试在日立7060型自动分析仪进行，下同，分析方法主波长:570nm，副波长:800nm，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
2、按照实施例1制备三批肌红蛋白测定试剂盒分别命名为A1、A2、A3和对比实施例1的方法制备三批肌红蛋白测定试剂盒分别命名为D1、D2、D3，然后对上述样品进行测试20次，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001365816590000052
3.灵敏度测试
采用5％牛血清白蛋白溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续检测20次，计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加两倍标准差(+2SD)作为报告方法的检测限。
表3
平均值(ng/ml) 标准差
实施例1 0.51 0.103
对比实施例1 3.64 2.576
从表3可见，实施例的肌红蛋白测定试剂盒的灵敏度为0.613ng/L，相较于对比实施例灵敏度6.216优势明显。
4.干扰试验
试验方法：在同一待测样品中分别加入血红蛋白、类风湿因子，考察本发明的抗干扰能力。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率，回收率在10％偏差以内视为无显著干扰。具体结果如表4所示。
表4
Figure BDA0001365816590000061
从表4可以看出，本发明的肌红蛋白测定试剂盒同时具有良好的抗干扰能力，对于样品中影响结果较大的血红蛋白、类风湿因子都有良好的抗干扰。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种用于检测肌红蛋白的测定试剂盒，其特征在于，试剂盒包括包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒、酶标记的肌红蛋白抗体、肌红蛋白校准品、化学发光底物，所述纳米磁微粒的粒径为40nm，所述酶为辣根过氧化物酶；
其中，包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒的制备方法包括：将纳米磁微粒与活化剂在缓冲溶液中接触，然后与肌红蛋白抗体偶联得到包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒，所述活化剂为碳二亚胺；
包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒的制备方法包括：
1）将纳米磁微粒用MES 缓冲液分散，使纳米磁微粒的终浓度为30mg/mL；
2）将碳二亚胺加入至步骤1）的溶液中，搅拌加入肌红蛋白抗体，室温下搅拌过夜；
3）将纳米磁微粒与反应体系分离后用MES缓冲液分散，加入1％BSA封闭液，室温封闭反应2~4小时，将纳米磁微粒分离；
4）将步骤3）分离的纳米磁微粒用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散，使纳米磁微粒的终浓度为18mg/mL，得到包被有肌红蛋白抗体的纳米磁微粒；
纳米磁微粒的制备方法包括以下步骤：
1）将纳米Fe2O3粉体分散于体积分数为50%的乙醇水溶液中，机械搅拌20~30 min，沉淀，分离，固相水洗，加入蒸馏水，调节 pH至5.5~6，加入油酸，65℃机械搅拌1小时，冷却至室温，磁分离，无水乙醇、去离子水反复洗涤除去游离的油酸，干燥得到改性的纳米Fe2O3磁性粉体；
2）将改性的Fe2O3磁性纳米粉与聚苯乙烯-聚丙烯酸加入到四氢呋喃中，机械搅拌的条件下缓慢滴加四氢呋喃1~3倍体积的水，搅拌反应2~3小时，静置，过滤，石油醚洗涤，干燥得纳米磁微粒；
所述酶标记的肌红蛋白抗体的制备方法包括步骤如下：
1）将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中；
2）向步骤1）得到的溶液中加入0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液，并将其装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；
3）向步骤2）得到的透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为7.5～8，加入肌红蛋白抗体，室温下搅拌反应8~10小时，然后加入NaBH4溶液，混匀，静置反应，混合液转入透析袋中于PBS 缓冲液中搅拌过夜；
4）取出透析袋中的液体，加入饱和硫酸铵，离心，将沉淀物溶于PBS 缓冲液中并装入透析袋中透析取上清液即为酶标记的肌红蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的肌红蛋白测定试剂盒，其中，所述化学发光底物由化学发光液A液和B液组成，A液为含有0.7g/L的鲁米诺和0.165g/L的对碘酚的Tris-HCl缓冲液，pH为8.6；B 液为0.675g/L过氧化脲。
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