CN111471799B - 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒 - Google Patents

一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111471799B
CN111471799B CN202010416762.5A CN202010416762A CN111471799B CN 111471799 B CN111471799 B CN 111471799B CN 202010416762 A CN202010416762 A CN 202010416762A CN 111471799 B CN111471799 B CN 111471799B
Authority
CN
China
Prior art keywords
kit
detection
porcine
virus
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010416762.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111471799A (zh
Inventor
黄勇
童德文
罗乐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN202010416762.5A priority Critical patent/CN111471799B/zh
Publication of CN111471799A publication Critical patent/CN111471799A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111471799B publication Critical patent/CN111471799B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于动物病毒检测技术领域，涉及一种针对猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的多重超敏纳米荧光检测试剂盒。本发明可同时对上述五种病毒进行筛查与鉴别，灵敏度为20copies/mL，实现了上述五种病原感染早期动物样品的规模化筛查与鉴别。本发明具有高通量、灵敏度高、特异性强、免除病原核酸提取和反转录等优点，可提高感染早期病原的检出率，有效防控这五类疾病的传播，对保障养猪业的健康发展具有重要意义。

Description

一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒
技术领域
本发明涉及动物病毒检测技术领域，具体涉及一种能同时检测和鉴别诊断猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病病毒的多重纳米-荧光定量超敏规模化检测(UNDP-MFQ)试剂盒及富集探针、放大标签、检测探针和检测引物。
背景技术
养猪业是我国畜牧业的关键支柱产业，近年来随着集约化养猪业的发展，猪繁殖与呼吸障碍综合症(俗称蓝耳病)病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等单独感染或混合感染所引起的母猪繁殖障碍性疾病和仔猪多***病成为危害我国规模化养猪业的主要疫病，给生猪养殖业带来了巨大的经济损失，严重地制约了我国养猪业的健康发展。但是，针对这几类具有相似临床特征的病毒性疾病，目前还缺乏早期、快速、经济的筛查技术和规模化的鉴别诊断技术，导致对此类疾病的流行情况、病原的潜在感染情况缺乏***性认识，进而无法进行及时有效的***性防控。
目前我国境内常见的危害规模化养猪生产的猪繁殖障碍性病毒性疾病主要包括：PCV2和PRRSV混合感染引起的以妊娠母猪的繁殖障碍性疾病及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病；PCV2和PPV引起的妊娠母猪流产、***或生产死胎；CSFV持续性感染引起的以母猪繁殖障碍为主要特征的非典型性猪瘟。在这些疾病中，PCV2感染以及其引起的免疫功能低下是上述各类病原感染并致病的最根本原因。PCV2的单感染对宿主没有较强的致病性影响，但是由于猪对其有较强的易感性，且PCV2感染引起猪免疫力下降，从而使机体更易感染其他病原，因此，PCV2感染猪更易于感染PPV、PRRSV、CSFV和PRV等病原，进而使这些病原的感染率和相关疾病的发病率显著升高。
猪繁殖与呼吸障碍综合症(俗称蓝耳病)病毒(PRRSV)能引起猪的繁殖和呼吸***综合征(PRRS)。不同年龄、品种和性别的猪均易感染，该病主要以母猪发热、厌食和流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。高致病性猪蓝耳病是由PRRSV变异株引起的一种急性高致病性传染病，仔猪发病率达100％、死亡率达50％以上，母猪流产率达30％以上。由于高致病性PRRSV毒力强、传播速度快、发病率高、病死率高，到目前为止，蓝耳病已蔓延到全球，每年都有巨大的经济损失，对养猪业构成了严重的威胁。
猪瘟病毒(CSFV)黄病毒科瘟病毒属成员，基因组为单股正链RNA，长度为12.3kb，其引起的猪瘟被国际兽疫局列为A类传染病。近年来猪瘟疫苗的广泛使用已经基本上抑制了烈性猪瘟的发生，但是，猪瘟病毒所致疾病正呈现出慢性化的特征，感染猪主要表现为母猪流产、产木乃伊胎、死胎和产弱仔，进而给该病的防控带来了新的困难。
猪圆环病毒2型(PCV2)属于圆环病毒科，圆环病毒属，病毒直径约17nm，无囊膜，是迄今被发现的最小的脊椎动物病毒。该病毒基因组是单链环状DNA，全长约1.7kb。PCV2感染可引起断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)和猪繁殖障碍等多种疾病，PCV2感染会使10～15周龄仔猪出现体重减轻、腹泻、黄疸等临床表现。虽然单纯PCV2感染很少引起严重的临床疾病，但它通常会与其他病原形成混合感染，造成圆环病毒相关疾病(PCVAD)，给养猪业带来巨大损失。
猪伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、水痘病毒属。PRV基因组为双股线状DNA，基因组大小约为150kb。PRV引起的猪伪狂犬病(PR)是一种高度接触性传染病。猪是该病的主要宿主和传染源，健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。通常引起妊娠母猪流产、木乃伊胎、死胎和产弱仔；初生仔猪出现神经症状，感染率和死亡率可达100％，成年猪感染后多耐过，不发病呈隐性感染，造成长期带毒排毒，成为最危险的传染源，严重影响种猪场生产。
猪细小病毒(PPV)属于细小病毒科细小病毒属，为单股正链DNA病毒，可引起母猪发生繁殖障碍病，PPV在猪群中的血清抗体阳性率高达50％～80％，是目前导致胚胎和胎儿死亡的主要病毒之一。当前研究发现，感染PPV后可导致仔猪腹泻、发生皮炎及呼吸***疾病，同时与多种疾病有关，如仔猪断奶多***衰竭综合征、猪非化脓性心肌炎和猪消瘦综合症，因此给养猪业造成了巨大的经济损失。
目前，检测上述5种病毒的主流方法为分子生物学方法和免疫学方法，其中商品化的检测方法主要以PCR、荧光定量PCR和ELISA检测法最为常用，但这些检测方法需要进行病毒核酸的提取、反转录或者需要具备种株特异性抗体，检测程序复杂且检测敏感度均有限，尚不能满足多种病原感染早期动物样本的筛查和鉴别诊断的需求，进而无法实现对感染的早期预判，无法降低潜在病原感染对养猪业带来的巨大隐患。
因此，为了降低检测限，提高检测灵敏度，研究人员开发了一种新的分子生物学检测方法，它借助磁珠标记捕获探针，特异性捕捉病毒核酸，再依赖纳米金粒子对其信号进行放大，最后再用荧光定量PCR检测放大信号，从而将纳米微粒的病原富集和信号放大优势与荧光定量PCR的高敏感可规模化操作优势有效的整合在一起，既免除了同时检测多种不同类型病毒时核酸提取和反转录的复杂程序，又实现了单独荧光定量PCR检测法都无法达到的检测敏感度，从而为感染早期多种病原的规模化筛查与鉴别诊断提供了一种现实可行的检测方法。
目前，检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病病毒的核酸检测方法，敏感度最高的为荧光定量PCR，敏感度超过荧光定量PCR的病毒核酸多重检测技术尚未见有报道。
公开于该背景技术的相关信息仅仅旨在促进对本发明总体背景的理解，而不应该被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测(UNDP-MFQ)试剂盒，它可同时精确检测猪蓝耳病、猪瘟、猪圆环病、猪伪狂犬和猪细小病毒。
本发明的技术方案如下：
一种检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒，所述试剂盒包括富集探针、放大标签、检测探针、检测引物，均为核酸片段，其中：
富集探针序列如SEQ ID NO:1、5、9、13、17所示；
放大标签序列如SEQ ID NO:2、6、10、14、18所示；
检测探针序列如SEQ ID NO:3、7、11、15、19所示，检测探针两端分别连接荧光基团和荧光淬灭基团；
检测引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列如SEQ ID NO:21所示，下游引物如SEQ ID NO:4、8、12、16、20所示；
所述富集探针被偶联于磁珠上；放大标签则被偶联于金纳米颗粒。
如前述的试剂盒，检测探针的5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB。
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，序列如SEQ ID NO.22～26所示。
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括病毒裂解液，它是帮助病毒裂解释放核酸的试剂；
优选的，所述病毒裂解液配方为：15mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM NaCl。
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括PL核酸杂交缓冲液浓缩液，它是为核酸杂交提供适宜的pH值和离子强度的缓冲液的浓缩液；
优选的，所述PL核酸杂交缓冲液浓缩液的配方为：0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠，0.1％Tween-20和2％SDS；
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括Taqman探针法荧光定量PCR反应液，它是为PCR反映提供模板、探针、引物以外的所有必要物质的试剂。
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括wash缓冲液浓缩液，它是洗涤未结合到磁珠的核酸的缓冲液的浓缩液；
优选的，所述wash缓冲液浓缩液是1M PBS。
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括洗脱试剂浓缩液，它是用于将放大标签从金纳米颗粒上分离的洗脱试剂的浓缩液；
优选的，所述洗脱试剂浓缩液配方为：5mol/L DTT，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5。
序列如SEQ ID NO.1～21所述的核酸在制备检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的试剂盒中的用途。
如前述的用途，所述试剂盒包括：富集探针、放大标签、检测探针、检测引物；
富集探针序列如SEQ ID NO:1、5、9、13、17所示；
放大标签序列如SEQ ID NO:2、6、10、14、18所示；
检测探针序列如SEQ ID NO:3、7、11、15、19所示，检测探针两端分别连接荧光基团和荧光淬灭基团；
检测引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列如SEQ ID NO:21所示，下游引物如SEQ ID NO:4、8、12、16、20所示；
所述富集探针被偶联于磁珠上；放大标签则被偶联于金纳米颗粒。
与现有技术相比，发明所提供的试剂盒和检测方法具有如下有益效果：
(1)操作简便：本试剂盒已标准化处理，普通实验技术人员可以顺利掌握，利于应用推广。
(2)高通量：多重检测体系可以同时猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒，检测过程平行操作，可同时进行大量不同样品的检测。
(3)高效性：检测试剂盒涵盖5种常见重要的猪疫病病原，在样品中既有DNA病毒又有RNA病毒的情况下，病毒核酸无需分别提取和反转录，一次性裂解并富集病原核酸，一次性完成检测并获得五种疫病的检测判定结果。
(4)高灵敏度：本发明能同时检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒敏感度为20copies/mL，可适用于病原感染早期的快速筛查与鉴别诊断。
(5)检测结果准确：本发明的检测试剂盒相比普通Real-time PCR检测方法，在临床上对病毒检出率更高，且与本领域且与本领域“黄金标准”(病毒的分离鉴定)检测结果一致。
除了上述优点，还有检出率高，假阳性率低，成本低，用途广等优点，对猪主要流行疫病的流行病学调查及其防控，保障养猪业的健康持续发展具有重要意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明检测方法试剂盒工作原理图。
图2为不同富集探针和放大标签的作用比较。
图3为UNDP-MFQ方法的特异性检测：A:UNDP-MFQ检测包含CSFV、PEDV和TGEV的血清样本；B：UNDP-MFQ检测包含PCV2、PEDV和TGEV的血清样本；C：UNDP-MFQ检测包含PRRSV、PPV、PEDV和TGEV的血清样本；D：UNDP-MFQ检测包含CSFV、PCV2、PPV、PEDV和TGEV的血清样本；E：UNDP-MFQ检测包含CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV的血清样本；F：UNDP-MFQ检测包含PRRSV、PCV2、PRV、PPV、PEDV和TGEV的血清样本；Others：PEDV和TGEV；NC：阴性对照；注：为方便区分，本图中未显示阳性对照的扩增曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的毒株均由西北农林科技大学动物医学院病理实验室保存。
实施例中金纳米颗粒购买自上海杰一生物科技公司，羧基化的磁珠购买自美国Invitrogen公司。
实施例1富集探针、放大标签的设计与筛选
在偶联了富集探针的功能化磁珠捕捉病毒核酸，偶联了放大标签的功能化纳米金颗粒富集病毒信号及荧光定量PCR检测中，富集探针和放大标签的设计直接影响到检测的特异性和灵敏性。本发明在充分考虑相关因素后，及本实验室的研究经验基础上设计了两组探针和标签，发现以下探针、标签及相应检测探针和引物显示出良好的特异性及灵敏性。
相关序列如下：
猪蓝耳病病毒富集探针(SEQ ID NO:1):
5’NH2-T15CCAGGTTTCTATGGCTGAGTACAC
猪蓝耳病病毒放大标签(SEQ ID NO:2):
5’SH-T5GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTGTAACGGTTACCGACACGTGGTGGGCAGGGG
猪蓝耳病病毒检测探针(SEQ ID NO:3):
5’FAM-CGGTAACCGTTAC-(MGB)3’
猪蓝耳病病毒检测引物(下游)(SEQ ID NO:4):
5′-CCCCTGCCCACCACGT-3′
猪瘟病毒富集探针(SEQ ID NO:5):
5’NH2-T15GGGAGCTCGCCACTACGGCTAGTCCCTCCG
猪瘟病毒放大标签(SEQ ID NO:6):
5’SH-T5GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTGCTTGCTAATGGCACTTAAGGTGTGTCTTGGGCAT
猪瘟病毒检测探针(SEQ ID NO:7):
5’FAM-GCCATTAGCAAGC-(MGB)3’
猪瘟病毒检测引物(下游)(SEQ ID NO:8):
5′-GATGCCCAAGACACACCTT-3′
猪圆环病毒2型富集探针(SEQ ID NO:9):
5’NH2-T15 GCTCTCCAACAAGGTACTCACAGCAGTAGA
猪圆环病毒2型放大标签(SEQ ID NO:10):
5’SH-T5GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACGTCTTCCAATCACGCTTCTG
猪圆环病毒2型检测探针(SEQ ID NO:11):
5’FAM-TGGCTCTGGTGCG-(MGB)3’
猪圆环病毒2型检测引物(下游)(SEQ ID NO:12):
5′-GGCAGAAGCGTGATTGGAAG-3′
猪伪狂犬病病毒富集探针(SEQ ID NO:13):
5’NH2-T15 CTCACGGCCGGCCGCCTGCAGGCCGCCACC
猪伪狂犬病病毒放大标签(SEQ ID NO:14):
5’SH-T5GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCCGTACAAGTGCCACCGCGGCGTGATGGCGCAGAC
猪伪狂犬病病毒检测探针(SEQ ID NO:15):
5’FAM-GGCACTTGTACGG-(MGB)3’
猪伪狂犬病病毒检测引物(下游)(SEQ ID NO:16):
5′-GTCTGCGCCATCACGC-3′
猪细小病毒富集探针(SEQ ID NO:17):
5’NH2-T15TTCATGCTGTATGAACCAGTAGCAGT
猪细小病毒放大标签(SEQ ID NO:18):
5’SH-T5GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCATGAACAGTCGGACCCATTTTCCCATTGCT
猪细小病毒检测探针(SEQ ID NO:19):
5’FAM-CCGACTGTTCATG-(MGB)3’
猪细小病毒检测引物(下游)(SEQ ID NO:20):
5′-GGGGAGCAATGGGAAAATGG-3′
五种病毒通用检测引物(上游)(SEQ ID NO:21):
5′-TGGTGCAGGGTCCGAGGT-3′
其中，五种病毒通用检测引物(上游)与猪蓝耳病病毒检测引物(下游)、猪瘟病毒检测引物(下游)、猪圆环病毒2型检测引物(下游)、猪伪狂犬病病毒检测引物(下游)和猪细小病毒检测引物(下游)分别组合，形成5个引物对，用于荧光定量PCR检测。
阳性对照和阴性对照按照以下方式制备：
根据针对RNA病毒猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒所设计的富集探针和放大标签在病毒基因组中靶向的位置，分别截取病毒基因组中富集探针靶序列和放大标签靶序列之间的序列，并向5’端和3’端依次延长10nt作为猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的阳性对照核酸片段；
另外选取一段不与所设计的富集探针、放大标签、以及设计的检测探针序列互补的核酸序列作为待检猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的阴性对照核酸片段；
将设计的2个病毒的阳性对照核酸片段和共同阴性对照核酸片段分别通过PCR进行扩增，以PCR扩增产物为模板，利用T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒通过体外转录获得针对于猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的特异性阳性对照RNA和阴性对照RNA；
根据针对DNA病毒猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒所设计的富集探针和放大标签在病毒基因组中靶向的位置，分别截取病毒基因组中富集探针靶序列和放大标签靶序列之间的序列，并向5’端和3’端依次延长10nt作为猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的阳性对照核酸片段；
另外选取一段不与所设计的富集探针、放大标签、以及设计的检测探针序列互补的核酸序列作为猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的阴性对照核酸片段；
将设计的3个病毒的阳性对照核酸片段和共同阴性对照核酸片段合成，作为猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的特异性阳性对照DNA和阴性对照DNA；
将建立的针对猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的阳性对照RNA，与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的阳性对照DNA等浓度混合，作为针对5种病原方法中的阳性对照。
猪蓝耳病病毒阳性对照的序列(SEQ ID NO:22)如下：
AGAAACCTGGAAATTCATCACCTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCA
猪瘟病病毒阳性对照的序列(SEQ ID NO:23)如下：
GCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGA
圆环病毒2型阳性对照的序列(SEQ ID NO:24)如下：
GTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAGAAGCGTG
猪伪狂犬病病毒阳性对照的序列(SEQ ID NO:25)如下：
CGGCCGTGAGGGCGGCGCTCGTCTGCAGCTTGCTCAGGCGCGCGTGGTCGGCGCACAGCGTCCGGAACACGGGCGCCTGCAGGCCCAGCGCCTCGCACTCGCGCAGCGCCTCCGTCGTCTGCGCCA
猪细小病毒阳性对照的序列(SEQ ID NO:26)如下：
ACAGCATGAACATGGTCAAGATACTGGCTATCACTGCCATGTACTACTAGGTGGAAAAGGCTTACAACAAGCAATGGGA
实施例2试剂盒组成、使用方法及保存期测试
1.试剂盒组成
按试剂盒的理化性质及功能分区，将试剂盒分为A，B和C三部分组成，A部分为病毒核酸释放试剂，杂交试剂及偶联了富集探针的磁珠，B部分为偶联了放大标签的金纳米溶液，C部分为荧光定量PCR检测试剂部分，方便保存和运输。
试剂盒涉及的核苷酸序列(包括富集探针、放大标签、检测探针、检测引物、阳性对照)同实施例1。
此外，需配备一个小型磁力架。
A部分
1)溶液A1(病毒裂解液)一瓶，25mL；其成分为：15mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mMNaCl；
2)溶液A2(偶联了猪蓝耳病病毒富集探针的磁珠)一支，3mL；
3)溶液A3(偶联了猪瘟病毒富集探针的磁珠)一支，3mL；
4)溶液A4(偶联了猪圆环病毒2型富集探针的磁珠)一支，3mL；
5)溶液A5(偶联了猪伪狂犬病病毒富集探针的磁珠)一支，3mL；
6)溶液A6(偶联了猪细小病毒富集探针的磁珠)一支，3mL。
需要说明的是，溶液A2～A6的制备，需要先将磁珠表面羧基进行活化，活化后方能与富集探针5’端的氨基反应形成肽键，完成偶联。具体方式为：将购买的羧基修饰的磁珠利用磁珠-wash缓冲液A(1M Tris(pH＝8.0)10mL，100mM EDTA 10mL，ddH2O 980mL)和磁珠-wash缓冲液B(100mM MES pH 4.8)进行清洗，然后重悬于磁珠-wash缓冲液B中，再加入富集探针活化液(265mg EDC粉末溶于1mL 100mM MES)对磁珠进行活化，再加入富集探针，使两者通过肽键形成稳定的共价结合形成功能化磁珠，并做好标记。最后重悬于适量的TT缓冲液(200mL 1M Tris，pH 6.8；1mL 10％Tween-20；799mL H2O)中，使其终浓度为10mg/mL，保存于4℃备用。
B部分
1)溶液B1(PL核酸杂交缓冲液浓缩液)一瓶，10mL，其成分为：0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠，0.1％Tween-20和2％SDS；
2)溶液B2(偶联了猪蓝耳病病毒放大标签的金纳米溶液)一支，3mL；
3)溶液B3(偶联了猪瘟病毒放大标签的金纳米溶液)一支，3mL；
4)溶液B4(偶联了猪圆环病毒2型放大标签的金纳米溶液)一支，3mL；
5)溶液B5(偶联了猪伪狂犬病病毒放大标签的金纳米溶液)一支，3mL；
6)溶液B6(偶联了猪细小病毒放大标签的金纳米溶液)一支，3mL；
7)溶液B7(wash缓冲液浓缩液)一瓶，5mL，其成分为：1M PBS；
8)溶液B8(洗脱试剂浓缩液)一瓶，5mL，其成分为：5mol/L DTT，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5；
需要说明的是，溶液B2～B6的制备，需要先将放大标签进行活化，才能偶联放大标签和金纳米颗粒，具体标记方式为：取10nmol/L 15nm纳米金溶液1.0mL，以15700g/min离心50min，去上清液，以100μL无菌去离子水重悬；加入放大标签使其终浓度为3μmol/L，室温放置16h；逐步加入放大标签活化液A(1mol/L NaCl)和放大标签活化液B(0.1mol/L PB(pH7.2))至终浓度分别为0.1mol/L和10mmol/L，充分混匀，室温放置48h以上；用AuPB储存液(0.01mol/L PBS溶液)以15000g/min离心清洗50min两次，去上清液，以100μL AuPB储存液(0.01mol/L PBS溶液)重悬，4℃储存备用。
C部分
1)溶液C1(Taqman探针法荧光定量PCR反应液)一支，1.5mL；
2)溶液C2(阳性对照混合液)一支，50μL；
3)溶液C3(阴性对照)一支，50μL；
4)溶液C4(猪蓝耳病病毒检测探针)一支，50μL；
5)溶液C5(猪瘟病毒检测探针)一支，50μL；
6)溶液C6(猪圆环病毒2型检测探针)一支，50μL；
7)溶液C7(猪伪狂犬病病毒检测探针)一支，50μL；
8)溶液C8(猪细小病毒检测探针)一支，50μL；
9)溶液C9(五种病毒通用检测引物(上游))一支，50μL；
10)溶液C10(猪蓝耳病病毒检测引物(下游))一支，50μL；
11)溶液C11(猪瘟病毒检测引物(下游))一支，50μL；
12)溶液C12(猪圆环病毒2型检测引物(下游))一支，50μL；
13)溶液C13(猪伪狂犬病病毒检测引物(下游))一支，50μL；
14)溶液C14(猪细小病毒检测引物(下游))一支，50μL。
2.使用方法
该方法包括以下步骤：
(1)在病毒核酸释放条件中(适宜的温度和时间：一般采用95℃，10min)，使待测样本在裂解缓冲液的存在的条件下进行第一接触，得到第一接触后产物；
(2)将第一接触后的产物与5种富集探针偶联的磁珠(MMPs)在杂交条件下于PL核酸杂交缓冲液中进行第二接触，得到第二接触后的产物：所述富集探针能够与所述病毒核酸(单链RNA或DNA)杂交；
(3)将第二接触后的产物与5种放大标签偶联的金纳米颗粒(AuNPs)在杂交条件下进行第三接触，得到第三接触产物：所述放大标签能够与所述病毒核酸(单链RNA或DNA)杂交；
(4)将第三接触后产物在磁力架作用下，使用wash缓冲液(wash缓冲液浓缩液稀释10倍配制而成)洗去未结合到磁珠上的核酸，进行第四接触，去除残留的PL核酸杂交缓冲液和尚未结合的富集探针及放大标签，纯化后得到第四接触产物；
(5)将第四接触产物与洗脱试剂(洗脱试剂浓缩液稀释5倍配制而成)在洗脱条件(37℃，10min)下进行第五接触，使放大标签洗脱下来形成第五接触产物；
(6)将得到的第五接触产物在荧光定量PCR仪中与检测试剂进行第六接触(即进行qRT-PCR反应)，然后对结果进行判定。
其中，所述检测试剂中包含5个引物对和5种检测探针，以及试剂C1。
3.保存期检测
新组装的试剂盒A部分和B部分在4℃保存6个月，C部分在-20℃保存6个月，检测阴性，阳性样品，阳性样品全为阳性结果，阴性样品和空白对照全为阴性结果。
实施例3试剂盒特异性
本实施例用于说明本发明所提供的试剂盒(实施例2的试剂盒)用于扩增猪蓝耳病病毒，猪瘟病毒，猪圆环病毒2型，猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的特异性。
以包含猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和/或猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等7种病原的血清样本或仅包含其中某几种病原的血清样本以及建立的阳性对照，阴性对照按实施例2中所述方法进行检测。
试剂盒有效性判定：
阳性对照：Ct值≤35，有明显指数增长；
阴性对照：Ct值>45或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期；
标本结果判定：
①阳性：标本检测结果Ct值≤35，有明显指数增长；
②可疑：标本检测结果Ct值在35～40范围，此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～40范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性；
③阴性：标本检测结果Ct值>40或无Ct值。
图3分别对应猪瘟病毒，猪蓝耳病毒，猪伪狂犬病病毒，猪细小病毒的检测结果。
由图3A可知，当所建立的试剂盒检测包含CSFV，PEDV和TGEV的血清样本进行检测时，仅CSFV检测孔出现特异性扩增曲线；
由图3B可知，当所建立的试剂盒检测包含PCV2，PEDV和TGEV的血清样本进行检测时，仅PCV2检测孔出现特异性扩增曲线；
由图3C可知，当所建立的试剂盒检测包含PRRSV，PPV，PEDV和TGEV的血清样本进行检测时，仅PRRSV，PPV检测孔出现特异性扩增曲线；
由图3D可知，当所建立的试剂盒检测包含PRRSV，PCV2，PPV，PRV，PEDV和TGEV的血清样本进行检测时，仅PRRSV，PCV2，PPV，PRV检测孔出现特异性扩增曲线；
由图3E可知，当所建立的试剂盒检测包含PRRSV，PCV2，PPV，PRV，PEDV和TGEV的血清样本进行检测时，仅PRRSV，PCV2，PPV，PRV检测孔出现特异性扩增曲线；
由图3F可知，当所建立的试剂盒检测包含CSFV，PRRSV，PCV2，PPV，PRV，PEDV和TGEV等7种病原的全部血清样本进行检测时，检测的靶病原均出现特异性扩增曲线，而未出现其他扩增；
从以上检测结果来看本发明试剂盒具备良好的特异性。
实施例4可行性检测
选取已经用病毒培养结合荧光定量PCR方法进行确认的猪蓝耳病阳性血液样本20例；猪瘟病毒阳性血液样本30例；猪圆环病毒病阳性血液样本50例；猪伪狂犬病阳性血液样本40例；猪细小病毒病阳性血液样本45例；
将上述血清样本及阳性对照、阴性对照、空白对照全部按照实施例3相同的方法进行检测，并根据上述判定方法进行判定，检测结果列于表1。
表1一致性检测
实施例5敏感性检验(以标准血清为对象)
使用实施例2的试剂盒对含有PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、PPV等不同病毒的病毒样本进行定量检测并计算病毒拷贝数，然后根据每种病毒标准血清样品的即定浓度，将病毒用无污染的猪血清进行稀释，作为各个病毒的储藏标准血清样品，然后利用猪血清将进行梯度稀释106～1copies/mL稀释浓度范围的样本。
将浓度相同的5种样本混合均匀，再利用实施例3相同的方法检测，结果显示UNDP-MFQ的检测限为20copies/mL的标准血清混合样本。
实施例6重复性检验(以血液为对象)
从稀释的病毒混合的血清样本中，选择3个浓度样本，依次为103、102、20copies/mL，利用实施例3相同的方法检测，做三个重复，进行组内重复试验；另外每两月利用实施例3相同的方法做一次试验，每次做三个重复，计算平均值，做三次，进行组间重复试验，并对不同病毒拷贝数在同一次试验和不同试验间得到的Ct值进行统计学分析。
结果显示，组内重复的最大变异系数(C.V)为1.12％，组间重复的最大变异系数(C.V)为1.17％，组内与组间的最大变异系数均小于1.5％，说明所建立的试剂盒组内与组间重复性良好(表2)，由此说明该方法可以获得比较稳定的检测结果。
表2重复性试验
实施例7临床样品检测结果
取多个疫区的疑患有猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和/或猪伪狂犬病的猪的血清样品273份，用所建立的针对CSFV，PRRSV，PCV2，PRV，PPV的多重检测试剂盒(UNDP-MFQ)及多重Real-time PCR方法分别进行检测。
结果如下：
表3不同方法的样品检测结果
/>
在273个样本中(表3)，使用多重Real-time PCR检测发现58个阳性样本(有上述五种病原的一种或多种感染即为阳性)和215个阴性样本(上述5种病原均未感染)，而使用UNDP-MFQ分析检测发现102个阳性样本(有上述五种病原的一种或多种感染)和171个阴性样本(上述5种病原均未感染)。
通过对58例多重Real-time PCR检测显示阳性样本的检测结果(其中6例为临床前样本)与相应的这58例样本的UNDP-MFQ检测结果进行具体比对分析(表4)。
结果如下：
表4针对多重Real-time PCR检测阳性的样品进行两种方法的比较
/>
/>
注:表中标下划线的样本为临床前样本
两种检验感染情况完全一致的仅有11例：其中2例是PCV2与PRRSV的混合感染；3例为PCV2与PPV的混合感染；1例为PRRSV与PPV的混合感染；2例为PCV2与CSFV、PPV的三重感染；2例CSFV的单感染(临床前阶段的样本)；1例PCV2的单感染，因此多重Real-time PCR检测完全一致的阳性率(检测结果为阳性且与UNDP-MFQ结果完全一致占总检测样本数的百分率)仅为4％。
而其余47例样本(包含4例临床前样本)中虽然检测结果均为阳性，但多重Real-time PCR技术不能完全检测出UNDP-MFQ检测出的感染情况：对于UNDP-MFQ检测结果为PCV2与PRRSV的混合感染17例样本中，多重Real-time PCR仅能检测出其中PCV2或PRRSV的单感染；对于UNDP-MFQ检测结果为PCV2与PPV的混合感染12例样本中，多重Real-time PCR仅能检测出其中PCV2或PPV的单感染；对于UNDP-MFQ检测结果为PRRSV与PPV的混合感染6例样本中，多重Real-time PCR仅能检测出其中PRRSV或PPV的单感染；对于UNDP-MFQ检测结果为PRRSV，PCV2与PRV的三重混合感染4例样本中，多重Real-time PCR仅能检测出其中的一种或两种的病原感染；对于UNDP-MFQ检测结果为CSFV，PCV2与PPV的三重混合感染2例样本中，多重Real-time PCR仅能检测出其中的一种或两种的病原感染；对于UNDP-MFQ检测结果为PRRSV，PCV2，PRV与PPV的四重混合感染的4例样本，和UNDP-MFQ检测结果为CSFV，PRRSV，PCV2，PRV与PPV的混合感染的2例样本中，多重Real-time PCR也不能检测出全部感染病原。
以上结果说明，多重Real-time PCR检测与UNDP-MFQ检测相比，存在较大的漏诊率。
为了进一步验证结果的可靠性，对于UNDP-MFQ和多重Real-time PCR检测感染情况不一致的47例样本分别利用两种方法进行了两次重复试验。
结果与表4统计结果相同。
再通过病毒的分离鉴定对47例样本进行再次验证。结果与UNDP-MFQ检测结果一致，表明本研究中所建立的UNDP-MFQ检测方法的检测结果可靠准确。
通过对44例UNDP-MFQ检测为阳性和多重Real-time PCR检测为阴性的临床前阶段样本的感染情况具体分析(表5)。
结果如下：
表5针对多重Real-time PCR检测阴性而UNDP-MFQ检测阳性的临床前样本的结果统计
/>
UNDP-MFQ检测的具体感染情况为：13例是PCV2与PRRSV的混合感染；9例为PCV2与PPV的混合感染；3例为PCV2、PRRSV与PRV的三重感染；3例为PRRSV与PPV的混合感染；3例为PCV2与CSFV、PPV的三重感染；2例为PCV2与PRRSV、PRV、PPV的四重感染；1例为PCV2与CSFV、PRRSV、PRV、PPV的五重感染；4例CSFV的单重感染；3例PRV的单重感染；3例PRRSV的单重感染。而多重Real-time PCR检测显示为阴性。
为进一步验证检验结果的可靠性，对于上述44例临床前样本分别利用两种方法进行了两次重复试验，结果与表5统计结果相同。
然后通过病原的分离鉴定方法进行再次验证，结果与UNDP-MFQ检测结果一致，表明本研究中所建立的UNDP-MFQ检测方法和试剂盒的检测结果可靠准确，检测准确度显著优于多重Real-time PCR。
从以上结果看，本发明检测试剂盒具有良好的检出率，比传统的检测方法快捷方便且准确。
综上，本发明的试剂能够简单、快速、灵敏、准确地同时检测5种病毒，应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒
<130> GYKH1408-2019P018643CCR4
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt tttttccagg tttctatggc tgagtacac 39
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttgttgg ctctggtgca gggtccgagg tattgtaacg gttaccgaca cgtggtgggc 60
agggg 65
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggtaaccgt tac 13
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccctgccca ccacgt 16
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttttttttt tttttgggag ctcgccacta cggctagtcc ctccg 45
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttttgttgg ctctggtgca gggtccgagg tattgcttgc taatggcact taaggtgtgt 60
cttgggcat 69
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gccattagca agc 13
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gatgcccaag acacacctt 19
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttttttttt tttttgctct ccaacaaggt actcacagca gtaga 45
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tttttgttgg ctctggtgca gggtccgagg tattcgcacc agagccaacg tcttccaatc 60
acgcttctg 69
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tggctctggt gcg 13
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggcagaagcg tgattggaag 20
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tttttttttt tttttctcac ggccggccgc ctgcaggccg ccacc 45
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tttttgttgg ctctggtgca gggtccgagg tattccgtac aagtgccacc gcggcgtgat 60
ggcgcagac 69
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggcacttgta cgg 13
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtctgcgcca tcacgc 16
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tttttttttt tttttttcat gctgtatgaa ccagtagcag t 41
<210> 18
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tttttgttgg ctctggtgca gggtccgagg tattcatgaa cagtcggacc cattttccca 60
ttgct 65
<210> 19
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccgactgttc atg 13
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggggagcaat gggaaaatgg 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tggtgcaggg tccgaggt 18
<210> 22
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agaaacctgg aaattcatca cctccagatg ccgtttgtgc ttgctaggcc gcaagtacat 60
tctggcccct gccca 75
<210> 23
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcgagctccc tgggtggtct aagtcctgag tacaggacag tcgtcagtag ttcgacgtga 60
gcagaagccc acctcgagat gctatgtgga cgagggcatg cccaaga 107
<210> 24
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gttggagagc gggagtctgg tgaccgttgc agagcagcac cctgtaacgt ttgtcagaaa 60
tttccggggc tggctgaact tttgaaagtg agcgggaaaa tgcagaagcg tg 112
<210> 25
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cggccgtgag ggcggcgctc gtctgcagct tgctcaggcg cgcgtggtcg gcgcacagcg 60
tccggaacac gggcgcctgc aggcccagcg cctcgcactc gcgcagcgcc tccgtcgtct 120
gcgcca 126
<210> 26
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acagcatgaa catggtcaag atactggcta tcactgccat gtactactag gtggaaaagg 60
cttacaacaa gcaatggga 79

Claims (8)

1.一种检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包括富集探针、放大标签、检测探针、检测引物，均为核酸片段，其中：
富集探针序列如SEQ ID NO:1、5、9、13、17所示；
放大标签序列如SEQ ID NO:2、6、10、14、18所示；
检测探针序列如SEQ ID NO:3、7、11、15、19所示，检测探针两端分别连接荧光基团和荧光淬灭基团；检测探针的5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB；
检测引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列如SEQ ID NO:21所示，下游引物如SEQ ID NO:4、8、12、16、20所示；
所述富集探针被偶联于磁珠上；放大标签则被偶联于金纳米颗粒；
所述试剂盒还包括阳性对照核酸，序列如SEQ ID NO:22～26所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括病毒裂解液。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述病毒裂解液组成为：15mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM NaCl。
4.如权利要求1～3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PL核酸杂交缓冲液浓缩液，所述PL核酸杂交缓冲液浓缩液的组成为：0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠，0.1％Tween-20和2％SDS。
5.如权利要求1～3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Taqman探针法荧光定量PCR反应液。
6.如权利要求1～3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括wash缓冲液浓缩液，所述wash缓冲液浓缩液是1M PBS。
7.如权利要求1～3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗脱试剂浓缩液，所述洗脱试剂浓缩液组成为：5mol/L DTT，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5。
8.如SEQ ID NO .1～21所示的核酸在制备检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的试剂盒中的用途，其特征在于：
所述试剂盒包括：富集探针、放大标签、检测探针、检测引物；
富集探针序列如SEQ ID NO:1、5、9、13、17所示；
放大标签序列如SEQ ID NO:2、6、10、14、18所示；
检测探针序列如SEQ ID NO:3、7、11、15、19所示，检测探针两端分别连接荧光基团和荧光淬灭基团；检测探针的5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB；
检测引物包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列如SEQ ID NO:21所示，下游引物如SEQ ID NO:4、8、12、16、20所示；
所述富集探针被偶联于磁珠上；放大标签则被偶联于金纳米颗粒；
所述试剂盒还包括阳性对照核酸，序列如SEQ ID NO:22～26所示。
CN202010416762.5A 2020-05-15 2020-05-15 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒 Active CN111471799B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010416762.5A CN111471799B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010416762.5A CN111471799B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111471799A CN111471799A (zh) 2020-07-31
CN111471799B true CN111471799B (zh) 2023-08-22

Family

ID=71759966

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010416762.5A Active CN111471799B (zh) 2020-05-15 2020-05-15 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471799B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234865A (zh) * 2021-06-29 2021-08-10 西北农林科技大学 猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒
CN114763572B (zh) * 2022-04-01 2024-07-23 海南医学院 一种登革病毒ns1基因片段裸眼检测平台及制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263853A (zh) * 2014-09-12 2015-01-07 浙江理工大学 荧光定量pcr检测猪主要病毒的试剂盒
CN104789697A (zh) * 2015-03-20 2015-07-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种同时检测csfv、prrsv、prv、pcv2的四色荧光定量pcr方法及其试剂盒
CN105624330A (zh) * 2014-11-28 2016-06-01 北京亿森宝生物科技有限公司 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104263853A (zh) * 2014-09-12 2015-01-07 浙江理工大学 荧光定量pcr检测猪主要病毒的试剂盒
CN105624330A (zh) * 2014-11-28 2016-06-01 北京亿森宝生物科技有限公司 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法
CN104789697A (zh) * 2015-03-20 2015-07-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种同时检测csfv、prrsv、prv、pcv2的四色荧光定量pcr方法及其试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Le Luo et al.."Establishment of method for dual simultaneous detection of PEDV and TGEV by combination of magnetic micro-particles and nanoparticles".《Journal of Infection and Chemotherapy》.2020,第26卷第523-526页和补充试验数据. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111471799A (zh) 2020-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111187858A (zh) 新型冠状病毒检测试剂盒
CN111471799B (zh) 一种多重纳米-荧光定量超敏规模化检测试剂盒
CN108913812B (zh) 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建
WO2020034317A1 (zh) 塞内卡病毒和***病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂及试剂盒
WO2022179494A1 (zh) 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN113005228B (zh) 一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒及其检测方法
US20230374615A1 (en) Compositions, kits, methods for detecting and identifying pathogens that cause respiratory tract infections and use thereof
CN108504778A (zh) 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用
CN113186346A (zh) 一种新型冠状病毒核酸pcr-胶体金免疫层析法检测试剂盒
CN112746134A (zh) 非洲猪瘟病毒核酸快速检测试剂盒与应用
CN116024208A (zh) 一种单次反应可同时检测26种猪疫病的试剂盒
CN111778359A (zh) 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的***及其使用方法
Gao et al. Establishment of a dual real-time PCR assay for the identification of African swine fever virus genotypes I and II in China
CN112921123B (zh) 快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒
CN111088380A (zh) 布鲁氏菌lf-rpa检测引物和探针及检测试剂盒
CN108624713B (zh) 一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒
Xiao et al. Development and application of a novel Bio–Plex suspension array system for high–throughput multiplexed nucleic acid detection of seven respiratory and reproductive pathogens in swine
CN113293236A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒rt-lamp检测引物组及试剂盒
CN110904194B (zh) 一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用
US20230250497A1 (en) One-step nested pcr primers set and kit modified with locked nucleic acid for detecting african swine fever virus
CN113234864B (zh) 猪伪狂犬病毒lamp检测引物组及试剂盒
WO2021226754A1 (zh) 一种病毒重组酶-聚合酶扩增检测方法
CN113234865A (zh) 猪病毒性疾病的磁纳米微粒可视化病原检测试剂盒
CN110819724B (zh) 用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用
CN112410466A (zh) 猪圆环病毒2型和猪圆环病毒4型双重实时荧光定量pcr检测用引物、探针及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant