CN111254141A

CN111254141A - 核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒

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Publication number: CN111254141A
Application number: CN202010347016.5A
Authority: CN
Inventors: 陈翔; 王磊; 李素; 郑隆堂; 王亚南; 文飞; 辛娟; 张闻天; 程京
Original assignee: CapitalBio Corp
Current assignee: CapitalBio Corp; West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: US20210332348A1; EP3904532A1; CN111254141B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒。本发明提供了一套不含挥发性有机溶剂的核酸提取纯化试剂，解决了含有挥发性有机溶剂对人体的危害性，使得操作变得极其简单，大大的提升了核酸提取纯化的时效性，最快可以在10分钟内获得核酸，获得的核酸可用于PCR、NASBA、LAMP、RPA等生物反应，且本发明的试剂可以从血液、咽拭子保存液、唾液、尿液、痰液、粪便等多种复杂样本中获取细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒的核酸，非常适宜临床应用及科研应用。

Description

核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒。

背景技术

核酸提取技术是完成所有分子反应的第一步，该步骤完成的优劣直接影响后续生物反应能否成功。核酸的提取与纯化技术是分子生物学实验的一项基本技术，从最初的目的基因提取到PCR产物纯化或“胶回收”、以及基因克隆中质粒的提取等实验过程，都离不开核酸提取纯化。核酸分离纯化技术起源于20世纪50年代，在70年代和80年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。

常用的核酸提取纯化技术有Trizol法、离心柱法、磁珠法等方法，目前针对于这些方法所用到的核酸提取试剂均含有易挥发性有机溶剂。Trizol法利用DNA、RNA、蛋白质在有机层和水相层分布位置的不同而分离蛋白质与核酸，在获得核酸的过程中会用到苯酚、氯仿异戊醇、异丙醇、乙醇等对人体有害的挥发性有机溶剂，对操作人员存在较大的健康危害且Trizol法提取核酸步骤繁琐，对不同的样本提取效果重复性不佳，从样本裂解到获得核酸至少需要1.5h；因Trizol的有害性、操作繁琐、耗时长、与芯片不兼容等缺点，不宜在临床检测使用。常规的离心吸附柱及磁珠法提取核酸时也需要用乙醇或异丙醇进行结合，清洗时需要加入乙醇；这种加入醇类的方式使得核酸提取试剂在使用时操作相对复杂，耗时较长，且加入醇的试剂不能长时间保存，乙醇去除不干净还会一直后续反应且含乙醇的提取纯化试剂不适宜在微流控芯片上使用。

因此，提供一套无需添加任何挥发性有机溶剂的提取试剂成分及其使用方法，快速高效的对多种样本中的总核酸进行提取纯化具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒。本发明提供了一套无需添加任何挥发性有机溶剂的提取试剂成分及其使用方法，可快速高效的对多种样本中的总核酸进行提取纯化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了核酸提取组合物，包括结合液和清洗液；所述结合液包括糖原、MOPS、多胺类物质和TCEP的组合物；所述清洗液包括盐酸胍、醋酸钾、糖原、MOPS、多胺类物质的组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述结合液中糖原浓度为0.1%~1%（m/v）；MOPS浓度为10mM~20mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.1%~2%（m/v）；TCEP浓度为5mM~50mM；

所述结合液的pH为8.5~10。优选的，用硫酸氢钠调节溶液pH至8.5~10。

在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液中盐酸胍浓度为0.05M~0.6M；醋酸钾浓度为0.05M~0.5M；糖原浓度为0.01%~0.1%（m/v）；MOPS浓度为1mM~2mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.01%~0.3%（m/v）；

所述清洗液的pH为5~6。优选的，用硫酸氢钠调节溶液pH至5~6。

在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸提取组合物还包括裂解液、加强剂、洗脱液中的一种或多种；

所述裂解液包括异硫氰酸胍、TritonX-100中的一种或两者的混合物；

所述加强剂包括蛋白酶k、海藻糖、氯化钙中的一种或两者以上的混合物；

所述洗脱液包括氢氧化钠、1×TE溶液中的一种或两者的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述裂解液中异硫氰酸胍浓度为2M~8M；TritonX-100浓度为5%~20%（v/v）；pH值为3~6；和/或

所述加强剂中蛋白酶k浓度为10mg/ml~25mg/ml；海藻糖浓度为3%~12%（m/v）；氯化钙浓度为5mM~20mM；

所述洗脱液用氢氧化钠调节1×TE溶液的pH值为8~10。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的核酸提取组合物在制备核酸提取和/或核酸检测的工具中的应用；所述工具包括试剂和/或试剂盒。

在上述研究的基础上，本发明提供了核酸提取试剂或核酸检测试剂，包括所述的核酸提取组合物以及检测中可接受的试剂。

本发明还提供了核酸提取试剂盒或核酸检测试剂盒，包括所述的核酸提取组合物或所述的核酸提取试剂或核酸检测试剂以及检测中可接受的试剂或载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体包括硅基吸附柱、磁珠、玻璃珠、壳聚糖或二氧化硅修饰的载体。

本发明还提供了用于非诊断目的的核酸提取方法或核酸检测方法，取待测样本与所述的核酸提取组合物或所述的核酸提取试剂或核酸检测试剂混合，提取和/或检测。

本发明提供了一套不含挥发性有机溶剂的核酸提取纯化试剂，解决了含有挥发性有机溶剂对人体的危害性，使得操作变得极其简单，大大的提升了核酸提取纯化的时效性，最快可以在10分钟内获得核酸，获得的核酸可用于PCR、NASBA、LAMP、RPA等生物反应，且本发明的试剂可以从血液、咽拭子保存液、唾液、尿液、痰液、粪便等多种复杂样本中获取细胞、细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒的核酸，非常适宜临床应用及科研应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1的扩增结果；其中，图1（A）示1000拷贝/µL；图1（B）示 100拷贝/µL；图1（C）示10拷贝/µL；图1（D）示0拷贝/µL；

图2示实施例2的扩增结果；其中，图2（A）示1000拷贝/µL；图2（B）示 100拷贝/µL；图2（C）示10拷贝/µL；图2（D）示0拷贝/µL；

图3示实施例3的扩增结果；其中，图3（A）示1000拷贝/µL；图3（B）示 100拷贝/µL；图3（C）示10拷贝/µL；图3（D）示0拷贝/µL；

图4示实施例4的扩增结果；其中，图4（A）示唾液样本中的EV71装甲RNA（10⁴ copies）经提取后RT-LAMP扩增；图4（B）示尿液样本中的EV71装甲RNA（10⁴copies）经提取后RT-LAMP扩增；

图5示实施例5的扩增结果；其中，图5（A）示唾液样本中的含DPV（鸭瘟）病毒1000copies/ µL；图5（B）示唾液样本中的含DPV（鸭瘟）病毒100 copies/ µL；图5（C）示唾液样本中的含DPV（鸭瘟）病毒10 copies/ µL；

图6示实施例6的扩增结果；其中，图6（A）示RT-LAMP扩增（唾液样本）；图6（B）示NASBA扩增（咽拭子样本），1为PC，2为甲流，3为甲流H1N1，4为IC；图6（C）示RT-PCR扩增（咽拭子样本）；

图7示实施例7的扩增结果；其中，图7（A）示凯杰4000拷贝；图7（B）示本方法4000拷贝；图7（C）示凯杰400拷贝；图7（D）示本方法400拷贝；图7（E）示凯杰40拷贝；图7（F）示本方法40拷贝；

图8示实施例8的扩增结果：其中，图8（A）示EV71扩增；图8（B）示鸭瘟扩增；图8（C）示甲型流感H1N1扩增；

图9示实施例9的集成芯片液体试剂存储示意图；其中，1-清洗液存储部件；2-结合液、加强剂存储部件；3-洗脱液存储部件；

图10示实施例10的测试结果，其中，扩增曲线1-阳性外对照（鸭瘟病毒核酸）；2-甲流N1基因。

具体实施方式

本发明公开了核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明研制了一套不含有挥发性有机溶剂的核酸提取纯化试剂，该试剂可用多种核酸吸附载体，其包含硅基吸附柱、磁珠、玻璃珠、壳聚糖或二氧化硅修饰的各类载体。

具体方案为：所述核酸提取组合物包括结合液、清洗液，其组分、浓度及其pH对提取结果具有重要的影响。所述核酸提取试剂包含裂解液、加强剂、结合液、清洗液、洗脱液。所述裂解液包括异硫氰酸胍、TritonX-100；所述加强剂包括蛋白酶k、海藻糖、氯化钙；所述结合液包括糖原、MOPS、多胺类、硫酸氢钠、TCEP；所述清洗液包括盐酸胍、醋酸钾、糖原、MOPS、多胺类、硫酸氢钠；所述洗脱液包括氢氧化钠、1×TE溶液。

进一步的所述裂解液中异硫氰酸胍浓度为2M~8M；TritonX-100浓度为5%~20%（v/v）；溶液pH为3~6。

进一步的所述加强剂蛋白酶k浓度为10mg-25mg；海藻糖浓度为3%~12%（m/v）；氯化钙浓度为5mM~20mM。

进一步的所述结合液中糖原浓度为0.1%~1%（m/v）；MOPS浓度为10mM~20mM；多胺类物质可为精胺、亚精胺、丁二胺，浓度为0.1%~2%（m/v）；TCEP浓度为5mM~50mM；用硫酸氢钠调节溶液pH至8.5~10。

进一步的所述清洗液中盐酸胍浓度为0.05M~0.6M；醋酸钾浓度为0.05M~0.5M；糖原浓度为0.01%~0.1%（m/v）；MOPS浓度为1mM~2mM；精胺或亚精胺浓度为0.01%~0.3%（m/v）；用硫酸氢钠调节溶液pH至5~6。

进一步的所述洗脱液用氢氧化钠调节1×TE溶液的pH至8~10。

对各组分进行不同浓度的调整或pH调整；或替换一些盐离子，比如将醋酸钾换位氯化钠、氯化镁等盐离子，均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

本发明提供的提取试剂的试剂组分特别包括结合液、清洗液的成分、浓度以及pH；试剂在多种核酸吸附载体应用，其包含硅基吸附柱、磁珠、玻璃珠、壳聚糖或二氧化硅修饰的各类载体。实现了从血、尿、唾液、咽拭子保存液、痰液等样本中提取纯化细菌、病毒的DNA及RNA，全程无有机溶剂，从样本获得到获取核酸最快可10min内完成，具有很好的科研、临床应用价值。

本发明提供的核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒中所用原料、试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

核酸提取试剂包括：

裂解液：异硫氰酸胍浓度为4M、TritonX-100浓度为20%（v/v）,溶液pH=6.0

结合液：糖原浓度为0.5%（m/v）、MOPS浓度为20mM、精胺浓度为0.5%（m/v）、TCEP浓度为6mM，pH=9.5。

清洗液：盐酸胍浓度为0.1M、醋酸甲浓度为0.15M、糖原浓度为0.05%（m/v）、MOPS浓度为2mM、精胺浓度为0.2%（m/v）、pH=6.0。

加强剂：蛋白酶k浓度为20mg/ml、海藻糖为6%（m/v）、氯化钙浓度5mM。

洗脱液：1×TE pH=10.0。

提取效果：用唾液（样本来源于博奥生物健康员工）稀释厦门致善构建的EV71假病毒，使唾液中的假病毒浓度为1000拷贝/µL、100拷贝/µL、10拷贝/µL、0拷贝/µL备用；取200µL各浓度病毒混合液，加入200µL裂解液、400µL结合液、20µL加强液，混匀，室温静置8min，将全部液体转移至离心柱，13000rpm离心1min、弃废液，向离心柱中加入200µL清洗液，13000rpm离心1min，重复一次该操作；将离心柱转移至核酸收集管，加入50µL的洗脱液，13000rpm离心1min。将回收的核酸用于RT-LAMP检测，用荣研的RT-LAMP试剂盒进行扩增；扩增体系比例为5µL 2×Buffer、1.09µL引物、0.24µL EvaGreen染料、1.2µL混合酶、0.47µL水、2µL提取纯化的核酸，检测程序为65℃，60min。

EV71引物序列为：

EV71-F3 TGCGAGTGCTTATCAATGGT（如SEQ ID No.1所示）；

EV71-B3 AGTTCTGGTTACGCATCGG（如SEQ ID No.2所示）；

EV71-FIP ACTGAGAACGTGCCCATCATGTATCCCACATTCGGAGAACAC（如SEQ ID No.3所示）；

EV71-BIP CTGTGGGGACCTCCAAGTCCAAGGTATCCACGCCCTGAC（如SEQ ID No.4所示）；

EV71-Lf CGTATTCAAGATCTTTCTCCTGTTT（如SEQ ID No.5所示）；

EV71-Lb AGTACCCTTTAGTGGTTAGGATT（如SEQ ID No.6所示）；

扩增结果如图1（A）~（D）所示。

实施例2

裂解液：异硫氰酸胍浓度为6M、TritonX-100浓度为20%（v/v）,溶液pH=6.0

结合液：糖原浓度为0.1%（m/v）、MOPS浓度为20mM、精胺浓度为0.1%（m/v）、TCEP浓度为10mM，pH=9.6。

清洗液：盐酸胍浓度为0.05M、醋酸甲浓度为0.05M、糖原浓度为0.01%（m/v）、MOPS浓度为1mM、精胺浓度为0.01%（m/v）、pH=6.0。

洗脱液：1×TE pH=10.0。

EV71引物序列为：

EV71-F3 TGCGAGTGCTTATCAATGGT（如SEQ ID No.7所示）；

EV71-B3 AGTTCTGGTTACGCATCGG（如SEQ ID No.8所示）；

EV71-FIP ACTGAGAACGTGCCCATCATGTATCCCACATTCGGAGAACAC（如SEQ ID No.9所示）；

EV71-BIP CTGTGGGGACCTCCAAGTCCAAGGTATCCACGCCCTGAC（如SEQ ID No.10所示）；

EV71-Lf CGTATTCAAGATCTTTCTCCTGTTT（如SEQ ID No.11所示）；

EV71-Lb AGTACCCTTTAGTGGTTAGGATT（如SEQ ID No.12所示）；

扩增结果如图2（A）~（D）所示。

实施例3

裂解液：异硫氰酸胍浓度为6M、TritonX-100浓度为5%（v/v），溶液pH=6.0。

结合液：糖原浓度为1%（m/v）、MOPS浓度为20mM、精胺浓度为2%（m/v）、TCEP浓度为10mM，pH=9.6。

清洗液：盐酸胍浓度为0.6M、醋酸甲浓度为0.5M、糖原浓度为0.1%（m/v）、MOPS浓度为2mM、精胺浓度为0.3%（m/v）、pH=5.0。

洗脱液：1×TE pH=10.0。

EV71引物序列为：

EV71-F3 TGCGAGTGCTTATCAATGGT（如SEQ ID No.13所示）；

EV71-B3 AGTTCTGGTTACGCATCGG（如SEQ ID No.14所示）；

EV71-FIP ACTGAGAACGTGCCCATCATGTATCCCACATTCGGAGAACAC（如SEQ ID No.15所示）；

EV71-BIP CTGTGGGGACCTCCAAGTCCAAGGTATCCACGCCCTGAC（如SEQ ID No.16所示）；

EV71-Lf CGTATTCAAGATCTTTCTCCTGTTT（如SEQ ID No.17所示）；

EV71-Lb AGTACCCTTTAGTGGTTAGGATT（如SEQ ID No.18所示）；

扩增结果如图3（A）~（D）所示。

实施例4 从多种样本中提取的RNA扩增效果

所用试剂组分为：

裂解液：硫氰酸胍浓度为4M，TritonX-100浓度为20%（v/v），溶液pH=6.0；

结合液：糖原浓度为0.5%（m/v）、MOPS浓度为10mM、精胺浓度为0.1%（m/v）、TCEP浓度为6mM，pH=9.5；

清洗液：盐酸胍浓度为0.05M、醋酸钾浓度为0.15M、糖原浓度为0.01%（m/v）、MOPS浓度为1mM；精胺浓度为0.01%（m/v），pH=6.0；

洗脱液：pH=10的1×TE溶液；

加强剂：蛋白酶k浓度为20mg；海藻糖浓度为6%（m/v）；氯化钙浓度为5mM。

为了评估核酸提取试剂对不同样本的提取能力的区别，选取唾液样本及尿液样本作为评估样本，用EV71装甲RNA作为评估质控品，用荣研RT-LAMP扩增试剂作为检测试剂，具体扩增体系为：5µL 2×Buffer、1.09µL引物、0.24µL EvaGreen染料、1.2µL混合酶、0.47µL水、2µL提取纯化的核酸。

取198 µL唾液、198 µL尿液，向两管样本中加入2 µL 10⁶copies/ µL的EV71装甲RNA，使装甲RNA在样本的浓度为10⁴ copies/ µL。向两管样本中加入200 µL裂解液、400 µL结合液、20 µL加强剂混合后55℃加热15 min，将裂解后的液体全部转移至离心吸附柱，13000 rpm离心40 s；将离心吸附柱转移至新的废液收集管中，加入200 µL清洗液，13000rpm离心40 s，清洗两次；换核酸收集管。加入50 µL洗脱液，13000 rpm离心40 s，弃离心吸附柱，回收核酸。将回收的核酸取2µL与荣研RT-LAMP扩增试剂(5µL 2×Buffer、1.09µL引物、0.24µL EvaGreen染料、1.2µL混合酶、0.47µL水)混合，65℃扩增60 min。扩增结果显示，提取试剂对唾液及尿液样本中的核酸回收效果无明显差别。结果如图4（A）~图4（B）所示。

实施例5 对不同浓度的病毒核酸提取效果

所用试剂组分为：

裂解液：硫氰酸胍浓度为4M，TritonX-100浓度为20%（v/v），溶液pH=6.0

结合液：糖原浓度为1%（m/v）、MOPS浓度为20mM、精胺浓度为0.5%（m/v）、TCEP浓度为20mM，pH=9.5。

清洗液：盐酸胍浓度为0.6M、醋酸钾浓度为0.5M、糖原浓度为1%（m/v）、MOPS浓度为1mM；精胺浓度为0.3%（m/v），pH=6.0

洗脱液：pH=10的1×TE溶液

为了评估核酸提取试剂对不同病毒载量的样本提取效果，选取鸭瘟病毒作为标准质控品，唾液样本作为测试样本类型。取3管1.5 mL EP管，取同一管唾液，在3个EP管中加入198 µL，加入2 µL不同浓度鸭瘟病毒，使三管唾液中鸭瘟病毒含量分别1000 copies/ µL、100 copies/ µL、10 copies/ µL。向三管样本中加入200 µL裂解液、400 µL结合液液、20 µL增强剂，混合后55℃加热15 min，将裂解后的液体全部转移至离心吸附柱，13000 rpm离心40 s；将离心吸附柱转移至新的废液收集管中，加入200 µL清洗液，13000 rpm离心40 s，清洗两次；换核酸收集管。加入50 µL洗脱液，13000 rpm离心40 s，弃离心吸附柱，回收核酸。将回收的核酸与LAMP试剂混合，65℃扩增60 min。扩增结果显示，核酸提取试剂可以从低病毒载量的样本中获得目标核酸。

表1 鸭瘟病毒引物序列

测试结果如图5（A）~图5（C）所示。

实施例6 提取的核酸可适宜LAMP、RT-LAMP、NASBA、PCR、RT-PCR等扩增反应

所用试剂组分为：

结合液：糖原浓度为0.5%（m/v）、MOPS浓度为10mM、精胺浓度为0.1%（m/v）、TCEP浓度为6mM，pH=9.5。

清洗液：盐酸胍浓度为0.05M、醋酸钾浓度为0.15M、糖原浓度为0.01%（m/v）、MOPS浓度为1mM；精胺浓度为0.01%（m/v），pH=6.0

洗脱液：pH=10的1×TE溶液

为了验证提取试剂能否用于多种生物扩增检测方法，选取RT-LAMP，NASBA、RT-PCR三种扩增方法进行验证。RT-LAMP扩增的核酸来自提取的北京出入境口岸国际旅行卫生保健中心提供的流感阳性样本，NASBA扩增核酸来自本提取试剂提取的某医院提供的咽拭子保存液样本，RT-PCR扩增的核酸来自本提取试剂提取的某医院提供的咽拭子保存液样本。RT-LAMP扩增体系为购买的日本荣研株式会社的商品试剂盒，扩增引物为博奥开发流感病毒RT-LAMP引物，扩增体系比例为5µL 2×Buffer、1.09µL引物、0.24µL EvaGreen染料、1.2µL混合酶、0.47µL水、2µL提取纯化的核酸，检测程序为65℃，60min；NASBA扩增为博奥生产的病毒检测芯片，其扩增试剂与核酸的比例为30µL NASBA体系、20µL提取的核酸，42℃扩增45min；RT-PCR试剂由博奥生物提供甲型流感检测试剂，20µLPCR体系、5µL提取纯化后的模板，扩增程序为48℃20min、95℃5min、95℃10S 60℃30S 45个循环；结果显示，本提取试剂提取的核酸可适宜多种生物扩增检测方法。结果如图6（A）~图6（C）所示。

流感RT-LAMP引物序列

NA1.F3 TATATACAGTAAAGACAA（如SEQ ID No.25所示）；

NA1.B3 AGAGGGAACTTCACCAATA（如SEQ ID No.26所示）；

NA1.FIP ATTCCAAGGGGGAGCATGATATCAGTGTAAGAATCGGTTCCAAG（如SEQ ID No.27所示）；

NA1.BIP TGCTAAATGACAAACATTCCAATGACAGCTCATTAGGGTTCGAT（如SEQ ID No.28所示）；

NA1.LF TGGTTCCCTTATGACAA（如SEQ ID No.29所示）；

NA1.LB AACCATTAAAGACAGGAGC（如SEQ ID No.30所示）；

RT-PCR引物序列

F： ACGTACGTTCTCTCTATC（如SEQ ID No.31所示）；

R: ACTGATTCCCCTAAAATC（如SEQ ID No.32所示）。

实施例7 与商业化试剂盒对比

所用试剂组分为：

洗脱液：pH=10的1×TE溶液

为了对比本提取试剂与商品化的试剂盒的提取效果差异，选择凯杰QIAamp病毒RNA提取试剂盒（货号：52904）进行比较。两试剂盒均提取200 µL含有40000 拷贝的装甲RNA、4000拷贝的装甲RNA、400拷贝的装甲RNA、40拷贝的装甲RNA，洗脱液均为50 µL，将两试剂盒提取后的核酸取等量作为模板，用同一批配制的RT-LAMP扩增体系进行扩增。凯杰试剂盒操作步骤：25µL PK+200µL装甲RNA +200µLBufferAL，56℃15min，瞬时离心，加入250µL无水乙醇，震荡混匀，室温静置5min，瞬时离心，取出液体，加入离心吸附柱中，离心1min，弃废液和废液管+500µLAW1，离心1min，弃废液和废液管，+500µLAW2，离心1min，弃废液和废液管，+500µL无水乙醇，离心1min，弃废液和废液管，离心3min（13000rpm），弃废液和废液管，56℃、开盖，3min干燥硅膜，换1.5ml离心管收集，+50µLBufferATE，室温孵育1min，离心1min（（13000rpm）），-20℃保存。扩增结果显示，本核酸提取试剂在高浓度病毒数下与凯杰的试剂盒相当（4000拷贝），在低病毒数下优于凯杰（400拷贝、40拷贝）。实验结果如图7（A）~图7（F）所示。

实施例8 特异性实验

核酸提取试剂包括：

结合液：糖原浓度为0.3%（m/v）、MOPS浓度为20mM、精胺浓度为0.5%（m/v）、TCEP浓度为6mM，pH=9.5。

清洗液：盐酸胍浓度为0.15M、醋酸甲浓度为0.15M、糖原浓度为0.05%（m/v）、MOPS浓度为2mM、精胺浓度为0.1%（m/v）、pH=6.0。

为了考察本方法提取核酸的特异性，取200µL唾液（博奥生物健康员工）、200µL裂解液、400µL结合液、20µL加强剂混合后，全部转移过柱，200µL清洗液清洗两次、50µL洗脱液进行洗脱，将洗脱后的洗脱液当做模板，用LAMP方法进行检测，检测的指标为EV71、鸭瘟、甲型流感H1N1；扩增体系比例为5µL 2×Buffer、1.09µL引物、0.24µL EvaGreen染料、1.2µL混合酶、0.47µL水、2µL提取纯化的核酸，检测程序为65℃，40min。

结果显示，EV71、鸭瘟、甲型流感H1N1均未起峰，说明核酸提取纯化试剂提取的核酸特异性良好。结果如图8（A）-（C）。

实施例9：本试剂全密闭集成芯片的应用

将本发明实施例1提供的试剂中的清洗液、洗脱液以液体形式存储在全集成芯片上，将结合液、加强剂以冷冻干燥小球的方式存储在芯片上；取600µL 甲型流感阳性唾液样本（北京国际旅行卫生保健中心）与200µL 裂解液混合，混合后全部加入至全密闭集成芯片进行检测，放入仪器进行全自动检测。集成芯片液体试剂存储示意图如图9所示；测试结果如图10所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 博奥生物集团有限公司

<120> 核酸提取组合物及其应用，含有该核酸提取组合物的试剂、试剂盒

<130> MP2004111

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcgagtgct tatcaatggt 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttctggtt acgcatcgg 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgagaacg tgcccatcat gtatcccaca ttcggagaac ac 42

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtggggac ctccaagtcc aaggtatcca cgccctgac 39

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtattcaag atctttctcc tgttt 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtacccttt agtggttagg att 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcgagtgct tatcaatggt 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agttctggtt acgcatcgg 19

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actgagaacg tgcccatcat gtatcccaca ttcggagaac ac 42

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgtggggac ctccaagtcc aaggtatcca cgccctgac 39

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtattcaag atctttctcc tgttt 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtacccttt agtggttagg att 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcgagtgct tatcaatggt 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agttctggtt acgcatcgg 19

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actgagaacg tgcccatcat gtatcccaca ttcggagaac ac 42

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgtggggac ctccaagtcc aaggtatcca cgccctgac 39

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgtattcaag atctttctcc tgttt 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agtacccttt agtggttagg att 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acataccaag ttatgcagat ga 22

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cctccgaacg atatgcttc 19

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctacctcttg accctgatta tttgtaagct tagattatct agtttgtggg aacag 55

<210> 22

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

actctaatag cgcaataact ctcctgaatt cttaccacaa accccaagc 49

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

catcttgaaa caacgcacta gttc 24

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttttttctct gtattgcgtg tacgg 25

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tatatacagt aaagacaa 18

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agagggaact tcaccaata 19

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

attccaaggg ggagcatgat atcagtgtaa gaatcggttc caag 44

<210> 28

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgctaaatga caaacattcc aatgacagct cattagggtt cgat 44

<210> 29

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tggttccctt atgacaa 17

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aaccattaaa gacaggagc 19

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

acgtacgttc tctctatc 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

actgattccc ctaaaatc 18

Claims

1.核酸提取组合物，其特征在于，由结合液、清洗液、裂解液、加强剂、洗脱液组成；所述结合液为糖原、MOPS、多胺类物质、TCEP的组合物；所述清洗液为盐酸胍、醋酸钾、糖原、MOPS、多胺类物质的组合物；

所述结合液中糖原浓度为0.1%~1%（m/v）；MOPS浓度为10mM~20mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.1%~2%（m/v）；TCEP浓度为5mM~50mM；

所述结合液的pH为8.5~10；

所述清洗液中盐酸胍浓度为0.05M~0.6M；醋酸钾浓度为0.05M~0.5M；糖原浓度为0.01%~0.1%（m/v）；MOPS浓度为1mM~2mM；多胺类物质包括精胺、亚精胺、丁二胺中的一种或两者以上的组合物，浓度为0.01%~0.3%（m/v）；

所述清洗液的pH为5~6；

所述裂解液选自异硫氰酸胍、TritonX-100中的一种或两者的混合物；

所述加强剂选自蛋白酶k、海藻糖、氯化钙中的一种或两者以上的混合物；

所述洗脱液选自氢氧化钠、1×TE溶液中的一种或两者的混合物；

所述裂解液中异硫氰酸胍浓度为2M~8M；TritonX-100浓度为5%~20%（v/v）；pH值为3~6；和/或

所述洗脱液用氢氧化钠调节1×TE溶液的pH值为8~10；

不包括挥发性有机溶剂。

2.如权利要求1所述的核酸提取组合物在制备核酸提取和/或核酸检测的工具中的应用；所述工具包括试剂和/或试剂盒。

3.核酸提取试剂或核酸检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的核酸提取组合物以及检测中可接受的试剂。

4.核酸提取试剂盒或核酸检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的核酸提取组合物或如权利要求3所述的核酸提取试剂或核酸检测试剂以及检测中可接受的试剂或载体。

5.如权利要求4所述的核酸提取试剂盒或核酸检测试剂盒，其特征在于，所述载体包括硅基吸附柱、磁珠、玻璃珠、壳聚糖或二氧化硅修饰的载体。

6.用于非诊断目的的核酸提取方法或核酸检测方法，其特征在于，取待测样本与如权利要求1所述的核酸提取组合物或如权利要求3所述的核酸提取试剂或核酸检测试剂混合，提取和/或检测。