CN102399732B - 一种北京棒杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一种北京棒杆菌，其保藏编号为CGMCC No.5360。本发明所述保藏编号为CGMCC No.5360的北京棒杆菌以野生型北京棒杆菌AS 1.299为出发菌株，经紫外照射后通过含有新霉素培养基筛选得到，其发酵生成L-谷氨酸的能力较野生型北京棒杆菌显著提高，L-谷氨酸产量提高了47.4％。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5360的北京棒杆菌能够广泛应用于L-谷氨酸的发酵中。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种北京棒杆菌及其应用。
背景技术
L-谷氨酸又名“麸酸”，是一种酸性氨基酸，L-谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。除此之外，L-谷氨酸还被广泛用于医药、食品、化妆品、农业等方面。
在医药化学方面，L-谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育，是合成某些手性化合物和医药中间体的常用原料；在食品工业方面，L-谷氨酸除了是生产味精的主要原料之一外，它还可用作代盐剂、营养增补剂、鲜味剂，也可用作虾、蟹等水产罐头中产生磷酸铵镁结晶的防止剂；在日用化妆品方面，L-谷氨酸用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛***、毛母细胞有营养功能，并能扩张血管，增强血液循环，有生发防脱发功效。用于皮肤，对治疗皱纹有疗效；在农业方面，L-谷氨酸与某些激素配合，可制成柑桔增甜剂，还可作为微肥的载体，在氮、磷、钾肥基本满足的条件下，作为叶面喷洒的微肥具有投入少、效益高等特点。
L-谷氨酸是目前世界上产量最大的氨基酸，现有技术主要以糖质为原料经微生物发酵产生，然后采用“等电点提取”加上“离子交换树脂”分离获得。L-谷氨酸产量高低与所采用的微生物种类密不可分，北京棒杆菌是在L-谷氨酸发酵中常用的菌种之一，但是其L-谷氨酸产量并不高。因此，提供一种L-谷氨酸高产菌株，对于提高L-谷氨酸的发酵效率具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种北京棒杆菌及其应用，使得所述北京棒杆菌能够提高L-谷氨酸的产量。
为实现上述发明目的，本发明以野生型北京棒杆菌AS 1.299(购自于中国科学院微生物研究所)为出发菌株，通过紫外线对其进行物理诱变，然后将经紫外照射后的北京棒杆菌AS 1.299的悬浮菌液涂布在含有新霉素的培养基上，从含有新霉素培养基上筛选出具有新霉素抗性的菌株，命名为菌株MHZ-0110。
本发明将上述筛选出的菌株MHZ-0110按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌***鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型北京棒杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株MHZ-0110与野生型北京棒杆菌同源性高达99％，结合生理生化特征，鉴定其为北京棒杆菌。
本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110已于2011年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5360。
本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110与野生型北京棒杆菌AS 1.299的L-谷氨酸发酵对比试验显示，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110发酵合成的L-谷氨酸含量为28g/L，而野生型北京棒杆菌AS 1.299发酵合成的L-谷氨酸含量为19g/L，L-谷氨酸产量提高了47.4％。因此，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110能够应用于生产L-谷氨酸中。
新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，通过结合于细胞内的核糖体上干扰细菌蛋白质合成，使之合成异常的蛋白质，并使细菌细胞膜通透性增加，导致细胞内重要生理物质外漏而呈现杀菌作用，对静止期细菌杀菌作用较强，为静止期杀菌类抗生素。而本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110具有对新霉素的抗性并能提高L-谷氨酸合成能力。在野生菌株获得新霉素抗性后，可能由于本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110合成异常的蛋白质抵抗新霉素，这些异常的蛋白质导致L-谷氨酸合成酶系解除了某些产物的反馈抑制作用，从而导致突变株的L-谷氨酸产量得到提高。
此外，本发明还提供了一种L-谷氨酸生产方法，将保藏编号为CGMCCNo.5360的北京棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵，发酵期间维持pH值为6-9、葡萄糖含量为10-180g/L。
其中，作为优选，发酵期间的pH值为6.5-7.4，葡萄糖含量为20-100g/L。
本发明所述生产方法可以一直进行到不再产生L-谷氨酸为止，然后可根据本领域常规方法对L-谷氨酸进行分离。
对于扩繁用的种子培养基以及发酵用的发酵培养基为本领域公知，本领域技术人员均可采用合适的培养基进行L-谷氨酸的发酵。作为优选，本发明所述种子培养基由25g/L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米浆、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰组成，pH值为6.8-7.4。所述发酵培养基由80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米浆、1.2g/L磷酸二氢钾、0.7g/L硫酸镁、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰、200ug/L硫胺素、2mL/L 1％苯酚红组成，pH值为6.8-7.4。
由以上技术方案可知，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5360的北京棒杆菌MHZ-0110以野生型北京棒杆菌AS 1.299为出发菌株，经紫外照射后通过含有新霉素培养基筛选得到，其发酵生成L-谷氨酸的能力较野生型北京棒杆菌显著提高，L-谷氨酸产量提高了47.4％。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5360的北京棒杆菌能够广泛应用于L-谷氨酸的发酵中。
生物保藏信息说明
分类命名：北京棒杆菌，Corynebacterium pekinense.于2011年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.5360。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种北京棒杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的菌株已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110的筛选
将出发菌株-野生型北京棒杆菌AS 1.299接种在液体培养基中30℃培养11小时获得处于对数生长期的菌悬液，然后将该菌悬液浓度调整至每毫升含有约108个细胞后置于紫外线下照射35秒，最后将经过紫外线照射的菌悬液涂布在含有0.5mg/L新霉素的完全培养基平板上，30℃继续培养2天，根据菌落形态、颜色等特征挑取单菌落，命名为MHZ-0110。
其中，液体培养基配方如下：葡萄糖25g/L、尿素5g/L、玉米浆30g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、硫酸亚铁2mg/L、硫酸锰2mg/L，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4后定容至1000ml。
完全培养基组成如下：新霉素0.5mg/L、牛肉膏10g、蛋白胨10g、NaCl5g、葡萄糖5g、琼脂18g，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4后定容至1000ml。
将上述筛选出的菌株MHZ-0110按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌***鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型北京棒杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株MHZ-0110与野生型北京棒杆菌同源性高达99％，结合生理生化特征，鉴定其为北京棒杆菌。
实施例2：本发明所述L-谷氨酸生产方法及L-谷氨酸发酵对比试验
1、发酵方法
将本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110接种在以下所述的种子培养基中扩繁，于30℃振荡培养11小时，将所得培养物接种到以下所述的发酵培养基中，培养物与发酵培养基的体积比为1∶10(本领域技术人员可根据实际生产中的发酵培养基的量适当调节，本比例只是优选比例)，30℃振荡培养至不再产生L-谷氨酸为止(一般为40小时左右)。在发酵培养基中振荡培养时，根据苯酚红作为指示剂指示的培养基pH变化情况加入适量尿素，维持发酵培养基中的pH值介于6.5-7.4之间，中间采样测定其中的葡萄糖含量，使葡萄糖含量介于20-100g/L。
种子培养基：
25g/L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米浆、1g/L KH2PO4、0.4g/LMgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4。
发酵培养基：80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米浆、1.2g/L磷酸二氢钾、0.7g/L硫酸镁、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰、200ug/L硫胺素、2mL/L 1％苯酚红，用蒸馏水溶解并调节pH至6.8-7.4。
2、L-谷氨酸发酵对比试验
将本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110和野生型北京棒杆菌AS 1.299按照上述生产方法同时进行发酵，两种菌株的发酵环境、接种量均相同，停止发酵后通过生物传感仪测定两种菌株所合成的L-谷氨酸含量。
结果显示，野生型北京棒杆菌AS 1.299发酵合成的L-谷氨酸量为19g/L，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0110发酵合成的L-谷氨酸量为28g/L，突变菌株L-谷氨酸产量较出发菌株AS 1.299提高了47.4％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense.），其特征在于，保藏编号为CGMCC No.5360。
2.保藏编号为CGMCC No.5360的北京棒杆菌在生产L-谷氨酸中的应用。
3.一种L-谷氨酸生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No.5360的北京棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵，发酵期间维持pH值为6-9、葡萄糖含量为10-180g/L。
4.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵期间的pH值为6.5-7.4。
5.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵期间的葡萄糖含量为20-100g/L。
6.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基由25g/L葡萄糖、5g/L尿素、30g/L玉米浆、1g/L KH2PO4、0.4g/L MgSO4·7H2O、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰组成，pH值为6.8-7.4。
7.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵培养基由80g/L葡萄糖、20g/L尿素、8g/L玉米浆、1.2g/L磷酸二氢钾、0.7g/L硫酸镁、2mg/L硫酸亚铁、2mg/L硫酸锰、200ug/L硫胺素、2mL/L1%苯酚红组成，pH值为6.8-7.4。
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