KR20170137237A

KR20170137237A - 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라 kjj81 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법

Info

Publication number: KR20170137237A
Application number: KR1020160068705A
Authority: KR
Inventors: 서정아; 김민주; 캐롤 에밀리; 손호경; 강현아; 추진호
Original assignee: 숭실대학교산학협력단; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2016-06-02
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2017-12-13

Abstract

본 발명은 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주(KCTC18466P) 및 이를 이용한 전통주 제조방법에 관한 것으로서, 국내 전통주에서 분리한 효모균을 통해 우수한 발효능과 기능성을 가진 종균 개발에 필요한 유용 유전자원을 확보하고, 전통주의 표준화 및 고급화 공정에 활용할 수 있는 기반 기술 개발은 바이오산업에서의 국제 경쟁력 제고에 크게 기여할 것으로 예상된다.

Description

당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라 KJJ81 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법{Saccharomycopsis fibuligera KJJ81 strain with high saccharification and fermentation capability and the method for preparing makgeolli}

본 발명은 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주(KCTC18466P) 및 이를 이용한 막걸리 제조방법에 관한 것이다. 특히, 당화 및 발효능이 우수하나 유전체 해독이 미완료된 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera)의 참조유전체 서열 해독 및 유전체 분석에 관한 것이다.

우리나라는 오래전부터 김치, 술, 간장, 된장과 같이 전통발효 방법을 사용하여 다양한 발효식품을 제조해온 나라임에도 불구하고 국내 전통식품 관련 발효 미생물의 유전체 정보를 확보하고 이를 기반으로 하는 종균 개발 및 유용자원 활용 기술 개발 연구는 외국에 비해 상대적으로 미진하다. 국내 전통주 산업은 대표적인 2∼3개 업체를 제외하면 매우 영세한 규모로 운영되어 기본적인 품질관리조차 제대로 이루어지지 않는 업체가 대부분이다. 특히 아직 우수한 종균 발명이 미비한 관계로 매년 고액의 로열티가 해외 생물자원의 사용 대가로 지불되고 있다.

외국의 전통주와 달리 한국 전통주는 복합 누룩 균주에 의해 제조되고 있는데, 한국 전통주의 표준화, 과학화, 세계화를 위해서 핵심 종균들에 대한 참조유전체 정보의 확보가 필수적이다. 국내 전통주에서 분리한 효모균들을 대상으로 우수한 발효능과 기능성을 가진 종균 개발에 필요한 유용 유전자원을 확보하고, 전통주의 표준화 및 고급화 공정에 활용할 수 있는 기반 기술 개발은 바이오산업에서의 국제 경쟁력 제고에 크게 기여할 것이다.

참조유전체 해독을 통해 유용 형질과 관련된 유전자들을 발굴하고 관련 대사경로를 이해할 수 있으며 이를 기반으로 종 다양성 분석 연구를 수행하여 야생 균주 및 우량 형질 보유 균주들을 체계적으로 선발 및 확보하고, 더 나아가 우수 목표 형질을 가진 균주로의 개량이 필요하다.

국내에서 일부 모델 생물체로 활용되는 곰팡이 혹은 효모 대상의 오믹스 분석 연구는 진행된 바 있으나, 전통 주류 진핵 미생물에 관한 유전체 기반 오믹스 분석 연구는 미비한 상태이므로, 효모 및 곰팡이를 이용한 전통 주류의 유전체 기능에 대한 총체적인 연구 및 풍미, 품질관리에 대한 미생물 유전체와 발효조건의 상관관계에 대한 연구가 필요한 실정이다.

전통 주류산업에서 효모 균주의 생화학적 작용에 의해 다양한 대사체들이 최종적으로 생성되며, 이들에 의해 전통 발효주의 기능성, 영양학적 특성 및 품질 특성이 결정된다. 특히, 제품의 기호도와 밀접한 연관이 있는 풍미와 관련한 미생물 대상의 전사체/대사체에 대한 총체적인 연구는 제품 개선을 위한 기초적인 자료로 활용될 수 있으며, 산업적으로도 품질 관리에 유용한 정보를 제공할 것이다.

한국공개특허 제10-2014-0055917호(2014.05.09)

본 발명의 목적은 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주 및 이를 이용한 막걸리 제조방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC18466P로 기탁된, 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 사용하여, 곡류 원료로 막걸리를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주(KCTC18466P) 및 이를 이용한 막걸리 제조방법에 관한 것으로서, 국내 전통주에서 분리한 효모균을 통해 우수한 발효능과 기능성을 가진 종균 개발에 필요한 유용 유전자원을 확보하고, 전통주의 표준화 및 고급화 공정에 활용할 수 있는 기반 기술 개발은 바이오산업에서의 국제 경쟁력 제고에 크게 기여할 것으로 예상된다.

도 1은 본 발명에 따른 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 (KCTC18466P)의 계통관계를 유전체 간 비교(whole genome comparison)을 통해 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 (KCTC18466P)를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 (KCTC18466P)로 빚은 막걸리의 관능평가 결과이다.

본 발명은 수탁번호 KCTC18466P로 기탁된, 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주를 제공한다.

상세하게는, 상기 균주는 누룩으로부터 분리되었으며, 알파-아밀라아제(Alpha-Amylase), 글루코아밀라아제(Glucoamylase) 또는 프로티아제(Protease) 활성이 우수한 것을 특징으로 한다.

상세하게는, 상기 균주는 서열번호 3으로 표시되는 내부 전사 영역(Internal transcribed spacer; ITS)으로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상세하게는, 상기 곡류 원료는 막걸리를 제조할 수 있는 찹쌀, 멥쌀, 보리쌀, 현미, 옥수수, 고구마, 밀 등의 곡류 원료일 수 있으며, 보다 상세하게는 쌀 또는 밀기울일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, '막걸리'는 막걸리는 찹쌀, 멥쌀, 보리쌀, 현미, 옥수수, 고구마, 밀 등의 전분질을 원료로 하고 발효제로서 누룩을 첨가하여 발효시킨 술덧을 혼탁하게 제성한 우리나라 고유의 전통주로, 단맛, 신맛, 쓴맛, 매운맛과 청량감이 있고 알코올 함량이 2-8%인 술이다. 다른 주류와 달리 막걸리는 각종 영양원이 풍부하게 함유되어 있는데, 인체 신진대사에 관여하는 비타민 B군을 비롯한 라이신, 류신, 아르기닌 등의 필수 아미노산, 풍미물질인 에틸아세테이트, 아밀아세테이트, 에틸카르로에이트 등의 에스테르, 새콤한 맛을 내어 갈증을 해소케 하는 유기산, 그리고 간 기능을 도와주는 아세틸콜린 등이 함유되어 있다. 이와 같이 막걸리는 영양학적 및 기능적 가치가 높을 뿐만 아니라 생효모가 함유되어 있기 때문에 다른 주류와 비교할 수 없는 독특한 맛을 지니고 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 신균주인 사카로마이콥시스 피브리게라 ( Saccharomycopsis fibuligera ) KJJ81의 분리

1. 균주의 분리

본 발명자들은 당화, 발효 및 풍미를 가진 신균주를 발굴하기 위하여 2013년 7월 제주지역의 전통방식으로 만든 누룩을 수집하여 4℃에서 보관하고 고르게 분쇄한 누룩 10 g을 90 ml의 0.1% 펩톤(peptone)에 현탁한 후 단계적으로 10^-2~10^-7배 희석하였다. 희석한 현탁액은 100 ㎕씩 분리용 평판배지에 도말하여 25℃에 배양하였다. 이때 사용되는 분리배지는 Dichloran-glycerol agar (DG18: Peptone 0.5%, Glucose 1%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.05%, 0.2% Dichloran 1.0 ml, Chloramphenicol 0.01%, Agar 1.5%) 배지와 Dichloran rose bengal chloramphenicol agar (DRBC: Peptone 0.5%, Glucose 1%, KH₂PO₄ 0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.05%, 0.2% Dichloran 1.0 ml, Rose bengal 0.0025%, Chloramphenicol 0.01%, Agar 1.5%) 배지이며, 이후 분리된 균주는 Malt extract agar (MEA: Malt extract 3%, Mycological peptone 0.5%, Agar 1.5%) 배지에 접종하고 보존하였다.

2. 선별된 균주의 동정

(1) 형태학적 동정

상기에서 선별된 균주를 대상으로 현미경을 통해 균주의 형태학적 모양을 관찰하였다. 관찰 결과, 동정된 균주는 5 ~ 10 μm 크기의 단일세포가 multipolar hypae를 형성하면서, 각 마디가 20 ~ 40 μm로 신장되어 연결되어 있는 긴 hypae를 형성하는 모양을 갖는 것을 관찰할 수 있었다(도 2).

(2) 분자생물학적 동정

상기에서 선별한 균주의 분자생물학적 동정을 위해 CTAB 방법을 이용하여 DNA를 추출하였고, ITS (Internal transcribed spacer)를 PCR (polymerase chanin reaction) 증폭하기 위하여 배양체로부터 비드 비팅(bead beating) 방법을 이용하여 DNA를 추출하였고, 내부 전사되는 ITS(Internal transcribed spacer)를 PCR (polymerase chain reaction) 증폭하기 위하여 ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG; 서열번호 1) / ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC; 서열번호 2)의 프라이머 세트를 각각 이용하여 증폭한 후 정제를 통해 (주)Macrogen에 시퀀싱을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 분석된 ITS 부위의 염기서열은 서열번호 3에 나타냈다.

(3) 균학적 동정

상기 동정한 신균주인 사카로마이콥시스 피브리게라 (Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81의 균학적 특징을 조사하였는데, 즉 다양한 온도 조건, 다양한 배지 및 질소원 하에서 최적의 배양 조건을 조사하였다.

조사 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 생육 온도는 25 ~ 42℃의 온도에서 성장하는 특징이 있는 것을 나타났으며, 특히 25 ~ 37℃에서 성장이 우수한 것으로 나타났다(표 1).

배지	25℃	37℃	42℃	45℃
CM	+++	+++	+	-
PDA	+++	+++	+	-
YPD	+++	+++	+	-
MM	-	-	-	-
MM (NaNO₃)	-	-	-	-
MM (NH₄Cl)	-	-	-	-

< 실시예 2> 신균주인 사카로마이콥시스 피브리게라 ( Saccharomycopsis fibuligera ) KJJ81의 효소 역가 특성

본 발명에서 동정한 신균주 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 및 비교대상균주인 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KPH12 균주로 만든 쌀코지와 밀기울 코지의 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제, 프로테아제(곰팡이성)의 역가를 확인하였다(표 2). 분석방법은 식품의약품안전처의 식품첨가물 공전에 따라 분석하였다.

		알파-아밀라아제 (Alpha-Amylase)	글루코아밀라아제 (Glucoamylase)	프로테아제 (Protease)
사카로마이콥시스 피브리게라 KJJ81	쌀코지 (Rice Koji)	2.821	0	0
사카로마이콥시스 피브리게라 KJJ81	밀기울 코지 (Wheat Koji)	7.863	131.55	53.27
사카로마이콥시스 피브리게라 KPH12	쌀코지 (Rice Koji)	4.398	31.04	425.25
사카로마이콥시스 피브리게라 KPH12	밀기울 코지 (Wheat Koji)	1.967	68.06	537.06

Alpha-amylase: the amount of ceralpha units per gram of koji.

The glucose activity: the units of glucose released per gram of koji.

One unit of protease: the amount of enzyme required to release 1μg of tyrosine/hour.

< 실시예 3> 신균주인 사카로마이콥시스 피브리게라 ( Saccharomycopsis fibuligera ) KJJ81로 빚은 막걸리의 특성

1. 쌀 코지

쌀을 세미 후 2시간 동안 침지한 다음 30분간 물 빼기를 한 뒤 증미기를 이용하여 1시간 30분 증자한다. 증자된 쌀을 실온에서 냉각한 뒤 쌀 중량의 0.1%의 종균을 접종하여 항온항습배양기에서 30℃, 상대습도 70% 조건에서 72시간 배양하였다.

2. 밀기울 코지

밀기울 50g에 증류수 30mL를 첨가해 반죽한 뒤 상온에서 10분간 방치한 뒤 밀기울 반죽 30g씩 500mL 삼각 플라스크에 넣고 121℃, 20분간 가압 살균한다. 균주별로 배양시킨 사면배지에 증류수 10mL를 첨가해 균 현탁액을 제조하여 실온에서 냉각한 밀기울에 접종한다. 접종 완료 후 항온항습배양기에서 30℃, 상대습도 70% 조건에서 72시간 배양하였다.

3. 단양주 막걸리 만들기

1.4L의 물에 4×10⁸cells/g의 각각의 균주를 넣고 코지 200g을 넣은 다음 800g의 고두밥을 넣고 90% Lactic acid 5.5mL를 넣는다. 25℃에서 7일간 배양 후 120 mesh 필터로 거른 다음, 21~50세의 12명 남녀에게 관능평가(향, 단맛, 신만, 알콜향, 탄산의 세기, 바디감)를 분석하고, 유기산 및 알콜 함량을 분석하기 위하여 -70℃에 보관하였다(표 3). 제조된 막걸리의 분석결과는 표 4에 나타냈으며, 관능평가 결과는 표 5 및 도 3에 나타냈다.

Organic acids	Relative peak area (mean±SD)
2-(Methoxyimino) propanoic acid	1.298±0.178
Acetic acid	0.275±0.027
Oxalic acid	0.047±0.01
Succinic acid	14.415±0.895
2-Butenedioic acid	0.129±0.014
2-Methylbenzoic acid	0.612±0.038
2-(Lactoyloxy)propanoic acid (lactic acid dimer)	7.966±0.183
Methyl valerate	0.022±0.005
2-Hydroxy-2-methylsuccinic acid	0.261±0.013
Malic acid	5.808±0.108
Ethyl 4-hydroxybenzoate	0.887±0.008
2,3,4-Trihydroxybutanoic acid	0.093±0.007
Glutaric acid	4.264±0.051
3-Phenylpropanoic acid	0.287±0.013
Phenylacetic acid	0.016±0.004
Citric acid	0.789±0.039

	막걸리 결과
	사카로마이콥시스 피브리게라 KJJ81	사카로마이콥시스 피브리게라 KPH12
pH	4.2	4.1
Brix	13	17.5
Reducing Sugars	24.50	20.16
Liquid Volume (ml)	1000	700
Rice Weight (g)	3118.77	3179.16

	관능평가 결과
	사카로마이콥시스 피브리게라 KJJ81	사카로마이콥시스 피브리게라 KPH12
Scent	3.6	2.4
Sweet	3.4	2.6
Sour	6.2	7.4
Alcohol/Bitterness	6.2	5
탄산의 세기	4	3.2
Body	3.8	3.4
Overall Acceptability	3.6	1.8

< 실시예 4> 신균주인 사카로마이콥시스 피브리게라 ( Saccharomycopsis fibuligera ) KJJ81 균주의 참조유전체 서열 해독 및 유전체 분석

KJJ81와 KPH12 유전체 시퀀싱을 위하여 long-reads, short reads, long-mate pair reads 시퀀싱을 수행하였다. Pacific Biosciences 사의 Single molecule real time sequencing (SMRT) 기술을 이용하여 평균 9 kb 크기로 총 94x의 long-reads 시퀀싱을 수행하였다. 또한 TruSeq Synthetic Long Reads (TSLR) sequencing library (Illumina)를 이용하여 KPH12 및 KJJ81 균주에서 각각 23X and 10X의 시퀀싱을 수행하였다. 또한 86X 이상의 short insert reads (a 500-bp library)와 87 X 이상의 long-mated pair reads (a 15-kb library)를 Illumina HiSeq2500 sequencing 기술을 이용하여 100-bp paired-end 시퀀싱을 수행하였다. 이렇게 생산된 시퀀싱 데이터를 가지고 long-SMRT 시퀀싱 reads는 HGAP3, 15-kb mate-pair와 500-bp short insert reads는 SSPACE 소프트웨어를 이용하여 scaffolds를 만들었다. Short read data를 이용하여 Gap들은 GapCloser 소프트웨어를 이용하여 수정하였다. (Ref.#). 게놈 조립(genome assembly)의 질(quality)은 QUAST 소프트웨어를 이용하여 수행한 TSLR 시퀀싱 조립 결과와 비교 분석하였고 반복서열 분석 및 염색체 수준의 게놈 scaffolds를 제작하기 위해 KPH12 균주를 가지고 BioNano physical mapping을 수행하여 rRNA cluster 수를 분석하였고 KPH12 균주는 7개의 염색체를 가졌으며 KJJ81 균주는 7쌍의 염색체를 가진 균주로 분석되었다. KPH12 와 KJJ81 두 유전체의 게놈크기는 각각 약 19.7, 38.6 Mb의 크기를 지니는 것으로 분석되었다.

한국생명공학연구원

KCTC18466P

20160503

<110> Soongsil University Research Consortium techno-PARK Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Saccharomycopsis fibuligera KJJ81 strain with high saccharification and fermentation capability and the method for preparing makgeolli <130> ADP-2016-0156 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 558 <212> DNA <213> Saccharomycopsis fibuligera <400> 3 ctcttataca cagtgttttt gtttgcgaat ttggtttagt ttgttggttt tcattcgaaa 60 ggatgaagat tgattgctaa atcttattca gctttttaaa ctcagatctc tttttaagag 120 aaatgtattt ttttaattac aactagtcga ttttacaaac taaaagttta aaactttcag 180 caacggatct cttggttctc gcatcgatga agaacgcagc gaattgcgat aagtaatgtg 240 aattgcagat tttcgtgaat catcgaatct ttgaacgcat attgcgctct atagtattct 300 atagagcatg cctgtttgag cgtcatttct ctcttaaacc tttgggttta gtattgaagg 360 ttgtgttagc ttctgctaac tcctttgaaa tgacttggca attgattgag ttttccatat 420 atttgcttaa ggatttaata ttaggttcta ccaacttatt aaataccctt ttgcgaagga 480 cttactcgtg tatcaaggcc ttataacttt gtcattaatt ttgacctcga atcaggtaag 540 gatacccgct gaacttaa 558

Claims

수탁번호 KCTC18466P로 기탁된, 당화 및 발효능이 우수한 전통주 발효 효모 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 누룩으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 알파-아밀라아제(Alpha-Amylase), 글루코아밀라아제(Glucoamylase) 또는 프로티아제(Protease) 활성이 우수한 것을 특징으로 하는 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3으로 표시되는 내부 전사 영역(Internal transcribed spacer; ITS)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fibuligera) KJJ81 균주.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 사용하여, 곡류 원료로 막걸리를 제조하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 곡류 원료는 쌀 또는 밀기울인 것을 특징으로 하는 막걸리를 제조하는 방법.