CN110343633A - 重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中,将一代生产菌种接种于种子罐中进行传二代培养,将二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养;发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体;菌体溶解,破菌;进行结合,结合完成后,对其进行清洗,进行酶切,采用层析柱对蛋白酶切液进行纯化然后脱盐、去内毒素、除菌过滤保存。本发明的制备方法简单,能大规模制备得到重组金黄色葡萄球菌蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白原液领域,具体涉及重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法。
背景技术
金葡菌是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌,呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点,急需研制疫苗控制其感染与流行。
金葡菌有“嗜肉菌"的别称,作为革兰氏阳性菌的代表,是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性为特征,局部可引起皮肤和软组织等的化脓性感染,经久不愈;全身可导致急性肺炎、脓毒血症、心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等严重感染及并发症,死亡率高达20%。同时,金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
随着抗生素长期、广泛地使用,细菌耐药性问题日益突出,作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)自1961年被首次发现至今,目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的院內感染病原菌之一。同时,因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行,呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点,被称为“第一超级细菌”。
MRSA分为医院获得性MRSA(healthcare-associated MRSA,HA-MRSA)及社区获得性MRSA(community-associated MRSA,CA-MRSA)。
2009年,据美国CDC在《新英格兰医学杂志》报道,美国每年MRSA严重感染人数约为9万人,致死病例约为2万人。2010年12月中国“MRSA院内感染诊治策略新进展”会议资料显示,我国内地医院院内MRSA感染发生率约为8%,每例院内感染患者平均住院时间延长14天,花费增加6542元,全国每年因医院感染造成的直接损失超过150亿元。同时,由于抗生素的滥用,临床高度耐药性金葡菌,尤其是MRSA的分离检出率逐年上升。中国2011年全国细菌耐药监测报告显示,在全国129家三甲医院被检的273808株细菌中,金葡菌位列临床革兰阳性菌分离量首位,MRSA检出率占被检出金葡菌的60%,广泛耐药率超过40%。基于这种严峻形势,我国已将MRSA列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病,并位居首位。目前,万古霉素是治疗MRSA感染的最后一道防线,但随着2002年耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant staphylococcus aureus,VRSA)的相继出现,高度耐药性发展的MRSA和VRSA在全球呈蔓延趋势,使得临床金葡菌的感染面临“无药可治”的严峻挑战。
抗生素的研发速度远远跟不上细菌耐药性的发展速度,而安全有效的金葡菌疫苗将可成为预防金葡菌感染的有效手段。WHO于2011年提出了“抵抗耐药菌”的“六点政策一揽子计划”,并强调在未来重点支持创新性疫苗等免疫防控制品的研发。因此,加强对金葡菌感染的免疫防治研究,研制安全、有效的新型金葡菌疫苗将对有效控制金葡菌广泛感染及大规模爆发流行、大幅降低金葡菌院内感染的发病率及耐药性蔓延等方面具有重要的现实及战略意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是目前金葡菌院内感染的发病率较高,并且其耐药性蔓延较快不易被控制,现有的重组金黄色葡萄球菌疫苗不能规模化的制备,制备效率较低,目的在于提供重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,解决重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备的问题。
本发明通过下述技术方案实现:
重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,包括以下步骤:
(1)蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中,接种量为菌种:培养基=1ml:100ml,培养6~10小时,为一代生产菌种;
(2)将一代生产菌种接种于种子罐中进行传二代培养,接种量为一代菌种:培养基=1ml:2000ml,培养6~10小时,为二代生产菌种;培养过程中每小时取样检测OD600值,当OD600值大于1.5时种子罐培养结束,结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌;
(3)将二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养,接种量为二代菌种:培养基=1ml:9ml培养结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌;
(4)发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体;
(5)领取菌体使其溶解,待菌体溶解后,使用匀质机破菌,收集上清,澄清过滤;
(6)按照5ml:1ml将破菌上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和填料混合;在20~25℃条件下进行结合,结合时间4~10h,结合完成后,对其进行清洗,清洗完成后按照凝胶:PP酶溶液=5ml:1ml加入PP酶溶液,垂直混悬器转速为11~12rpm,20~25℃条件下进行酶切6~12h,酶切完成后,收获酶切液,除菌过滤;
(7)采用层析柱对蛋白酶切液进行纯化;
(8)采用层析柱对蛋白液进行脱盐;
(9)采用层析柱对蛋白脱盐样去内毒素;
(10)将去内毒素的蛋白溶液经除菌过滤,放-80℃冰柜保存。
重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其中,步骤(1)中,每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基,放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
步骤(2)中种子罐装有LB液体培养基30L,控制种子罐参数为温度:36~38℃、50~500rpm、空气流量:30~70L/min、pH:7.2~7.5培养6~10小时。
步骤(3)中,发酵罐装有TB液体培养基270L,控制发酵罐参数为温度:36~38℃、100~600rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:40%~50%;控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其它不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养过程中增加补料;当出现pH和溶氧出现上升的情况,开始降低培养温度至29~31℃,通过调节转速和通气控制溶氧:40%~50%,pH:7.2~7.5,参数稳定后加入异丙基硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导5h培养结束。
步骤(5)中,使用匀质机破菌时,其控制参数为:调节压力为750±50bar,冷凝***温度为2~8℃,破碎3次;将破碎好的菌液进行离心,离心力为12000g,20min,4℃,收集上清,澄清过滤。
步骤(6)中,结合完成后,共用4个胶体积的20mM PB+0.5M pH为7.5的NaCl溶液清洗,接着用5个胶体积的室温注射水清洗,再用1个胶体积酶切缓冲液进行清洗。其中,酶切缓冲液为20mM PB和0.15M pH为7.5的NaCl溶液。
步骤(1)中蛋白工作种子批菌种为MntC或HI或mSEB或SpA5中的一种。
更进一步的,LB液体培养基的配制(1L)为:在950ml ddH2O中加入胰化蛋白胨10g;酵母提取物5g;NaCl 10g。用1M的NaOH调节pH值到7.0,定容至1L。121℃,20min高压灭菌,4℃储存。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
1、本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,本发明的制备方法简单,能大规模制备得到重组金黄色葡萄球菌蛋白;
2、本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,本发明使用发酵罐大规模的表达重组金黄色葡萄球蛋白的工程菌和表达重组金黄色葡萄球菌蛋白,并且还能对该蛋白进行大规模的纯化,有效的实现了该蛋白的产业化规模生产;
3、本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,本发明制备方法简单,并且得到的重组金黄色葡萄球菌蛋白纯度高,质量好,更便于长期使用。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解,构成本申请的一部分,并不构成对本发明实施例的限定。在附图中:
图1为本发明得到的mSEB蛋白的发酵电泳图;
图2为本发明得到的mSEB蛋白的纯化电泳图;泳道1:标准品、泳道2:菌体破碎离心上清样、泳道3:GST亲和后样、泳道4:SP层析未结合样、泳道5:SP层析样、泳道6:SP层析样、泳道7:SP层析样、泳道8:phenyl层析前样;
图3为本发明得到的mSEB蛋白的纯化电泳图;泳道1:phenyl层析样;泳道2:G25层析脱盐样;泳道3:原液样;泳道4:标准品;
图4为本发明得到的HI蛋白的发酵电泳图;泳道1:标准品、泳道2:诱导0h破菌上清样、泳道3:诱导1h破菌上清样、泳道4:诱导3h破菌上清样、泳道5:诱导5h破菌上清样、泳道6:诱导0h破菌上清与GST填料结合样、泳道7:诱导1h破菌上清与GST填料结合样、泳道8:诱导3h破菌上清与GST填料结合样、泳道9:诱导5h破菌上清与GST填料结合样;
图5为本发明得到的HI蛋白的纯化电泳图;泳道1:破菌上清与GST填料亲和样、泳道2:破菌上清未与GST填料亲和样、泳道3:标准品、泳道4:GST亲和后酶切样品、泳道5:MMC层析样、泳道6:MMC层析样、泳道7:MMC层析未与填料结合样、泳道8:G25层析脱盐后样品、泳道9:原液样;
图6为本发明得到的MntC蛋白的发酵电泳图;泳道1:标准品、泳道2:诱导0h破菌上清样、泳道3:诱导1h破菌上清样、泳道4:诱导2h破菌上清样、泳道5:诱导3h破菌上清样、泳道6:诱导4h破菌上清样、泳道7:诱导5h破菌上清样;
图7为本发明得到的MntC蛋白的纯化电泳图;泳道1:标准品、泳道2:GST亲和后酶切样品、泳道3:GST层析未亲和样、泳道4:MMC层析样、泳道5:MMC层析未与填料结合样、泳道6:G25层析脱盐后样品、泳道7:原液样;
图8为本发明得到的SpA5蛋白的发酵电泳图;泳道1:标准品、泳道2:诱导0h破菌上清样、泳道3:诱导1h破菌上清样、泳道4:诱导3h破菌上清样、泳道5:诱导5h破菌上清样、泳道6:诱导0h破菌上清与GST填料结合样、泳道7:诱导1h破菌上清与GST填料结合样、泳道8:诱导3h破菌上清与GST填料结合样、泳道9:诱导5h破菌上清与GST填料结合样;
图9为本发明得到的SpA5蛋白的发酵电泳图;泳道1:标准品、泳道3:硫酸铵沉淀未沉淀样品、泳道5:硫酸铵沉淀复溶样品、泳道6:G25层析脱盐后样品、泳道7:原液样。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
实施例1
本发明重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,包括以下步骤:
(1)mSEB蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:100(ml:ml),每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)一代生产菌种接种于种子罐进行传二代培养。种子罐装有LB液体培养基30L,接种量为一代菌种:培养基=1:2000(ml:ml),控制种子罐参数为温度:36~38℃、50~500rpm、空气流量:30~70L/min、pH:7.2~7.5培养6~10小时,为二代生产菌种。培养过程中每小时取样检测OD600值,当OD600值大于1.5时种子罐培养结束,结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(3)二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养。发酵罐装有TB液体培养基270L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:36~38℃、100~600rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:40%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其它不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养过程中增加补料。当出现pH和溶氧出现上升的情况,开始降低培养温度至29~31℃,通过调节转速和通气控制溶氧:40%~50%,pH:7.2~7.5,参数稳定后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导5h培养结束。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(4)mSEB蛋白菌液离心。发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体。
(5)领取mSEB菌体3kg,按照1:5(g:ml)的比例,使用20mM PB(pH6.0)溶解菌体,待菌体溶解后,使用匀质机破菌,控制参数:调节压力为750±50bar,冷凝***温度为2~8℃,破碎3次。将破碎好的菌液进行离心,离心力为12000g,20min,4℃,收集上清,使用深层澄清过滤。
(6)采用SPHP层析柱对mSEB蛋白酶切液进行纯化。流动相:A通道为20mM PB(pH6.0);B通道为20mM PB+1M NaCl(pH6.0)。上样参数:进样流速0.94cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm。上样完成后使用平衡液平衡柱子,复平衡参数:流速1.5cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;复平衡体积:3个柱体积,开始洗脱,设置洗脱参数:流速1.5cm/min;程序A:B为100%:0%→50%:50%,时间32min,体积为5个柱体积;最大delta柱压力0.25Mpa。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于200mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于200mAU时停止收集。完成SPHP柱层析,除菌过滤。
(7)mSEB蛋白SPHP层析样按照1:2(样品:3M硫酸铵)加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH7.5),搅拌10min,澄清过滤。
(8)采用pHenyl层析柱对mSEB蛋白SPHP层析样进行纯化。流动相:A通道为20mM PB+2M(NH4)2SO4(pH 7.5);B通道为20mM PB(pH7.5)。上样参数:进样流速2.8cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm。上样完成后使用平衡液平衡柱子,复平衡参数:流速2.8cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;复平衡体积:3个柱体积,开始洗脱,设置洗脱参数:流速2.8cm/min;程序A:B为100:0→0:100,时间17min,体积为5个柱体积;最大delta柱压力0.25Mpa。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于200mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于200mAU时停止收集。完成pHenyl柱层析。
(9)采用G25层析柱对mSEB蛋白液进行脱盐。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.15Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于柱床体积的30%。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成G25柱层析。
(10)采用QHP层析柱对mSEB蛋白脱盐样去内毒素。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1.5cm/ml;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于8个柱体积。检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成QHP柱层析。
(11)蛋白溶液经除菌过滤,放-80℃冰柜保存。
根据图1,mSEB蛋白的发酵电泳图所示,图1中分别为其在诱导0小时后破菌上清、诱导3小时后破菌上清、诱导4小时后破菌上清、诱导5小时后破菌上清的电泳图;
图2和图3为mSEB蛋白的纯化后的电泳图,图2中分别为破菌后的上清、粗纯样(即亲和层析后的样品)、SP流穿(即SP层析过程中未结合上去的杂质)、SP第一峰(即SP层析收集的目的蛋白)、SP样(即SP层析收集的目的蛋白)、加硫酸氨过滤后样(即phenyl层析前的样品处理样)的电泳图;
图3中为phenyl样(即phenyl层析后的样品)、G25样(即G25脱盐过后的样品)、QHP样(即经Q柱层析后的样品g),由图2、3可看出:经过一步一步纯化后,我们的放大产品变得越来越纯,使得最终产品符合要求。
实施例2
(1)HI蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:100(ml:ml),每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)一代生产菌种接种于种子罐进行传二代培养。种子罐装有LB液体培养基30L,接种量为一代菌种:培养基=1:2000(ml:ml),控制种子罐参数为温度:36~38℃、50~500rpm、空气流量:30~70L/min、pH:7.2~7.5培养6~10小时,为二代生产菌种。培养过程中每小时取样检测OD600值,当OD600值大于1.5时种子罐培养结束,结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(3)二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养。发酵罐装有TB液体培养基270L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:36~38℃、100~600rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:40%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其它不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养过程中增加补料。当出现pH和溶氧出现上升的情况,开始降低培养温度至29~31℃,通过调节转速和通气控制溶氧:40%~50%,pH:7.2~7.5,参数稳定后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导5h培养结束。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(4)HI蛋白菌液离心;发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体。
(5)领取HI菌体10kg,按照1:5(g:ml)的比例,使用10mM PBS(pH7.2~7.4)溶解菌体,待菌体溶解后,使用匀质机破菌,控制参数:调节压力为750±50bar,冷凝***温度为2~8℃,破碎3次。将破碎好的菌液进行离心,离心力为12000g,20min,4℃,收集上清,澄清过滤。
(6)按照5:1(ml:ml)将破菌上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和填料混合。在20~25℃条件下进行结合,结合时间4~10h。结合完成后,共用4个胶体积的20mM PB+0.5M NaCl(pH7.5)溶液清洗,接着用5个胶体积的室温注射水清洗,再用1个胶体积酶切缓冲液(20mMPB+0.15M NaCl(pH7.5)溶液)清洗,清洗完成后按照凝胶:PP酶溶液=5:1(ml:ml)加入PP酶溶液,垂直混悬器转速为11~12rpm,20~25℃条件下进行酶切6~12h。酶切完成后,收获酶切液,除菌过滤。
(7)采用MMC层析柱对HI蛋白酶切液进行纯化,流动相:A通道为20mM PB+0.15MNaCl(pH7.5);B通道为0.1M NaHCO3(pH11)。上样参数:进样流速3.7cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm。上样完成后,使用平衡液平衡柱子,复平衡参数:流速3.7cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;复平衡体积:3个柱体积,开始洗脱,设置洗脱参数:流速3.7cm/min;程序A:B为100:0→0:100,时间25min,体积为10个柱体积;最大delta柱压力0.25Mpa。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于200mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于200mAU时停止收集。完成MMC柱层析。
计量MMC层析收获量,按照1:2(ml:ml)(样品:3M硫酸铵)缓慢加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH 7.5)溶液,慢速搅拌10min,6000rpm、20min离心,收获沉淀。用10mM L-His+0.9%NaCl(PH6.0)复溶沉淀,使蛋白浓度在5~10mg/ml,澄清过滤。
(8)采用G25层析柱对HI蛋白液进行脱盐。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.15Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于柱床体积的30%。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成G25柱层析。
(9)采用QHP层析柱对HI蛋白脱盐样去内毒素。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1.5cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于8个柱体积。检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成QHP柱层析。
(10)蛋白溶液经除菌过滤,放-80℃冰柜保存。
图4为HI菌液诱导0小时后破菌上清、诱导1小时后破菌上清、诱导3小时后破菌上清、诱导5小时后破菌上清的电泳图,以及诱导0小时后进行填料结合、诱导1小时后进行填料结合、诱导3小时后进行填料结合、诱导5小时后进行填料结合的电泳图,由图4可看出:发酵后有大量目的蛋白表达。
图5为HI蛋白结合填料、GST流穿(即GST亲和层析未亲和的样品)、粗纯样(即亲和层析后的样品)、MMC样1(即MMC层析后的样品)、MMC样2(即MMC层析后的样品)、MMC流穿(即MMC层析未结合上的样品)、G25样(即G25层析脱盐后的样品)、QHP样(即QHP层析后的样品)、清洗后填料的电泳图。
由图5可看出:经过一步一步纯化后,我们的放大产品变得越来越纯,使得最终产品符合要求。
实施例3
(1)MntC蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:100(ml:ml),每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)一代生产菌种接种于种子罐进行传二代培养。种子罐装有LB液体培养基30L,接种量为一代菌种:培养基=1:2000(ml:ml),控制种子罐参数为温度:36~38℃、50~500rpm、空气流量:30~70L/min、pH:7.2~7.5培养6~10小时,为二代生产菌种。培养过程中每小时取样检测OD600值,当OD600值大于1.5时种子罐培养结束,结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(3)二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养。发酵罐装有TB液体培养基270L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:36~38℃、100~600rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:40%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其它不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养过程中增加补料。当出现pH和溶氧出现上升的情况,开始降低培养温度至29~31℃,通过调节转速和通气控制溶氧:40%~50%,pH:7.2~7.5,参数稳定后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导5h培养结束。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(4)MntC蛋白菌液离心;发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体。
(5)领取菌体10kg,按照1:5(g:ml)的比例,使用10mM PBS(pH7.2~7.4)溶解菌体,待菌体溶解后,使用匀质机破菌,控制参数:调节压力为750±50bar,冷凝***温度为2~8℃,破碎3次。将破碎好的菌液进行离心,离心力为12000g,20min,4℃,收集上清,使用深层澄清过滤。
(6)按照5:1(ml:ml)将破菌上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和填料混合结合。在20~25℃条件下进行结合,结合时间4~10h。结合完成后,共用5个胶体积的20mM PB+0.5MNaCl(pH7.5)溶液清洗,接着用5个胶体积的室温注射水清洗,再用1个胶体积酶切缓冲液(10mM L-His+0.1M NaCl(PH6.0))溶液清洗,清洗完成后按照,凝胶:PP酶溶液=5:1(ml:ml)加入PP酶溶液,垂直混悬器转速为11~12rpm,20~25℃条件下进行酶切6~12h。酶切完成收获酶切液,除菌过滤。
(7)采用MMC层析柱对Mntc蛋白酶切液进行纯化。流动相:A通道为10mM L-His(pH6.0)+0.1M NaCl;B通道为10mM L-His(pH6.0)+1M NaCl。上样参数:进样流速3.7cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm。上样完成后使用平衡液平衡柱子,复平衡参数:流速3.7cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;复平衡体积:3个柱体积,,开始洗脱,设置洗脱参数:流速3.7cm/min;程序A:B为100:0→0:100,时间13min,体积为5个柱体积;最大delta柱压力0.25Mpa。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于200mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于200mAU时停止收集。完成MMC柱层析。
(8)采用G25层析柱对Mntc蛋白液进行脱盐。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.15Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于柱床体积的30%。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成G25柱层析。
(9)采用QHP层析柱对Mntc蛋白脱盐样去内毒素。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1.5cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于8个柱体积。检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成QHP柱层析。
(10)蛋白溶液经除菌过滤,放-80℃冰柜保存。
根据图6所示:图6为Mntc菌液诱导0小时后破菌上清、诱导1小时后破菌上清、诱导2小时后破菌上清、诱导3小时后破菌上清的电泳图、诱导4小时后破菌上清、诱导5小时后破菌上清的电泳图,由图6可知:发酵后有大量目的蛋白表达。图7为纯化后,酶切液(即亲和层析样品)、结合流穿(即未与GST填料进行亲和的样品)、MMC样(即MMC层析样品)、MMC流穿(即未与MMC填料结合的样品)、G25样(即G25层析脱盐后的样品)、QHP样(即QHP层析后的样品)的电泳图,由图7可看出:经过一步一步纯化后,我们的放大产品变得越来越纯,使得最终产品符合要求。
实施例4
(1)SpA5蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中。接种量为菌种:培养基=1:100(ml:ml),每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基。放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
(2)一代生产菌种接种于种子罐进行传二代培养。种子罐装有LB液体培养基30L,接种量为一代菌种:培养基=1:2000(ml:ml),控制种子罐参数为温度:36~38℃、50~500rpm、空气流量:30~70L/min、pH:7.2~7.5培养6~10小时,为二代生产菌种。培养过程中每小时取样检测OD600值,当OD600值大于1.5时种子罐培养结束,结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(3)二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养。发酵罐装有TB液体培养基270L,接种量为二代菌种:培养基=1:9(ml:ml)。控制发酵罐参数为温度:36~38℃、100~600rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:40%~50%。控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其它不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养过程中增加补料。当出现pH和溶氧出现上升的情况,开始降低培养温度至29~31℃,通过调节转速和通气控制溶氧:40%~50%,pH:7.2~7.5,参数稳定后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导5h培养结束。结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌。
(4)SpA5蛋白菌液离心,发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体。
(5)领取SPA5菌体10kg,按照1:5(g:ml)的比例,使用10mM PBS(pH7.2~7.4)溶解菌体,待菌体溶解后,使用匀质机破菌,控制参数:调节压力为750±50bar,冷凝***温度为2~8℃,破碎3次。将破碎好的菌液进行离心,离心力为12000g,20min,4℃,收集上清,使用深层澄清过滤。
(6)按照5:1(ml:ml)将破菌上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和填料混合结合。在20~25℃条件下进行结合,结合时间4~10h。结合完成后,共用5个胶体积的20mM PB+0.5MNaCl(pH7.5)溶液清洗,接着用5个胶体积的室温注射水清洗,再用1个胶体积酶切缓冲液(20Mm PB(pH7.5))溶液清洗,清洗完成后按照凝胶:PP酶溶液=5:1(ml:ml)加入PP酶溶液,垂直混悬器转速为11~12rpm,20~25℃条件下进行酶切6~12h。酶切完成收获酶切液,除菌过滤。
(7)采用SPHP层析柱对SPA5蛋白酶切液进行纯化。流动相:A通道为20mM PB(pH7.5);B通道为20mM PB+1M NaCl(pH7.5)。上样参数:进样流速2.8cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm。上样完成后,使用平衡液平衡柱子,复平衡参数:流速2.8cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;复平衡体积:3个柱体积,,开始洗脱,设置洗脱参数:流速2.8cm/min;程序A:B为100:0→0:100,时间35min,体积为10个柱体积;最大delta柱压力0.25Mpa。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于200mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于200mAU时停止收集。完成SPHP柱层析。
硫酸铵沉淀
计量SPHP层析收获量,按照8:7(ml:ml)(3M硫酸铵:样品)缓慢加入20mM PB+3M(NH4)2SO4(pH 7.5)溶液,慢速搅拌10min,6000rpm、20min离心,收获沉淀。用10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)复溶沉淀,使蛋白浓度在5~10mg/ml,澄清过滤。
(8)采用G25层析柱对SPA5蛋白液进行脱盐。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.15Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于柱床体积的30%。
检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成G25柱层析。
(9)采用QHP层析柱对SpA5蛋白脱盐样去内毒素。流动相:10mM L-His+0.9%NaCl(pH6.0)。上样参数1.5cm/min;A:B=100%:0%;最大delta柱压力0.25Mpa;紫外检测波长280nm;上样量小于8个柱体积。检测洗脱液UV280吸收图谱,当洗脱液吸收大于50mAU时开始收集洗脱液,当洗脱液吸收小于50mAU时停止收集。完成QHP柱层析。
(10)蛋白溶液经除菌过滤,放-80℃冰柜保存。
根据图8所示,图8为SpA5蛋白诱导0小时后破菌上清、诱导1小时后破菌上清、诱导3小时后破菌上清、诱导5小时后破菌上清的电泳图,以及诱导0小时后进行填料结合、诱导1小时后进行填料结合、诱导3小时后进行填料结合、诱导5小时后进行填料结合的电泳图,由图8可看出:发酵后有大量目的蛋白表达。图9为SpA5蛋白使用硫酸铵沉淀上清、硫酸铵沉淀复溶样(即硫酸铵沉淀后复溶的样品)、G25样(即G25层析脱盐后的样品)、QHP样(即QHP层析后的样品)的电泳图。
由图9可看出:经过一步一步纯化后,我们的放大产品变得越来越纯,使得最终产品符合要求。
实施例5
根据实施例1~4,得到收率统计表:
经过各项检测后,得到的mSEB蛋白、HI蛋白、MntC蛋白、SpA5蛋白均符合要求,本发明使用发酵罐大规模高密度培养重组金黄色葡萄球菌蛋白,并且提供了一种大规模纯化该蛋白的方法,能有效的实现该蛋白的产业化规模生产。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)蛋白工作种子批菌种开启后接种于一个三角瓶中,接种量为菌种:培养基=1ml:100ml,培养6~10小时,为一代生产菌种;
(2)将一代生产菌种接种于种子罐中进行传二代培养,接种量为一代菌种:培养基=1ml:2000ml,培养6~10小时,为二代生产菌种;培养过程中每小时取样检测OD600值,当OD600值大于1.5时种子罐培养结束,结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌;
(3)将二代生产菌种接种于发酵罐中进行传三代培养,接种量为二代菌种:培养基=1ml:9ml培养结束后取菌液样品进行染色镜检,细菌应为革兰氏阴性杆菌;
(4)发酵结束后,菌液通过连续流离心去除上清收获菌体;
(5)领取菌体使其溶解,待菌体溶解后,使用匀质机破菌,收集上清,澄清过滤;
(6)按照5ml:1ml将破菌上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和填料混合;在20~25℃条件下进行结合,结合时间4~10h,结合完成后,对其进行清洗,清洗完成后按照凝胶:PP酶溶液=5ml:1ml加入PP酶溶液,垂直混悬器转速为11~12rpm,20~25℃条件下进行酶切6~12h,酶切完成后,收获酶切液,除菌过滤;
(7)采用层析柱对蛋白酶切液进行纯化;
(8)采用层析柱对蛋白液进行脱盐;
(9)采用层析柱对蛋白脱盐样去内毒素;
(10)将去内毒素的蛋白溶液经除菌过滤,放-80℃冰柜保存。
2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(1)中,每个三角瓶装25±2mlLB液体培养基,放置于恒温振荡培养器36~38℃,180~300rpm培养6~10小时,为一代生产菌种。
3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(2)中种子罐装有LB液体培养基30L,控制种子罐参数为温度:36~38℃、50~500rpm、空气流量:30~70L/min、pH:7.2~7.5培养6~10小时。
4.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(3)中,发酵罐装有TB液体培养基270L,控制发酵罐参数为温度:36~38℃、100~600rpm、空气流量:100~400L/min、pH:7.2~7.5,溶氧:40%~50%;控制溶氧时,当控制参数达到规定范围最大值,溶氧继续下降时,保持其它不变,增加通入纯氧进行控制溶氧,培养6~10小时,培养过程中增加补料;当出现pH和溶氧出现上升的情况,开始降低培养温度至29~31℃,通过调节转速和通气控制溶氧:40%~50%,pH:7.2~7.5,参数稳定后加入异丙基硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM,开始诱导,诱导5h培养结束。
5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(5)中,使用匀质机破菌时,其控制参数为:调节压力为750±50bar,冷凝***温度为2~8℃,破碎3次;将破碎好的菌液进行离心,离心力为12000g,20min,4℃,收集上清,澄清过滤。
6.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(6)中,结合完成后,共用4个胶体积的20mM PB+0.5M pH为7.5的NaCl溶液清洗,接着用5个胶体积的室温注射水清洗,再用1个胶体积酶切缓冲液进行清洗,其中酶切缓冲液为20mMPB和0.15M NaCl混合的pH为7.5的溶液。
7.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(1)中蛋白工作种子批菌种为MntC或HI或mSEB或SpA5中的一种。
8.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(8)中,采用采用G25层析柱对蛋白液进行脱盐。
9.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(9)中,采用QHP层析柱对蛋白脱盐样去内毒素。
10.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌疫苗的规模化制备方法,其特征在于,步骤(7)中,采用SPHP层析柱或MMC层析柱对蛋白酶切液进行纯化。
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