CN113980103B - 一种mSEB抗原蛋白的纯化方法 - Google Patents

一种mSEB抗原蛋白的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，解决了现有技术中mSEB蛋白纯化工艺获得的mSEB蛋白原液纯度不高，且存放稳定性差，会出现纯度下降的情况的技术问题。它包括下述步骤：S1、菌体破碎；S2、澄清过滤；S3、SPFF柱层析；S4、SPHP柱层析；S5、Phenyl HP柱层析；S6、G25柱层析；S7、Q HP柱层析；S8、原液制备。本发明纯化方法获得的mSEB蛋白原液纯度高，且存放稳定性好，不会出现纯度下降的情况。

Description

一种mSEB抗原蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种mSEB抗原蛋白的纯化方法。
背景技术
金葡菌是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌，呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，急需研制疫苗控制其感染与流行。
金葡菌有“嗜肉菌"的别称，作为革兰氏阳性菌的代表，是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性为特征，局部可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身可导致急性肺炎、脓毒血症、心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA） 自1961年被首次发现至今，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的院內感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，被称为“第一超级细菌”。
MRSA分为医院获得性MRSA（healthcare-associated MRSA，HA-MRSA）及社区获得性MRSA（community-associated MRSA，CA-MRSA）。
2009年，据美国CDC在《新英格兰医学杂志》报道，美国每年MRSA严重感染人数约为9万人，致死病例约为2万人。2010年12月中国“MRSA院内感染诊治策略新进展”会议资料显示，我国内地医院院内MRSA感染发生率约为8%，每例院内感染患者平均住院时间延长14天，花费增加6542元，全国每年因医院感染造成的直接损失超过150亿元。同时，由于抗生素的滥用，临床高度耐药性金葡菌，尤其是MRSA 的分离检出率逐年上升。中国2011年全国细菌耐药监测报告显示，在全国129家三甲医院被检的273808株细菌中，金葡菌位列临床革兰阳性菌分离量首位，MRSA检出率占被检出金葡菌的60%，广泛耐药率超过40%。基于这种严峻形势，我国已将MRSA 列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。当前MRSA已与乙型肝炎、AIDS 被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。目前，万古霉素是治疗MRSA感染的最后一道防线，但随着2002年耐万古霉素金黄色葡萄球菌（vancomycin-resistant staphylococcus aureus，VRSA）的相继出现，高度耐药性发展的MRSA和VRSA在全球呈蔓延趋势，使得临床金葡菌的感染面临“无药可治”的严峻挑战。
抗生素的研发速度远远跟不上细菌耐药性的发展速度，而安全有效的金葡菌疫苗将可成为预防金葡菌感染的有效手段。WHO于2011年提出了“抵抗耐药菌”的“六点政策一揽子计划”，并强调在未来重点支持创新性疫苗等免疫防控制品的研发。因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌疫苗将对有效控制金葡菌广泛感染及大规模爆发流行、大幅降低金葡菌院内感染的发病率及耐药性蔓延等方面具有重要的现实及战略意义。
金葡菌疫苗mSEB抗原蛋白概述：
SEB是超抗原外毒素，通常由致病性金葡菌特别是MRSA 产生，是引起人类脓毒症休克、全身炎症反应、食物中毒的主要原因。由于SEB是超抗原，不受MHC分子限制，在不依赖抗原识别的情况下直接结合T细胞抗原表位，从而激活T细胞，促使T 细胞大量释放细胞因子而引起毒素休克综合征等临床症状。
经Blast比对证实，SEB在金葡菌各菌株中氨基酸序列高度保守。小鼠模型中的研究证实， SEB具有比其他抗原更好的体液应答优势，制备的人SEB单克隆抗体可有效治疗金葡菌感染常见的毒性休克综合症。2010年美国国立***反应与传染病研究所（NIAID）已用野生型SEB制备疫苗，已进入人体I期临床研究。
申请人参照相关研究文献构建获得了SEB三位点(L45R,Y89A,Y94A)突变体mSEB作为重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原组分之一。经体内外实验证实：mSEB不再具有野生型SEB的毒性及超抗原活性；动物安全性评价及免疫保护结果亦显示：mSEB消除了肠毒素活性，保证了良好的安全性，保留了良好的免疫原性。其单组分免疫所产生的BALB/c小鼠免疫攻毒保护率大于25%。此外，未发现其他生物学功能的变化。
mSEB蛋白的现有纯化工艺是将破菌液直接经过SPHP层析进行蛋白的捕获，以达到初步纯化目的蛋白的目的。但该步骤在工艺放大过程中出现反压较高情况。
重组mSEB蛋白翻译后，在大肠杆菌细胞质内以可溶的形式存在。由于其序列中存在2个半胱氨酸，大肠杆菌细胞质内的还原环境使这些半胱氨酸的巯基以活跃的还原形式存在，由于原有的mSEB纯化工艺中没有专门的复性步骤，使二硫键的形成不够完全，部分半胱氨酸以自由巯基形式存在。在原液储存过程中，这些自由巯基会自发性的形成二硫键，如果两个蛋白分子之间的半胱氨酸形成二硫键，便产生mSEB二聚体或多聚集体，导致纯度的下降。
本申请人发现现有技术至少存在以下技术问题：
1、mSEB蛋白的现有纯化工艺是将破菌液直接经过SPHP层析进行蛋白的捕获, 在工艺放大过程中会出现反压较高情况；
2、现有技术中mSEB蛋白纯化工艺获得的mSEB蛋白原液纯度不高，且存放稳定性差，会出现纯度下降的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，以解决现有技术中mSEB蛋白纯化工艺获得的mSEB蛋白原液纯度不高，且存放稳定性差，会出现纯度下降的情况的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
S1、菌体破碎
将mSEB菌体溶解并破碎，得到菌液A；
S2、澄清过滤
将步骤S1中的菌液A离心，收集上清；将上清进行澄清过滤，得到菌液B；
S3、SPFF柱层析
将步骤S2得到的菌液B采用GE SPFF填料装填层析柱对菌液B进行初级纯化，得到SPFF洗脱液；
S4、SPHP柱层析
将步骤S3得到的SPFF洗脱液采用GE SPHP填料装填层析柱对SPFF洗脱液进行中度纯化，得到SPHP洗脱液；
S5、Phenyl HP柱层析
E1、将SPHP洗脱液用硫酸铵溶液进行稀释；按体积比，SPHP洗脱液：硫酸铵溶液=1：0.5～5.0；所述硫酸铵溶液为20mM PB+3M（NH4）2SO4，其pH为6.0；得到SPHP洗脱液稀释液，待进行下一步纯化；
E2、采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP洗脱液稀释液进行精细纯化，得到phenyl HP洗脱液；
S6、G25柱层析
采用G25层析柱对phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到G25层析液；
S7、Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；
S8、原液制备
将Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中除菌过滤，得到mSEB蛋白原液；
在步骤S5之前还包括蛋白质复性，所述蛋白质复性的方法为包括在步骤S3中进行SPFF柱层析柱上复性或者在步骤S4中进行蛋白酶辅因子法复性；
当在步骤S3中进行PFF柱层析柱上复性时，
①步骤S3具体为：
层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；
流动相A：20mM PB（pH6.0）；
流动相B：20mM PB+5mM GSH+0.5mM GSSG（pH6.0）；
流动相C：20mM PB+1M NaCl（pH6.0）；
上样参数：
上样流速：36～72L/h；紫外检测波长：UV 280nm；上样完成后使用流动相A平衡柱子；
复平衡1参数：
流速：36～72L/h，复平衡2-3个柱体积，待基线走平，使用流动相B进行柱上复性20CV；
流速：3.6～7.2L/h，柱上复性过夜4-20h；次日复性完成后，使用流动相A平衡柱子；
复平衡2参数：
流速：36～72L/h，复平衡1-2个柱体积，待基线走平，开始洗脱；
洗脱参数：流速36～72L/h；梯度为：A：C=0-50%，10个柱体积；
洗脱过程检测UV280吸收图谱，起始收集UV值（mAU）大于600mAU；结束收集UV值（mAU）小于700mAU，得到SPFF洗脱液；
②步骤S4具体为：
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm ，将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；
D2、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D3、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，得到SPHP洗脱液；
当在步骤S4中进行蛋白酶辅因子法复性时，
①步骤S3具体为：
SPFF柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；
缓冲液：
SPFF平衡液：pH6.0～6.5、20-50mM的PB；
SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0；
上样流速：36～72L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36～72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速36～72L/h，洗脱梯度0～50%B,10CV；
收集标准：当UV280nm=200～600mAU时开始收集峰，当UV280nm=700～200mAU时停止收集，得到SPFF洗脱液；
②步骤S4具体为：
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm，加入终浓度为1～50μmM的CuSO4溶液，以50～100RPM转速搅拌、2～8℃保温4～20h；
D2、将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；
D3、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D4、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；
缓冲液：
SPHP平衡液：pH6.0～6.5、20～50mM的PB；
SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0～6.5；
上样流速：12～24L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12～24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12～24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：当UV280nm=200～600mAU时开始收集峰，当UV280nm=1000～200mAU停止收集，得到SPHP洗脱液。
进一步的，所述步骤S1中，菌体破碎具体为：
A1、mSEB菌体溶解，按质量体积比，mSEB菌体：菌体溶解溶液=1：15～25，在温度不超过20℃进行mSEB菌体的溶解；
A2、mSEB菌体破碎，待mSEB菌体溶解后，使用匀质机在温度不超过20℃、压力为700～800bar破碎2～4次，得到菌液A。
进一步的，所述步骤A1中，所述菌体溶解溶液为20～50mM的 PB ，其pH 6.0～6.5。
进一步的，所述步骤S2中，澄清过滤具体为：
B1、将步骤S1中的菌液A使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；
B2、将步骤B1中收集的上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤。
进一步的，所述步骤S5中，Phenyl HP柱层析进行精细纯化时，
层析柱：柱高9～11cm，柱直径140mm、柱体积1～2L；
缓冲液：
Phenyl HP平衡液：20～50mM PB+0.25～2.5M（NH4）2SO4，其pH为6.0～6.5；
Phenyl HP洗脱液：pH6.0～6.5、20～50mM的PB；
上样流速：12～24L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12～24L/h，平衡体积：3～5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12～24L/h，洗脱梯度：0～100%B，10CV；
样品收集：收集洗脱液，UV280nm=500～1500mAU开始收集，当UV280nm=1000～200mAU停止收集，得到phenyl HP洗脱液。
进一步的，所述步骤S6中，G25柱层析进行脱盐换液时，
层析柱：柱高28～30cm、柱直径300mm、柱体积为20～22L；
平衡液：10～50mML-His+0.9%～1.5%NaCl，其pH为6.0～6.5；
上样流速：50～80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的30%；
检测洗脱液UV280吸收，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，得到G25层析液；如分次层析，则合并每次洗脱液。
进一步的，所述步骤S7中，Q HP柱层析进行层析时，
层析柱：柱高9～11cm、柱直径140mm、柱体积1～2L；
平衡液：10～50mM L-His+0.9%～1.5%NaCl，其pH为6.0～6.5；
上样流速：12～24L/h；
收集流穿液，收集标准：当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，得到Q HP流穿液。
进一步的，所述步骤S8中，除菌过滤采用的是0.22μm滤器。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
本发明提供的mSEB抗原蛋白的纯化方法获得的mSEB蛋白原液纯度高，且存放稳定性好，不会出现纯度下降的情况，具体来说有以下优势：
（1）本发明增加了澄清过滤步骤，去除了菌液A中细小颗粒物以及大量核酸等杂质，提高了菌液B的澄清度，降低了后续层析填料的高柱压，增加填料寿命；
（2）本发明增加了SPFF 柱层析（SPFF阳离子层析）作为初级纯化步骤，快速捕获目的蛋白，使目的蛋白从成分复杂的破菌上清液中浓缩和稳定；将SPHP 柱层析（SPHP阳离子层析）设置为中度纯化步骤，去除mSEB 菌体中含有的SPFF步骤中仍未去除的大量杂质，例如HCP、核酸、酶以及可能出现的聚体；并且，在初级纯化或中度纯化步骤中增加蛋白质复性步骤，受氧化环境的影响，mSEB的2个半胱氨酸会氧化，使具有活性的巯基变成惰性的二硫键，二硫键的形成，增加了蛋白质的稳定性，并在SPHP柱层析和Phenyl HP 柱层析时将复性时mSEB蛋白二硫键错配形成的二聚体和多聚体去除，从而提高原液纯度和稳定性；
（4）本发明将Phenyl HP 柱层析（PHP疏水层析）设置为精细纯化步骤，同时优化了梯度洗脱收峰标准，去除痕量的杂质，使目的蛋白各项指标符合质量标准要求；
（5）本发明采用G25层析进行缓冲液置换，采用Q HP层析进行内毒素的有效去除，与前述步骤进行有效的衔接，最终样品采用0.22μm滤膜除菌过滤后进行分装工作得到蛋白原液进行保存。
附图说明
图1是对比例1得到的mSEB蛋白原液的电泳图；
图2是实施例1得到的mSEB蛋白原液的电泳图；
图3是对比例1中间过程样品的电泳图；
图4是实施例1中间过程样品的电泳图。
具体实施方式
实施例1：
本发明提供的一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
S1、菌体破碎
A1、mSEB菌体溶解，按质量体积比，mSEB菌体：菌体溶解溶液=1：20，在温度不超过20℃进行mSEB菌体的溶解；所述菌体溶解溶液为pH 6.0、20mM的 PB；
A2、mSEB菌体破碎，待mSEB菌体溶解后，使用匀质机在温度不超过20℃、压力为750bar破碎3次，得到菌液A；菌液A的上清液取样1ml/支×20支①，为样品①；
S2、澄清过滤
B1、将步骤S1中的菌液A使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000g，2～8℃离心20min，收集上清；
B2、将步骤B1中收集的上清使用Cobetter 0.6～0.8μm进行澄清过滤，得到菌液B；检测过滤前后的综合浊度值，记录浊度数据；菌液B取样1ml/支×20支②，为样品②；
S3、SPFF柱层析
将步骤S2得到的菌液B采用GE SPFF填料装填层析柱对菌液B进行初级纯化，SPFF柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L。
缓冲液：
SPFF平衡液：pH6.0、20mM的PB；
SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0；
上样流速：36-72L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：54L/h，平衡体积：6CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速54L/h，洗脱梯度0～50%B,10CV；
收集标准：当UV280nm=400mAU时开始收集峰，当UV280nm=300mAU时停止收集，得到SPFF洗脱液；
记录洗脱SPFF液体积，SPFF洗脱液取样1ml/支×20支③，为样品③；
再生：使用20mM PB+1M NaCl（pH 6.0）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释3倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率5.0 ms/cm，加入终浓度为25μmM的CuSO4溶液，以75RPM转速搅拌、5℃保温12h；
D2、将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000g，2～8℃离心20min，收集上清；
D3、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D4、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L；
缓冲液：
SPHP平衡液：pH6.0、20mM的PB；
SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0；
上样流速：18L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速18L/h；平衡体积：3CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速18L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：当UV280nm=400mAU时开始收集峰，当UV280nm=800mAU停止收集，得到SPHP洗脱液；
记录SPHP洗脱液体积，SPHP洗脱液取样1ml/支×20支④，为样品④；
再生：使用20mM PB+1M NaCl（pH 6.0）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S5、Phenyl HP柱层析
E1、将 SPHP 洗脱液用硫酸铵溶液进行稀释；按体积比，SPHP洗脱液：硫酸铵溶液=1：3.0；所述硫酸铵溶液为20mM PB+3M（NH4）2SO4，其 pH为6.0；得到SPHP洗脱液稀释液，待进行下一步纯化；
E2、采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP洗脱液稀释液进行精细纯化，Phenyl HP柱层析进行精细纯化时，
层析柱：柱高约10cm，柱直径140mm、柱体积约1.5L；
缓冲液：
Phenyl HP平衡液：20mM PB+1.5M（NH4）2SO4，其pH为6.0；
Phenyl HP洗脱液：pH6.0、20mM的PB；
上样流速：18L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：18L/h，平衡体积：4CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：18L/h，洗脱梯度：0～100%B，10CV；
样品收集：收集洗脱液，UV280nm=1000mAU开始收集，当UV280nm=200mAU停止收集，得到phenyl HP洗脱液；
记录phenyl HP洗脱液体积，phenyl HP洗脱液取样1ml/支×20支⑤，为样品⑤；
再生：使用20mM PB（pH 6.0）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S6、G25柱层析
采用G25层析柱对phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，G25柱层析进行脱盐换液时，
层析柱：柱高约29cm、柱直径300mm、柱体积约为20L；
平衡液：10mM L-His+0.9%NaCl，其pH为6.0；
上样流速：50～80L/h；
上样量≤柱床体积的30%；
检测洗脱液UV280吸收，当UV280nm=50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集（如分次层析，则合并每次洗脱液），得到G25层析液；
洗脱液合并混匀后，取样1ml/支×20支⑥，为样品⑥；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S7、Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对G25层析液进行层析，Q HP柱层析进行层析时，
层析柱：柱高约10cm、柱直径140mm、柱体积约为1.5L；
平衡液：10mM L-His+0.9%NaCl，其pH为6.0；
上样流速：18L/h；
收集流穿液，收集标准：当UV280nm=50mAU时开始收集，当UV280nm=40mAU停止收集，得到Q HP流穿液；
Q HP流穿液取样1ml/支×20支⑦，为样品⑦；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S8、原液制备
将Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中采用0.22μm滤器除菌过滤，得到mSEB蛋白原液。
实施例2：
本发明提供的一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
S1、菌体破碎
A1、mSEB菌体溶解，按质量体积比，mSEB菌体：菌体溶解溶液=1：25，在温度不超过20℃进行mSEB菌体的溶解；所述菌体溶解溶液为pH 6.5、50mM的 PB；
A2、mSEB菌体破碎，待mSEB菌体溶解后，使用匀质机在温度不超过20℃、压力为800bar破碎2次，得到菌液A；菌液A的上清液取样1ml/支×20支①，为样品①；
S2、澄清过滤
B1、将步骤S1中的菌液A使用高速冷冻离心机离心，离心参数：15000g，2℃离心30min，收集上清；
B2、将步骤B1中收集的上清使用Cobetter 0.6～0.8μm进行澄清过滤，得到菌液B；检测过滤前后的综合浊度值，记录浊度数据；菌液B取样1ml/支×20支②，为样品②；
S3、SPFF柱层析
将步骤S2得到的菌液B采用GE SPFF填料装填层析柱对菌液B进行初级纯化，SPFF柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L。
缓冲液：
SPFF平衡液：pH6.5、50mM的PB；
SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.5；
上样流速：72L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：72L/h，平衡体积：8CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速72L/h，洗脱梯度0～50%B,10CV；
收集标准：当UV280nm=600mAU时开始收集峰，当UV280nm=300mAU时停止收集，得到SPFF洗脱液；
记录洗脱SPFF液体积，SPFF洗脱液取样1ml/支×20支③，为样品③；
再生：使用50mM PB+1M NaCl（pH 6.5）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率8.0 ms/cm，加入终浓度为50μmM的CuSO4溶液，以100 RPM转速搅拌、8℃保温4h；
D2、将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：15000g，2～8℃离心30min，收集上清；
D3、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D4、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L；
缓冲液：
SPHP平衡液：pH6.5、50mM的PB；
SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.5；
上样流速： 24L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速24L/h；平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：当UV280nm=600mAU时开始收集峰，当UV280nm=200mAU停止收集，得到SPHP洗脱液；
记录SPHP洗脱液体积，SPHP洗脱液取样1ml/支×20支④，为样品④；
再生：使用50mM PB+1M NaCl（pH 6.5）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S5、Phenyl HP柱层析
E1、将 SPHP 洗脱液用硫酸铵溶液进行稀释；按体积比，SPHP洗脱液：硫酸铵溶液=1：5.0；所述硫酸铵溶液为20mM PB+3M（NH4）2SO4，其pH6.0，得到SPHP洗脱液稀释液，待进行下一步纯化；
E2、采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP洗脱液稀释液进行精细纯化，Phenyl HP柱层析进行精细纯化时，
层析柱：柱高约10cm，柱直径140mm、柱体积约1.5L；
缓冲液：
Phenyl HP平衡液：50mM PB+2.5M（NH4）2SO4，其pH为6.5；
Phenyl HP洗脱液：pH6.5、50mM的PB；
上样流速： 24L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：24L/h，平衡体积：5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：24L/h，洗脱梯度：0～100%B，10CV；
样品收集：收集洗脱液，UV280nm=1500mAU开始收集，当UV280nm=500mAU停止收集，得到phenyl HP洗脱液；
记录phenyl HP洗脱液体积，phenyl HP洗脱液取样1ml/支×20支⑤，为样品⑤；
再生：使用50mM PB（pH 6.5）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S6、G25柱层析
采用G25层析柱对phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，G25柱层析进行脱盐换液时，
层析柱：柱高约29cm、柱直径300mm、柱体积约为20L；
平衡液：50mM L-His+1.5%NaCl，其pH为6.5；
上样流速：50～80L/h；
上样量≤柱床体积的30%；
检测洗脱液UV280吸收，当UV280nm=50mAU时开始收集，当UV280nm=50mAU停止收集（如分次层析，则合并每次洗脱液），得到G25层析液；
洗脱液合并混匀后，取样1ml/支×20支⑥，为样品⑥；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S7、Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对G25层析液进行层析，Q HP柱层析进行层析时，
层析柱：柱高约10cm、柱直径140mm、柱体积约1.5L；
平衡液：50mM L-His+1.5%NaCl，其pH为6.5；
上样流速：12～24L/h；
收集流穿液，收集标准：当UV280nm=60mAU时开始收集，当UV280nm=50mAU停止收集，得到Q HP流穿液；
Q HP流穿液取样1ml/支×20支⑦，为样品⑦；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S8、原液制备
将Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中采用0.22μm滤器除菌过滤，得到mSEB蛋白原液。
实施例3：
本发明提供的一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，包括下述步骤：
S1、菌体破碎
A1、mSEB菌体溶解，按质量体积比，mSEB菌体：菌体溶解溶液=1：15，在温度不超过20℃进行mSEB菌体的溶解；所述菌体溶解溶液为pH 6.2、35mM的 PB；
A2、mSEB菌体破碎，待mSEB菌体溶解后，使用匀质机在温度不超过20℃、压力为700bar破碎4次，得到菌液A；菌液A的上清液取样1ml/支×20支①，为样品①；
S2、澄清过滤
B1、将步骤S1中的菌液A使用高速冷冻离心机离心，离心参数：13500g，2℃离心25min，收集上清；
B2、将步骤B1中收集的上清使用Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，得到菌液B；检测过滤前后的综合浊度值，记录浊度数据；菌液B取样1ml/支×20支②，为样品②；
S3、SPFF柱层析
将步骤S2得到的菌液B采用GE SPFF填料装填层析柱对菌液B进行初级纯化，SPFF柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L。
缓冲液：
SPFF平衡液：pH6.2、35mM的PB；
SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.2；
上样流速：36L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36L/h，平衡体积：5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速36L/h，洗脱梯度0～50%B,10CV；
收集标准：当UV280nm=200mAU时开始收集峰，当UV280nm=700mAU时停止收集，得到SPFF洗脱液；
记录洗脱SPFF液体积，SPFF洗脱液取样1ml/支×20支③，为样品③；
再生：使用35mM PB+1M NaCl（pH 6.2）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0 ms/cm，加入终浓度为1μmM的CuSO4溶液，以50RPM转速搅拌、2℃保温20h；
D2、将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12500g，2℃离心25min，收集上清；
D3、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D4、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L；
缓冲液：
SPHP平衡液：pH6.2、35mM的PB；
SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.2；
上样流速：12L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12L/h；平衡体积：2CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：当UV280nm=200mAU时开始收集峰，当UV280nm=1000mAU停止收集，得到SPHP洗脱液；
记录SPHP洗脱液体积，SPHP洗脱液取样1ml/支×20支④，为样品④；
再生：使用35mM PB+1M NaCl（pH 6.2）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S5、Phenyl HP柱层析
E1、将 SPHP 洗脱液用硫酸铵溶液进行稀释；按体积比，SPHP洗脱液：硫酸铵溶液=1：0.5；所述硫酸铵溶液为20mM PB+3M（NH4）2SO4，其pH为6.0；得到SPHP洗脱液稀释液，待进行下一步纯化；
E2、采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP洗脱液稀释液进行精细纯化，Phenyl HP柱层析进行精细纯化时，
层析柱：柱高约10cm，柱直径140mm、柱体积约1.5L；
缓冲液：
Phenyl HP平衡液：35mM PB+1.5M（NH4）2SO4，其pH为6.2；
Phenyl HP洗脱液：pH6.2、35mM的PB；
上样流速：12L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12L/h，平衡体积：3CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12L/h，洗脱梯度：0～100%B，10CV；
样品收集：收集洗脱液，UV280nm=500mAU开始收集，当UV280nm=1000mAU停止收集，得到phenyl HP洗脱液；
记录phenyl HP洗脱液体积，phenyl HP洗脱液取样1ml/支×20支⑤，为样品⑤；
再生：使用35mM PB（pH 6.2）冲洗层析柱1-2CV进行再生；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S6、G25柱层析
采用G25层析柱对phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，G25柱层析进行脱盐换液时，
层析柱：柱高约29cm、柱直径300mm、柱体积约为20L；
平衡液：35mM L-His+1.2%NaCl，其pH为6.2；
上样流速：50～80L/h；
上样量≤柱床体积的30%；
检测洗脱液UV280吸收，当UV280nm=55mAU时开始收集，当UV280nm=45mAU停止收集（如分次层析，则合并每次洗脱液），得到G25层析液；
洗脱液合并混匀后，取样1ml/支×20支⑥，为样品⑥；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S7、Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对G25层析液进行层析，Q HP柱层析进行层析时，
层析柱：柱高约10cm、柱直径140mm、柱体积约1.5L；
平衡液：35mM L-His+1.2%NaCl，其pH为6.2；
上样流速：12L/h；
收集流穿液，收集标准：当UV280nm=55mAU时开始收集，当UV280nm=45mAU停止收集，得到Q HP流穿液；
Q HP流穿液取样1ml/支×20支⑦，为样品⑦；
CIP：使用1M NaOH溶液冲洗层析柱1-2CV进行CIP；
保存：使用0.01M NaOH或20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S8、原液制备
将Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中采用0.22μm滤器除菌过滤，得到mSEB蛋白原液。
实施例4：
本实施例与实施例1不同的是：
S3、SPFF柱层析
将步骤 S2 得到的菌液 B 采用 GE SPFF 填料装填层析柱对菌液 B 进行初级纯化，SPFF 柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积约6.0L；
流动相A：20mM PB（pH6.0）；
流动相B：20mM PB+5mM GSH+0.5mM GSSG（pH6.0）；
流动相C：20mM PB+1M NaCl（pH6.0）；
上样参数：
上样流速：54L/h；紫外检测波长：UV 280nm；上样完成后使用流动相A平衡柱子；
复平衡1参数：
流速：54L/h，复平衡3个柱体积，待基线走平，使用流动相B进行柱上复性20CV；
流速：5.4L/h，柱上复性过夜12h；次日复性完成后，使用流动相A平衡柱子；
复平衡2参数：
流速：54L/h，复平衡2个柱体积，待基线走平，开始洗脱；
洗脱参数：流速54L/h；梯度为：A：C=0-50%，10个柱体积；
洗脱过程检测UV280吸收图谱，起始收集UV值（mAU）=620mAU；结束收集UV值（mAU）=680mAU，得到SPFF洗脱液；
记录洗脱 SPFF 液体积，SPFF 洗脱液取样 1ml/支×20 支③，为样品③；
再生：使用 20mM PB+1M NaCl（pH 6.0）冲洗层析柱 1-2CV 进行再生；
CIP：使用 1M NaOH 溶液冲洗层析柱 1-2CV 进行 CIP；
保存：使用 0.01M NaOH 或 20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释3倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率5.0 ms/cm ，将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000g，5℃离心20min，收集上清；
D2、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D3、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化， SPHP 柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高约 19cm、柱直径 200mm、柱体积约 6.0L；
缓冲液：
SPHP 平衡液：pH6.0、20mM 的 PB；
SPHP 洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其 pH 为 6.0；
上样流速：18L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速 18L/h；平衡体积：3CV，至UV 值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速 18L/h，洗脱梯度 0～50%B，10CV；
收集标准：当 UV280nm=400mAU 时开始收集峰，当 UV280nm=200mAU 停止收集，得到 SPHP 洗脱液；
记录 SPHP 洗脱液体积，SPHP 洗脱液取样 1ml/支×20 支④，为样品④；
再生：使用 20mM PB+1M NaCl（pH 6.0）冲洗层析柱 1-2CV 进行再生；
CIP：使用 1M NaOH 溶液冲洗层析柱 1-2CV 进行 CIP；
保存：使用 0.01M NaOH 或 20%乙醇溶液对层析柱进行保存。
其他同实施例1，得到mSEB蛋白原液。
实施例5：
本实施例与实施例1不同的是：
S3、SPFF柱层析
将步骤 S2 得到的菌液 B 采用 GE SPFF 填料装填层析柱对菌液 B 进行初级纯化，SPFF 柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积6.0L；
流动相A：20mM PB（pH6.0）；
流动相B：20mM PB+5mM GSH+0.5mM GSSG（pH6.0）；
流动相C：20mM PB+1M NaCl（pH6.0）；
上样参数：
上样流速：72L/h；紫外检测波长：UV 280nm；上样完成后使用流动相A平衡柱子；
复平衡1参数：
流速：72L/h，复平衡2-3个柱体积，待基线走平，使用流动相B进行柱上复性20CV；
流速：7.2L/h，柱上复性过夜4h；次日复性完成后，使用流动相A平衡柱子；
复平衡2参数：
流速：72L/h，复平衡2个柱体积，待基线走平，开始洗脱；
洗脱参数：流速72L/h；梯度为：A：C=0-50%，10个柱体积；
洗脱过程检测UV280吸收图谱，起始收集UV值（mAU）大于600mAU；结束收集UV值（mAU）小于700mAU，得到SPFF洗脱液；记录洗脱 SPFF 液体积，SPFF 洗脱液取样 1ml/支×20 支③，为样品③；
再生：使用 50mM PB+1M NaCl（pH 6.5）冲洗层析柱 1-2CV 进行再生； 10
CIP：使用 1M NaOH 溶液冲洗层析柱 1-2CV 进行 CIP；
保存：使用 0.01M NaOH 或 20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率8.0 ms/cm ，将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：15000g，2℃离心30min，收集上清；
D2、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D3、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP 柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高约 19cm、柱直径 200mm、柱体积约 6.0L；
缓冲液：
SPHP 平衡液：pH6.5、50mM 的 PB；
SPHP 洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其 pH 为 6.5；
上样流速： 24L/h；复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速 24L/h；平衡体积：5CV，至 UV 值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速 24L/h，洗脱梯度 0～50%B，10CV；
收集标准：当 UV280nm=600mAU 时开始收集峰，当 UV280nm=200mAU 停止收集，得到 SPHP 洗脱液；
记录 SPHP 洗脱液体积，SPHP 洗脱液取样 1ml/支×20 支④，为样品④；
再生：使用 50mM PB+1M NaCl（pH 6.5）冲洗层析柱 1-2CV 进行再生；
CIP：使用 1M NaOH 溶液冲洗层析柱 1-2CV 进行 CIP；
保存：使用 0.01M NaOH 或 20%乙醇溶液对层析柱进行保存。
其他同实施例1，得到mSEB蛋白原液。
实施例6：
本实施例与实施例1不同的是：
S3、SPFF柱层析
层析柱：柱高约19cm、柱直径200mm、柱体积6.0L；
流动相A：20mM PB（pH6.0）；
流动相B：20mM PB+5mM GSH+0.5mM GSSG（pH6.0）；
流动相C：20mM PB+1M NaCl（pH6.0）；
上样参数：
上样流速：36L/h；紫外检测波长：UV 280nm；上样完成后使用流动相A平衡柱子；
复平衡1参数：
流速：36L/h，复平衡2个柱体积，待基线走平，使用流动相B进行柱上复性20CV；
流速：3.6L/h，柱上复性过夜20h；次日复性完成后，使用流动相A平衡柱子；
复平衡2参数：
流速：36L/h，复平衡1个柱体积，待基线走平，开始洗脱；
洗脱参数：流速36L/h；梯度为：A：C=0-50%，10个柱体积；
洗脱过程检测UV280吸收图谱，起始收集UV值（mAU）大于600mAU；结束收集UV值（mAU）小于700mAU，得到SPFF洗脱液；记录洗脱 SPFF 液体积，SPFF 洗脱液取样 1ml/支×20 支③，为样品③；
再生：使用 35mM PB+1M NaCl（pH 6.2）冲洗层析柱 1-2CV 进行再生；
CIP：使用 1M NaOH 溶液冲洗层析柱 1-2CV 进行 CIP；
保存：使用 0.01M NaOH 或 20%乙醇溶液对层析柱进行保存；
S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0 ms/cm ，将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000g，8℃离心30min，收集上清；
D2、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D3、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP 柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高约 19cm、柱直径 200mm、柱体积约 6.0L；
缓冲液：
SPHP 平衡液：pH6.2、35mM 的 PB；
SPHP 洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其 pH 为 6.2；
上样流速：12L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速 12L/h；平衡体积：2CV，至 UV 值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速 12L/h，洗脱梯度 0～50%B，10CV；
收集标准：当 UV280nm=200mAU 时开始收集峰，当 UV280nm=1000mAU 停止收集，得到 SPHP 洗脱液；
记录 SPHP 洗脱液体积，SPHP 洗脱液取样 1ml/支×20 支④，为样品④；
再生：使用 35mM PB+1M NaCl（pH 6.2）冲洗层析柱 1-2CV 进行再生；
CIP：使用 1M NaOH 溶液冲洗层析柱 1-2CV 进行 CIP； 5
保存：使用 0.01M NaOH 或 20%乙醇溶液对层析柱进行保存。
其他同实施例1，得到mSEB蛋白原液。
二、对比例
对比例1：
与实施例1不同的是：S4、SPHP柱层析
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm（不添加CuSO4溶液）；
其余同实施例1，得到mSEB蛋白原液。
三、实验例
1、将实施例1-6和对比例1中的得到的mSEB蛋白原液以及中间过程样品进行电泳纯度对比，通过BioRad公司的Image Lab分析软件进行检测，结果如图1-图4、下表1所示。
Figure SMS_1
由图1-图4、表1可以看出，对mSEB进行复性后，SPHP柱层析后取样的样品即可满足95%纯度要求，即能符合质量标准，而对比例1不能，对比例1在Phenyl HP后可以达到97%，而本发明实施例最高可达100%，实施例1-6中得到的mSEB蛋白原液纯度均能达到100.0%，符合原液纯度标准，并且远高于对比例1中原液纯度；并且，在对比例1中，其样品样品④、样品⑤、样品⑥样品⑦和mSEB蛋白原液的数据存在忽高忽低的情况，是因为对比例1未进行复性，所以其过程样品才会存在这种情况，因为未复性产生了聚集体导致纯度不佳。
2、将实施例1-6中以及对比例1中得到的mSEB蛋白原液在-60～-80℃超低温保存12个月，分别在1个月后、3个月后、6个月后、9个月后和12个月后进行纯度检测，结果如下表2所示。
Figure SMS_2
由表2可知，实施例1-6中得到的mSEB蛋白原液可以满足12个月纯度无明显下降；而对比例1在6个月已低于质量标准，稳定性只能保持3个月。由于6个月和9个月检测时已经低于标准，故12个月无需再测定，产品已经不合格。实施例1-6中得到的mSEB蛋白原液没有聚集体产生，纯度与零点纯度接近。足以说明本发明实施例的复性效果很好，可以很好解决mSEB聚体问题，提高mSEB蛋白原液纯度及mSEB蛋白原液的存放稳定性。

Claims (8)

1.一种mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，包括下述步骤：
S1、菌体破碎
将mSEB菌体溶解并破碎，得到菌液A；
S2、澄清过滤
将步骤S1中的菌液A离心，收集上清；将上清进行澄清过滤，得到菌液B；
S3、SPFF柱层析
将步骤S2得到的菌液B采用GE SPFF填料装填层析柱对菌液B进行初级纯化，得到SPFF洗脱液；
S4、SPHP柱层析
将步骤S3得到的SPFF洗脱液采用GE SPHP填料装填层析柱对SPFF洗脱液进行中度纯化，得到SPHP洗脱液；
S5、Phenyl HP柱层析
E1、将SPHP洗脱液用硫酸铵溶液进行稀释；按体积比，SPHP洗脱液：硫酸铵溶液=1：0.5～5.0；所述硫酸铵溶液为20mM PB+3M（NH4）2SO4，其pH为6.0；得到SPHP洗脱液稀释液，待进行下一步纯化；
E2、采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对SPHP洗脱液稀释液进行精细纯化，得到phenyl HP洗脱液；
S6、G25柱层析
采用G25层析柱对phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到G25层析液；
S7、Q HP柱层析
采用Q HP层析柱对G25层析液进行层析，得到Q HP流穿液；
S8、原液制备
将Q HP流穿液在生物安全柜或无菌隔离器中除菌过滤，得到mSEB蛋白原液；
在步骤S5之前还包括蛋白质复性，所述蛋白质复性的方法为包括在步骤S3中进行SPFF柱层析柱上复性或者在步骤S4中进行蛋白酶辅因子法复性；
当在步骤S3中进行PFF柱层析柱上复性时，
①步骤S3具体为：
层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；
流动相A：20mM PB，pH6.0；
流动相B：20mM PB+5mM GSH+0.5mM GSSG，pH6.0；
流动相C：20mM PB+1M NaCl，pH6.0；
上样参数：
上样流速：36～72L/h；紫外检测波长：UV 280nm；上样完成后使用流动相A平衡柱子；
复平衡1参数：
流速：36～72L/h，复平衡2-3个柱体积，待基线走平，使用流动相B进行柱上复性20CV；
流速：3.6～7.2L/h，柱上复性过夜4-20h；次日复性完成后，使用流动相A平衡柱子；
复平衡2参数：
流速：36～72L/h，复平衡1-2个柱体积，待基线走平，开始洗脱；
洗脱参数：流速36～72L/h；梯度为：A：C=0-50%，10个柱体积；
洗脱过程检测UV280吸收图谱，起始收集UV值（mAU）大于600mAU；结束收集UV值（mAU）小于700mAU，得到SPFF洗脱液；
②步骤S4具体为：
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm ，将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；
D2、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D3、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，得到SPHP洗脱液；
当在步骤S4中进行蛋白酶辅因子法复性时，
①步骤S3具体为：
SPFF柱层析进行初级纯化时：
层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；
缓冲液：
SPFF平衡液：pH6.0～6.5、20-50mM的PB；
SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0；
上样流速：36～72L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36～72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速36～72L/h，洗脱梯度0～50%B,10CV；
收集标准：当UV280nm=200～600mAU时开始收集峰，当UV280nm=700～200mAU时停止收集，得到SPFF洗脱液；
②步骤S4具体为：
D1、将步骤S3得到的SPFF洗脱液稀释2～5倍，得到SPFF洗脱液稀释液；控制SPFF洗脱液稀释液的电导率2.0～8.0 ms/cm，加入终浓度为1～50μmM的CuSO4溶液，以50～100 RPM转速搅拌、2～8℃保温4～20h；
D2、将SPFF洗脱液稀释液使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；
D3、上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；
D4、采用GE SPHP填料装填层析柱，对SPFF洗脱液稀释液进行中度纯化，SPHP柱层析进行中度纯化时，
层析柱：柱高18～20cm、柱直径200mm、柱体积5.5～6.5L；
缓冲液：
SPHP平衡液：pH6.0～6.5、20～50mM的PB；
SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，其pH为6.0～6.5；
上样流速：12～24L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12～24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；
洗脱：洗脱流速12～24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；
收集标准：当UV280nm=200～600mAU时开始收集峰，当UV280nm=1000～200mAU停止收集，得到SPHP洗脱液。
2.根据权利要求1所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，菌体破碎具体为：
A1、mSEB菌体溶解，按质量体积比，mSEB菌体：菌体溶解溶液=1：15～25，在温度不超过20℃进行mSEB菌体的溶解；
A2、mSEB菌体破碎，待mSEB菌体溶解后，使用匀质机在温度不超过20℃、压力为700～800bar破碎2～4次，得到菌液A。
3.根据权利要求2所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤A1中，所述菌体溶解溶液为20～50mM的 PB ，其pH 6.0～6.5。
4.根据权利要求1所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，澄清过滤具体为：
B1、将步骤S1中的菌液A使用高速冷冻离心机离心，离心参数：12000～15000g，2～8℃离心20～30min，收集上清；
B2、将步骤B1中收集的上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤。
5.根据权利要求1所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤S5中，Phenyl HP柱层析进行精细纯化时，
层析柱：柱高9～11cm，柱直径140mm、柱体积1～2L；
缓冲液：
Phenyl HP平衡液：20～50mM PB+0.25～2.5M（NH4）2SO4，其pH为6.0～6.5；
Phenyl HP洗脱液：pH6.0～6.5、20～50mM的PB；
上样流速：12～24L/h；
复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12～24L/h，平衡体积：3～5CV，至UV值、pH、电导稳定；
洗脱：洗脱流速：12～24L/h，洗脱梯度：0～100%B，10CV；
样品收集：收集洗脱液，UV280nm=500～1500mAU开始收集，当UV280nm=1000～200mAU停止收集，得到phenyl HP洗脱液。
6.根据权利要求1所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤S6中，G25柱层析进行脱盐换液时，
层析柱：柱高28～30cm、柱直径300mm、柱体积为20～22L；
平衡液：10～50mML-His+0.9%～1.5%NaCl，其pH为6.0～6.5；
上样流速：50～80L/h，RT＝15min；
上样量≤柱床体积的30%；
检测洗脱液UV280吸收，当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，得到G25层析液；如分次层析，则合并每次洗脱液。
7.根据权利要求1所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤S7中，Q HP柱层析进行层析时，
层析柱：柱高9～11cm、柱直径140mm、柱体积1～2L；
平衡液：10～50mM L-His+0.9%～1.5%NaCl，其pH为6.0～6.5；
上样流速：12～24L/h；
收集流穿液，收集标准：当UV280nm≥50mAU时开始收集，当UV280nm≤50mAU停止收集，得到Q HP流穿液。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的mSEB抗原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤S8中，除菌过滤采用的是0.22μm滤器。
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