KR102362106B1 - 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

철피석곡 꽃 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 a) 철피석곡 줄기를 효소 처리해서 천연 배지를 제조하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 얻은 천연배지에 유산균을 접종 및 배양하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 유산균 배양액에 철피석곡 꽃을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법, 및 상기 제조방법으로 제조된 철피석곡 꽃 발효물을 포함하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 천연배지가 아닌 MRS 배지에서 유산균 배양하여 철피석곡 꽃을 발효시키거나 철피석곡 꽃을 정제수로 추출한 것보다 피부탄력개선, 피부보습 및 피부장벽강화 효과가 높게 나타나므로, Collagen Type 1과 Elastin의 발현을 유도하여 피부탄력을 증진시키고, 피부 Tight Junction Protein을 강화시켜 피부장벽을 탄탄하게 하고, 피부속 NMF 생성을 유도시킴으로써 피부 속부터 보습감을 채워주는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

철피석곡 꽃 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 포함하는 화장료 조성물{METHOD FOR PREPARING FERMENTED DENDROBIUM CANDIDUM FLOWER AND COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE FERMENTED DENDROBIUM CANDIDUM FLOWER}
본 발명은 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 a) 철피석곡 줄기를 효소 처리해서 천연 배지를 제조하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 얻은 천연배지에 유산균을 접종 및 배양하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 유산균 배양액에 철피석곡 꽃을 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법, 및 상기 제조방법으로 제조된 철피석곡 꽃 발효물을 포함하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
철피석곡(Dendrobium Candidum)은 외떡잎식물 난초목 난초과에 속하며 상록의 여러해살이 풀로서 바위나 죽은 나무 줄기에 붙어서 자라며 뿌리줄기에서 굵은 뿌리가 많이 나온다. 철피석곡은 주로 중국과 한국에 분포하며, 다당체와 당체(glycone) 형태의 폴리페놀(polyphenol), 덴드로칸딘(dendrocandin) 등이 함유되어 있다고 보고 되어 있다. 또한, 지표물질 혹은 유효물질로서 덴드로칸딘 C, D 및 E가 알려져 있다. 중국과 한국의 의학서에는 위장의 열을 제거하거나 낮추거나, 진액을 생기게 하고 갈증을 없애 준다거나, 근골을 튼튼하게 해주며, 당뇨병과 야맹증, 고협압에 효과가 있다고 전해진다.
최근 철피석곡 꽃 추출물을 포함하는 화장료 조성물이 개발되어 주름 개선, 피부 미백, 피부 트러블 개선, 또는 피부 보습 등의 피부 개선 효과가 공개되었으며(KR 10-2019-0026175 A), 바실러스균 또는 유산균으로 발효된 철피석곡 발효물을 포함하는 화장료 조성물이 개발되어 피부 주름 개선 및 미백 효능을 공개하였다 (KR 10-2019-0094642 A). 그러나, 철피석곡 꽃의 추출물이나 단순한 발효물은 그 피부 개선 효과가 미약하여 화장료 조성물의 원료로 사용되기에는 부족한 점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 철피석곡 줄기를 효소처리한 천연배지에 유산균을 배양한 후 철피석곡 꽃을 발효시킨 경우, 종래 철피석곡 추출물이나 발효물보다 우수한 피부탄력개선, 피부보습 및 피부장벽강화 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따르면, 천연배지가 아닌 MRS 배지에서 유산균 배양하여 철피석곡 꽃을 발효시키거나 철피석곡 꽃을 정제수로 추출한 것보다 피부탄력개선, 피부보습 및 피부장벽강화 효과가 높게 나타나므로, Collagen Type 1과 Elastin의 발현을 유도하여 피부탄력을 증진시키고, 피부 Tight Junction Protein을 강화시켜 피부장벽을 탄탄하게 하고, 피부속 NMF 생성을 유도시킴으로써 피부 속부터 보습감을 채워주는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
KR 10-2019-0026175 A KR 10-2019-0094642 A
따라서, 본 발명의 주된 목적은 종래 방법보다 우수한 피부 개선 효과를 갖는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 철피석곡 꽃 발효물을 포함하는 피부탄력개선, 피부보습 및 피부장벽강화용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음단계들을 포함하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
a) 철피석곡 줄기를 효소 처리해서 천연 배지를 제조하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 얻은 천연배지에 유산균을 접종 및 배양하는 단계; 및,
c) 상기 b) 단계에서 유산균 배양액에 철피석곡 꽃을 첨가하여 발효시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계에서 상기 효소는 철피석곡 줄기를 분해할 수 있는 어떤 효소도 가능하나, 바람직하게는 셀룰라아제(Cellulase)인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서 상기 유산균은 철피석곡 을 발효시킬 수 있는 어떤 유산균도 가능하나, 바람직하게는 비피도박테리움(Bifidobacterium)인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 c) 단계에서 상기 유산균 배양액은 OD 값이 0.1 내지 2.0 인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다. 상기 OD값 범위에서 철피석곡을 발효시키기에 적당한 유산균 종균수를 가지며, 상기 OD값 범위보다 작으면 발효 진행이 잘 안되고, 상기 OD값 범위보다 크면 pH 및 취에 문제가 생긴다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따라 제조된 철피석곡 꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 철피석곡 꽃 발효물을 0.001 내지 1.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 콜라겐 타입 1(Collagen Type 1)과 엘라스틴(Elastin)의 발현을 증가시켜 피부탄력을 증진시키는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 피부속 NMF(Natural Moisturizing Factors) 생성을 유도시킴으로써 피부속 보습감을 채워주는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 타이트 정션 단백질(Tight junction protein)을 강화시킴으로써 피부 장벽을 강화시키는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 철피석곡 꽃 발효물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 용매, 안정화제, 용해화제, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프, 린스로 구성된 군에서 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다. 이러한 화장료 조성물의 제형예에 상관없이 본 발명의 철피석곡 꽃 발효물을 함유하는 한 본 발명의 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화 효과를 발휘할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 철피석곡, 특히 철피석곡 줄기를 효소반응시켜 얻은 추출물을 천연 배지원으로 하여 철피석곡 꽃을 유산균 발효시킨 철피석곡 꽃 발효물을 제조하였으며, 그 발효물을 피부탄력, 보습 및 피부장벽 강화 효능을 나타내는 화장료 조성물을 제조하였다.
본 발명자들은 단순 물로 추출한 철피석곡 꽃 추출물이나 MRS 배지에서 철피석곡 꽃을 유산균 발효시킨 발효물에 대비하여, 철피석곡 줄기를 효소반응 시켜 얻은 추출물을 천연 배지로 하여 철피석곡 꽃을 유산균 발효시킨 발효물이 피부 개선 효능에 탁월함을 확인하고, 혐기 조건에서 특정 균수가 확보된 균액으로 최대의 효능을 보이는 생산 공정을 확보하였다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음단계들을 포함하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
a) 철피석곡 줄기를 효소 처리해서 천연 배지를 제조하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 얻은 천연배지에 유산균을 접종 및 배양하는 단계; 및,
c) 상기 b) 단계에서 유산균 배양액에 철피석곡 꽃을 첨가하여 발효시키는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계에서 상기 효소는 철피석곡 줄기를 분해할 수 있는 어떤 효소도 가능하나, 바람직하게는 셀룰라아제(Cellulase)인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서 상기 유산균은 철피석곡 을 발효시킬 수 있는 어떤 유산균도 가능하나, 바람직하게는 비피도박테리움(Bifidobacterium)인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 c) 단계에서 상기 유산균 배양액은 OD 값이 0.1 내지 2.0 인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법을 제공한다. 상기 OD값 범위에서 철피석곡을 발효시키기에 적당한 유산균 종균수를 가지며, 상기 OD값 범위보다 작으면 발효 진행이 잘 안되고, 상기 OD값 범위보다 크면 pH 및 취에 문제가 생긴다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따라 제조된 철피석곡 꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 철피석곡 꽃 발효물을 0.001 내지 1.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 콜라겐 타입 1(Collagen Type 1)과 엘라스틴(Elastin)의 발현을 증가시켜 피부탄력을 증진시키는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 피부속 NMF(Natural Moisturizing Factors) 생성을 유도시킴으로써 피부속 보습감을 채워주는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 조성물은 타이트 정션 단백질(Tight junction protein)을 강화시킴으로써 피부 장벽을 강화시키는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 철피석곡 꽃 발효물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 용매, 안정화제, 용해화제, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프, 린스로 구성된 군에서 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다. 이러한 화장료 조성물의 제형예에 상관없이 본 발명의 철피석곡 꽃 발효물을 함유하는 한 본 발명의 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화 효과를 발휘할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 철피석곡, 특히 철피석곡 줄기를 효소반응시켜 얻은 추출물을 천연 배지원으로 하여 철피석곡 꽃을 유산균 발효시킨 철피석곡 꽃 발효물을 제조하였으며, 그 발효물을 피부탄력, 보습 및 피부장벽 강화 효능을 나타내는 화장료 조성물을 제조하였다.
본 발명자들은 단순 물로 추출한 철피석곡 꽃 추출물이나 MRS 배지에서 철피석곡 꽃을 유산균 발효시킨 발효물에 대비하여, 철피석곡 줄기를 효소반응 시켜 얻은 추출물을 천연 배지로 하여 철피석곡 꽃을 유산균 발효시킨 발효물이 피부 개선 효능에 탁월함을 확인하고, 혐기 조건에서 특정 균수가 확보된 균액으로 최대의 효능을 보이는 생산 공정을 확보하였다.
도 1은 실시예와 비교예의 피부탄력효능을 비교 평가하기 위해 Collagen Type 1의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 2는 실시예와 비교예의 피부탄력효능을 비교 평가하기 위해 Elastin의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 3은 실시예와 비교예의 피부보습효능을 비교 평가하기 위해 Hyaluronic acid synthase-2(HAS-2)의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 4는 실시예와 비교예의 피부보습효능을 비교 평가하기 위해 pro Filaggrin의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 5는 실시예와 비교예의 피부보습효능을 비교 평가하기 위해 caspase-14의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 6은 실시예와 비교예의 피부장벽강화효능을 비교 평가하기 위해 Claudin-1 (CLDN-1)의 발현량을 측정한 그래프이다.
도 7은 실시예와 비교예의 피부장벽강화효능을 비교 평가하기 위해 Occludin (OCDN)의 발현량을 측정한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 철피석곡 줄기를 효소처리해서 천연배지를 제조하는 단계
철피석곡 (건조, 줄기) 파우더 1kg을 Cellulase TC 100g으로 50℃의 온도에서 정제수 10kg로 1일간 효소반응하고, 고온/고압 처리 조건으로 효소반응을 종결시킨 후 여과한다. 여액을 최종적으로 고형분 1.0 내지 10.0 중량%가 되도록 농축한 상태의 농축액을 철피석곡 천연 액상배지로 한다.
실시예 2. 실시예 1에서 얻은 천연배지에 유산균을 접종/배양 하는 단계
본 발명에서는 Bifidobacterium을 배양 증식하였다. MRS Broth 배지에 KCCM 미생물보존센터로부터 분양 받은 동결건조 상태의 Bifidobacterium 균주를 접종 후, 10내지 50℃에서 3일 내지 5일간 배양하였다. 상기 종균 배양액을 세척 후 실시예 1에서 얻은 철피석곡 줄기를 효소처리하여 제조한 천연배지에 50내지 80 중량%가 되도록 첨가하여 10 내지 50℃ 혐기조건에서 3일 내지 5일간 유산균 발효를 하였다.
실시예 3. 특정 균수가 확보된 균액으로 철피석곡 꽃을 발효하는 단계
상기 실시예 2에서 얻은 유산균 배양액을 600nm 파장에서 흡광도(Absorbance Density)를 측정한 결과 OD 0.1 내지 2.0 인 것을 기준으로 하였다.
OD 수치값이 0.1 내지 2.0 인 때에, 유산균 배양액 무게 대비 1.0 내지 10 중량%에 해당하는 무게의 철피석곡 (건조, 멸균) 꽃 분쇄물을 첨가한다. 산소를 제거하고 질소를 충전한 혐기조건, 30내지 40℃, 정치배양 조건에서 1일 내지 7일간 유산균 발효를 하여 유산균으로 철피석곡 발효 추출물을 얻었다.
비교예 1. 실시예 1내지 3을 통해 얻어진 발효물(A), MRS배지를 활용하여 철피석곡 을 발효한 발효물(B), 정제수로 추출한 추출물(C)
A) 실시예 1 내지 3을 통해 철피석곡 꽃 발효물을 제조하였다. 구체적으로, 철피석곡 (건조, 줄기) 파우더 1kg을 Cellulase TC 100g으로 50℃의 온도에서 정제수 10kg로 1일간 효소반응하고, 고온/고압 처리 조건으로 효소반응을 종결시킨 후 여과한다. 여액을 고형분 0.1 내지 10.0 중량%가 되도록 농축한 것을 천연배지로 하여 Bifidobacterium을 접종 배양한 후 유산균 배양액 대비 1.0 내지 10 중량%의 철피석곡 꽃을 첨가하여 2일간 혐기조건에서 유산균 발효한다. 발효액을 여과 후 농축하여 최종적으로 파우더 45g을 얻었다.
B) 실시예 1의 천연배지를 MRS배지로 치환하고 나머지 실시예 2, 3을 동일하게 하여 철피석곡 꽃 발효물을 제조하였다. 구체적으로, MRS Broth 배지에 KCCM 미생물보존센터로부터 분양 받은 동결건조 상태의 Bifidobacterium 균주를 접종 후, 10 내지 50℃에서 3일 내지 5일간 배양하였다. 유산균 배양액량 대비 1.0 내지 10 중량%의 철피석곡 꽃을 첨가하여 2일간 혐기조건에서 유산균 발효한다. 발효액을 여과 후 농축하여 최종적으로 파우더 55g을 얻었다.
C) 실시예 1, 2, 3의 유산균 발효가 아닌 철피석곡 꽃 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 철피석곡 1kg을 정제수 10kg으로 1일간 50℃ 조건에서 추출하여 얻은 추출액을 여과 후 농축하여 최종적으로 철피석곡 꽃 추출물 파우더 120g을 얻었다.
비교예 2. 천연배지에서 균주를 배양한 배양액(A)과 MRS 배지에 균주를 배양한 배양액(B)
A) 실시예 3을 생략하고 실시예 1, 2만의 배양액을 제조하였다. 구체적으로, 철피석곡 (건조, 줄기) 파우더 1kg을 Cellulase TC 100g으로 50℃의 온도에서 정제수 10kg로 1일간 효소반응하고, 고온/고압 처리 조건으로 효소반응을 종결시킨 후 여과한다. 여액을 고형분 0.1 내지 10.0 중량%가 되도록 농축한 것을 천연배지로 하여 Bifidobacterium을 접종한 후 10 내지 50℃ 혐기조건에서 3일 내지 5일간 유산균 발효를 하였다. 발효액을 여과 후 농축하여 최종적으로 파우더 41g을 얻었다.
B) 실시예 1, 3을 생략하고 실시예 2만의 배양액을 제조하였다. 구체적으로, MRS Broth 배지에 KCCM 미생물보존센터로부터 분양 받은 동결건조 상태의 Bifidobacterium 균주를 접종 후, 10내지 50
Figure 112021032322098-pat00001
에서 3일 내지 5일간 배양하였다. 배양액을 여과 후 농축하여 최종적으로 파우더 16g을 얻었다.
<실험예 1: 피부 탄력 효능평가 - Collagen Type I과 Elastin 발현 조사>
본 실험 예에서는 상기 실시예 1 내지 3과 비교예 1 내지 2 추출물의 피부 탄력 효능을 확인하기 위해 Real time PCR을 수행하였다.
Cell plate에 Fibroblast cell을 접종하여 24시간 배양한 뒤, 배양된 세포의 배지를 serum free 배지로 교체하고 시료를 최종 농도가 50 μg/ml이 되도록 세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 세포를 QIAzol?? Lysis Reagent (Qiagen)로 모아 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-Time PCR을 실시하였다. 이는 하기 표 1과 도 1, 도 2에 나타내었다.
시험군
(50 ppm) 		Collagen type I gene expression rate (%) Stdev. p-value Elastin gene expression rate (%) Stdev. p-value
대조군
(무처리군)		 100.0 0.00 1.0000 100.0 0.00 1.0000
비교예 1-A 175.2 3.60 0.0000 178.1 11.29 0.0003
비교예 1-B 150.8 4.18 0.0000 169.2 1.24 0.0000
비교예 1-C 132.7 3.92 0.0001 141.9 7.28 0.0006
비교예 2-A 145.1 2.73 0.0004 154.3 4.32 0.0003
비교예 2-B 139.7 2.61 0.0022 145.8 3.24 0.0012
각 시료에 대해 collagen type I 과 elastin의 발현을 확인한 결과, collagen type I과 elastin의 유전자 발현을 눈에 띄게 증가시킴으로써 비교예 1-A가 가장 뛰어난 피부 탄력 개선 효능을 보이는 것으로 확인 되었다.
<실험예 2. 피부 보습 효능평가 - Hyaluronic acid synthase-2 (HAS-2), 천연보습인자 관련 유전자 (pro Filaggrin과 caspase-14) 발현 조사>
본 실험 예에서는 상기 실시예 1 내지 3과 비교예 1 내지 2 추출물의 피부 보습 효능을 확인하기 위해 Real time PCR을 수행하였다
먼저 피부 속 보습 및 진피의 탄력에 관여하는 히알루론산에 대한 효능을 확인하기 위해 60 mm plate에 Fibroblast cell을 접종하여 24시간 배양한 뒤, 배양된 세포의 배지를 serum free 배지로 교체하고 시료를 최종 농도가 50 μg/ml이 되도록 세포에 처리하여 24시간 배양하였다. 그리고 피부 속 존재하는 천연보습인자에 대한 효능을 확인하기 위해 60mm plate에 Human normal keratinocyte cell 을 접종하여 24시간 배양한 뒤, 배양된 세포의 배지를 serum free 배지로 교체하고 시료의 최종 농도가 250 μg/ml이 되도록 세포에 처리하여 24시간 배양하였다.
배양한 세포를 QIAzol?? Lysis Reagent (Qiagen)로 모아 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-Time PCR을 실시하였다. 이는 하기 표 2와 도 3, 도 4, 도 5에 나타내었다.
시험군
(250 ppm) 		HAS-2 gene expression rate (%) Stdev. p-value Pro filaggrin gene expression rate (%) Stdev. p-value Caspase-14 gene expression rate (%) Stdev. p-value
대조군
(무처리군)		 100.0 0.00 1.0000 100.0 0.00 1.0000 100.0 0.00 1.0000
비교예 1-A 238.7 12.08 0.0000 187.4 18.59 0.0012 346.6 7.41 0.0000
비교예 1-B 201.8 8.62 0.0002 179.3 12.60 0.0025 297.2 6.22 0.0001
비교예 1-C 164.5 7.16 0.0004 156.9 17.79 0.0052 194.2 7.96 0.0000
비교예 2-A 194.2 4.82 0.0023 164.2 4.99 0.0002 246.1 1.28 0.0000
비교예 2-B 187.5 5.62 0.0008 150.4 2.32 0.0013 214.1 1.58 0.0007
각 시료에 대해 히알루론산 합성 효소 HAS-2과 천연보습인자(natural moisturizing factor) 형성 관련 유전자 두가지 caspase-14과 pro filaggrin의 발현을 확인하였다. 그 결과, 비교예 1-A처리군이 세가지 유전자에 대해 가장 뛰어난 효능을 보이는 것으로 나타났다. 따라서, 비교예 1-A는 피부 속부터 겉까지 히알루론산과 천연보습인자 합성을 유도시켜 보습인자로 꽉 채워줌으로써 피부 보습 원료로서 탁월한 효능을 가진 것으로 확인 되었다.
<실험예3. 피부 장벽 강화 효능 비교 실험 - 피부장벽 구성 요소 Tight junction protein 관련 유전자 (Claudin-1 (CLDN-1), Occludin (OCDN))발현 확인>
본 실험 예에서는 피부 장벽의 구성 성분 중 하나로 피부 장벽 기능에 매우 중요한 역할을 하는 tight junction protein 중 CLDN-1과 OCDN에 대한 상기 실시예 1 내지 3과 비교예 1 내지 2 추출물의 효능을 확인하기 위해 Real time PCR을 수행하였다.
60mm plate에 Human normal keratinocyte cell 을 접종하여 24시간 배양한 뒤, 배양된 세포의 배지를 serum free 배지로 교체하고 시료의 최종 농도가 250 μg/ml이 되도록 세포에 처리하여 24시간 배양하였다.
배양한 세포를 QIAzol?? Lysis Reagent (Qiagen)로 모아 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-Time PCR을 실시하였다. 이는 하기 표 3와 도 6, 도 7에 나타내었다.
시험군
(250 ppm) 		CLDN gene expression rate (%) Stdev. p-value OCDN gene expression rate (%) Stdev. p-value
대조군
(무처리군)		 100.0 0.00 1.0000 100.0 0.00 1.0000
비교예 1-A 140.2 9.99 0.0022 186.8 3.80 0.0000
비교예 1-B 138.4 4.28 0.0005 179.5 7.95 0.0278
비교예 1-C 130.8 8.64 0.0035 150.9 7.36 0.0003
비교예 2-A 135.4 4.10 0.0018 165.4 5.75 0.0023
비교예 2-B 132.4 5.97 0.0017 152.4 1.24 0.0001
그 결과, 비교예 1-A처리군이 CLDN-1과 OCDN의 발현 양을 가장 높게 증가시킴으로써 뛰어난 효능을 보이는 것으로 나타났다. 따라서, 비교예 1-A는 피부 장벽을 구성하는 구성성분을 강화시킴으로서 피부 장벽 기능에 긍정적인 효능을 보이는 원료로 확인 되었다.
본 발명에 대해 상기 실시예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 시중의 비싼 기성 배양 배지 조성물 보다 저렴하고, 피부 조성물의 제조 및 효능 측면에서도 월등한 효과를 나타내는 천연 액상배지를 제공할 수 있다. 또, 이상의 천연 액생배지를 활용하여 유산균 발효한 철피석곡 꽃 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 Collagen Type 1과 Elastin의 발현을 유도하여 피부탄력을 증진시키고, 피부 Tight Junction Protein을 강화시켜 피부장벽을 탄탄하게 하고, 피부속 NMF 생성을 유도시킴으로써 피부 속부터 보습감을 채워주는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Claims (9)

  1. 다음단계들을 포함하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법.
    a) 철피석곡 줄기의 건조 분말을 효소 처리해서 천연 배지를 제조하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 얻은 천연배지에 유산균을 접종 및 배양하는 단계; 및,
    c) 상기 b) 단계에서 유산균 배양액에 철피석곡 꽃의 분쇄물을 첨가하여 발효시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 상기 효소는 셀룰라아제(Cellulase)인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 상기 유산균은 비피도박테리움(Bifidobacterium)인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 상기 유산균 배양액은 OD 값이 0.1 내지 2.0 인 것을 특징으로 하는 철피석곡 꽃 발효물의 제조방법.
  5. 제1항에 따라 제조된 철피석곡 꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 철피석곡 꽃 발효물을 0.001 내지 1.0 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐 타입 1(Collagen Type 1)과 엘라스틴(Elastin)의 발현을 증가시켜 피부탄력을 증진시키는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 피부속 NMF(Natural Moisturizing Factors) 생성을 유도시킴으로써 피부속 보습감을 채워주는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 타이트 정션 단백질(Tight junction protein)을 강화시킴으로써 피부 장벽을 강화시키는 것을 특징으로 하는 피부탄력, 보습 또는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
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