CN111624276B - 同时检测盐酸法舒地尔中基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测盐酸法舒地尔中基因毒性杂质5‑异喹啉磺酸甲酯和5‑异喹啉磺酸乙酯的方法。所述方法包括如下步骤：采用HPLC检测；HPLC检测的条件为：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为体积分数为0.5%的三乙胺水溶液，采用磷酸调pH至7.0；流动相B为甲醇；梯度洗脱。在本发明检测条件下，两种杂质和盐酸法舒地尔能有效分离，且两种杂质的出峰良好，响应值较高。使用本发明方法可以大大提高检测的灵敏度，设备仪器均为普通，检测成本低廉，操作极为简便，大大节约了检测成本和检测时间。

Description

同时检测盐酸法舒地尔中基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和 5-异喹啉磺酸乙酯的方法

技术领域

本发明涉及一种盐酸法舒地尔中基因毒性杂质的检测方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

基因毒性杂质是指化合物本身直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。潜在的基因毒性的杂质从结构上看类似基因毒性杂质，有警示性，但未经试验证明的黄曲霉素类、亚硝胺化合物、甲基磺酸酯等化合物均为常见的基因毒性杂质。近年来各国的法规和机构如ICH、FDA、EMA等都对基因毒性杂质有了更明确的要求，越来越多的医药企业在新药研发过程中就着重关注基因毒性杂质的控制和检测。

盐酸法舒地尔潜在的基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯是在合成中间体时5-异喹啉磺酰氯与盐酸法舒地尔粗品制备的溶剂甲醇(甲醇中可能含有少量乙醇)反应生成的磺酸酯类化合物，在生产过程中可能传递到成品中。因此，为了更好地控制盐酸法舒地尔潜的基因毒性杂质，需要选取灵敏度高、简便快捷的方法进行检测，以保证产品的安全性和可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种盐酸法舒地尔中基因毒性杂质的检测方法，在本发明检测条件下，两种杂质和盐酸法舒地尔能有效分离，且两种杂质的出峰良好，响应值较高。

本发明方法所涉及的基因毒性杂质为5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，其中，5-异喹啉磺酸甲酯的结构式如式Ⅰ所示，分子式为C₁₀H₉NO₃S，分子量为223.25；5-异喹啉磺酸乙酯的结构式如式Ⅱ所示，分子式为C₁₁H₁₁NO₃S，分子量为237.28。

本发明采用HPLC检测盐酸法舒地尔中的两种基因毒性杂质。

本发明方法中，HPLC检测的条件如下：

固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

色谱柱为InertSustain AQ-C18，规格为250×4.6mm，5μm；

检测波长：238nm；

流动相A：体积分数为0.5％的三乙胺水溶液，采用磷酸调pH至7.0；

流动相B：甲醇；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述洗脱梯度的程序为：

0～18min，流动相A的体积分数为99％；

18～35mim，流动相A的体积分数由99％下降至40％；

35～40mim，流动相A的体积分数保持为40％；

40～41mim，流动相A的体积分数由40％上升至99％；

41～50mim，流动相A的体积分数保持为99％。

流速：1.0±0.1mL/mim；

柱温箱温度：30±5℃；

进样量：20μl。

若色谱图中出现分别与5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的对照品保留一致的色谱峰，则待测的盐酸法舒地尔中含有杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，实现盐酸法舒地尔中基因毒性杂质的定性检测。

按照下述步骤实现定量检测：

(1)将待测的盐酸法舒地尔配制成供试品溶液，将5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯配制成混合对照品溶液；

(2)将所述混合对照品溶液进行所述HPLC检测，得到所述混合对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的色谱峰面积；

(3)将所述供试品溶液进行所述HPLC检测，得到所述供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的色谱峰面积；

(4)按外标法计算，计算公式为：

式中，C_x为供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的浓度；C_R为混合对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的浓度；A_X为供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的峰面积；A_R为混合对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的峰面积。

定量检测的步骤(1)中，采用如下稀释剂配制所述供试品溶液和所述对照品溶液：体积分数为0.5％的三乙胺水溶液，采用磷酸调pH至7.0。

定量检测的步骤(1)中，所述供试品溶液中所述盐酸法舒地尔的浓度为4.5mg/ml～5.5mg/ml，优选5mg/ml；

所述混合对照品溶液中所述5-异喹啉磺酸甲酯和所述5-异喹啉磺乙酯的浓度为0.072μg/ml～0.088μg/ml，优选0.08μg/ml。

根据ICH对基毒杂质限度的相关指导原则，人在长期服药时，潜在的基毒杂质每日摄入量不能超过1.5μg，盐酸法舒地尔日最大服用量为90mg/天，因此，5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的限度为0.0016％，本发明的检测方法可以满足该限度的检测。

经方法学验证表明，本发明的检测方法***适用性良好；专属性试验表明空白溶剂对杂质的检测无影响，专属性强；本发明方法检测两杂质的灵敏度较高，准确度良好；溶液稳定性试验表明，本发明方法采用的供试品溶液在室温放置，溶液稳定性良好。

使用本发明方法可以大大提高检测方法的灵敏度，设备仪器均为普通，检测成本低廉，操作极为简便，大大节约了检测成本和检测时间。

附图说明

图1为实施例1中在表2所示梯度洗脱条件下的***适用性溶液的色谱图。

图2为实施例1中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的浓度为0.0016％时的***适用性溶液的色谱图。

图3为实施例1中在表3所示梯度洗脱条件下的***适用性溶液的色谱图。

图4为实施例2中空白溶剂(稀释剂)的色谱图。

图5为实施例2中***适用性溶液的色谱图。

图6为实施例2中基因毒性杂质对照品溶液的色谱图。

图7为实施例3得到的5-异喹啉磺酸甲酯的线性结果。

图8为实施例3得到的5-异喹啉磺酸乙酯的线性结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的仪器与试剂：安捷伦1260液相色谱仪(配备紫外检测器)以及分析仪器配置的HPLC色谱工作站；甲醇(色谱纯)、三乙胺(分析纯)、磷酸(分析纯)、纯化水。

实施例1、本发明HPLC检测方法的确定

对5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯进行紫外光谱扫描：精密称取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品适量，分别加乙腈溶解并稀释制成含5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯约5.0μg/ml的溶液。取各溶液在400nm～200nm范围内扫描，结果如表1中所示。

表1 5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的最大吸收波长

名称	最大吸收波长
		5-异喹啉磺酸甲酯	A238.00nm
5-异喹啉磺酸乙酯	A238.00nm
		空白溶剂	/

可以看出，5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯均在238nm附近波长处有较大吸收，表明5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯可以选用HPLC法，以紫外检测器进行检测，且可以选择238nm作为检测波长。

本发明采用三乙胺水溶液(用磷酸调节pH至7.0)和甲醇作为流动相，通过调整流动相体系比例，并采用梯度洗脱方法对色谱条件进行筛选与优化，过程如下：

1、调整流动相比例，采用梯度洗脱

溶液配制：取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释每1ml含各杂质100μg的溶液，作为各杂质贮备液；精密称取盐酸法舒地尔20mg，置25ml量瓶中，精密加入各杂质贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为***适用性溶液。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InertSustain AQ-C18,250×4.6mm，5μm)，以1.0％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至7.0)-甲醇(99：1)为流动相A，甲醇为流动相B，按表2进行梯度洗脱。检测波长为238nm，柱温为30℃，流速为每分钟1ml，进样量20μl。

表2洗脱梯度

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
18	100	0
			30	40	60
31	100	0
			40	100	0

精密取***适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1所示。

由图1可以看出，在上述色谱条件下，5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯和盐酸法舒地尔均分离良好；空白溶剂不干扰各物质出峰；表明在上述条件下既不干扰检测又满足基本分离，可结合本品杂质限度作进一步灵敏度摸索。

2、依据基因毒性杂质限度(0.0016％)继续考察

溶液配制：取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释每1ml含各杂质100μg的溶液，作为各杂质贮备液；精密称取盐酸法舒地尔和量取各杂质贮备液适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含各杂质0.08μg和盐酸法舒地尔5mg的溶液，作为***适用性溶液。

在上述色谱条件下，精密取***适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图2所示。

由图2可以看出，5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯和盐酸法舒地尔均分离良好；在供试品浓度为5mg/ml，基毒杂质的限度浓度(0.0016％)符合灵敏度检测要求；但5-异喹啉磺酸乙酯相邻处有一个未知杂质，为确保其不相互干扰，继续优化色谱条件。

3、色谱条件优化

为确保杂质出峰后，主成分盐酸法舒地尔能完全出峰，且不干扰后续检测，对梯度洗脱进行适当更改。

溶液配制：取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释每1ml含各杂质100μg的溶液，作为各杂质贮备液；精密称取盐酸法舒地尔和量取各杂质贮备液适量，用稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml含各杂质0.08μg和盐酸法舒地尔5mg的溶液，作为***适用性溶液。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(InertSustain AQ-C18，250×4.6mm，5μm)，以0.5％三乙胺水溶液(用磷酸调pH至7.0)为流动相A，甲醇为流动相B，按表2进行梯度洗脱。检测波长238nm，柱温为30℃，流速为每分钟1ml，进样量20μl，捕集小柱4.6×50mm(月旭)。

表3洗脱梯度

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	99	1
18	99	1
			35	40	60
40	40	60
			41	99	1
50	99	1

精密取***适用性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图3所示。

由图3可以看出，5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯和盐酸法舒地尔均分离良好，可拟定本色谱条件，作为检测本品基因毒性杂质的方法，在基线较差时可接入鬼峰捕集小柱。

实施例2、供试品中盐酸法舒地尔及其基因毒性杂质的分离测定

1、相关溶液的配制

(1)5-异喹啉磺酸甲酯贮备液：取5-异喹啉磺酸甲酯对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含1μg的溶液，作为5-异喹啉磺酸甲酯贮备液。

(2)5-异喹啉磺酸乙酯贮备液：取5-异喹啉磺酸乙酯对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含1μg的溶液，作为5-异喹啉磺酸乙酯贮备液。

(3)***适用性溶液：取盐酸法舒地尔对照品(来源：中国食品药品检定研究院批号：100614-201603)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂适量使溶解，再精密加入5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯贮备液0.8ml，用稀释剂稀释刻度，摇匀，作为***适用性溶液。

(4)基因毒性杂质对照品溶液：取5-异喹啉磺酸甲酯对照品和5-异喹啉磺酸乙酯对照品各适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中各约含0.08μg的混合溶液，作为基因毒性杂质对照品溶液。

(5)供试品溶液：取盐酸法舒地尔原料药适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg的溶液，作为供试品溶液。

稀释剂为0.5％(v/v)三乙胺水溶液，用磷酸调pH7.0。

2、色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱为InertSustain AQ-C18，250×4.6mm，5μm；

检测波长：238nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：30℃；

进样量：20μl；

流动相：以0.5％(v/v)三乙胺水溶液(用磷酸调pH至7.0)为流动相A，甲醇为流动相B，洗脱梯度，洗脱程序如表3中所示。

3、分离测定方法

精密量取上述***适用性溶液与基因毒性杂质对照品溶液、空白溶剂(稀释剂)各20μl，注入液相色谱仪进行梯度洗脱，记录色谱图，测定结果如表2所示，色谱图如图4～图6所示。

表4***适用性结果

***适用性	保留时间(min)	塔板数(N)	分离度(R)
				5-异喹啉磺酸甲酯	7.706	8077	/
5-异喹啉磺酸乙酯	15.234	8445	14.95
				盐酸法舒地尔	37.944	69073	36.57

由表4中的数据可以看出，***适用性溶液出峰顺序依次为5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯、盐酸法舒地尔，各杂质与主峰分离度均大于1.5，分离度良好，塔板数较高，符合检测要求。

图4-图6依次为空白溶剂、***适用性溶液与基因毒性杂质对照品溶液的HPLC色谱图，可以看出，空白溶剂(稀释剂)不干扰杂质的检测。

实施例3、线性关系试验

取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品适量，加流动相A稀释制成每1ml约含各对照品1μg的溶液，作为线性贮备液；分别精密量取线性贮备液适量，加流动相A稀释制成定量限、0.04μg/ml、0.08μg/ml、0.12μg/ml、0.16μg/ml、浓度的溶液，作为各浓度线性溶液。

分别精密量取上述各溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度C(μg/ml)对峰面积(A)作线性方程，结果见表5和表6。

表5 5-异喹啉磺酸甲酯线性结果

表6 5-异喹啉磺酸乙酯线性结果

由表5可知，5-异喹啉磺酸甲酯在0.01374μg/ml～0.16584μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，线性方程为：y＝157.3308x-0.3437，r＝0.9998，如图7所示；由表4可知，5-异喹啉磺酸乙酯在0.01337μg/ml～0.16078μg/ml的浓度范围内，线性关系良好，线性方程为：y＝134.5573x-0.5980，r＝0.9995，如图8所示。

实施例4、方法学验证-定量限和检测限

1、检测限

取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成一定浓度的溶液，将此溶液用稀释剂逐级稀释至适宜浓度，在基因毒性杂质检测色谱条件下，以信噪比约为3：1附近时注入色谱仪的量确定检测限浓度，结果如表7所示。

表7检测限结果

由表7中的数据可以看出，两种杂质的检测限浓度分别为0.0069μg/ml、0.0100μg/ml，分别相当于主成分的0.00014％、0.00020％，实验结果表明本发明的色谱条件灵敏度高，适合对两种杂质的检测。

2、定量限

取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成一定浓度的溶液，将此溶液用稀释剂逐级稀释至适宜浓度，在基因毒性杂质检测色谱条件下，以信噪比为10：1附近时注入色谱仪的量确定检测限浓度，结果如表8所示。

表8定量限结果

定量限	浓度(μg/ml)	定量限量(ng)	S/N	相当主成分(％)
					5-异喹啉磺酸甲酯	0.0137	0.2748	12.1	0.00027
5-异喹啉磺酸乙酯	0.0201	0.4020	10.4	0.00040

由表8中数据可以看出，两种杂质的定量限浓度分别为0.0137μg/ml、0.0201μg/ml，分别相当于主成分的0.00027％、0.00040％，实验结果表明本品在较浓度下可以进行定量检出。

上述5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的检测限和定量限的结果表明，本发明方法符合低浓度定量的检测要求，完全满足盐酸法舒地尔基毒杂质涵盖限度的检测。

实施例5、重复性试验

考虑本品未检出5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，因此采用定量加入限度溶度的杂质后，进行重复性考察。

杂质贮备液配制：取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品各5mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀(1μg/ml)。

杂质对照溶液配制：取杂质贮备液2ml，置25ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，作为杂质对照品溶液。平行配制二份。

供试品溶液配制：精密称取盐酸法舒地尔原料125mg，置25ml量瓶中，再精密加入杂质贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。平行配制六份。

精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，考察样品5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的含量变化，结果见表9和表10。

表9 5-异喹啉磺酸甲酯重复性试验结果

表10 5-异喹啉磺酸乙酯重复性试验结果

由上述结果可知，本品采用供试品加标方式测定六份样品的结果，5-异喹啉磺酸甲酯的RSD为1.78％，5-异喹啉磺酸乙酯的RSD为3.80％，说明本发明方法检测本品的重复性良好。

实施例6、准确度试验

为了考察基因毒性杂质测定方法的准确度，进行回收率测定。以0.08μg/ml作为100％，设计50％、100％、150％进行试验。

回收率贮备液配制：取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品各5mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀(1μg/ml)。

杂质对照品溶液配制：取回收率贮备液2ml，置25ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，作为杂质对照品溶液。

底本溶液配制：精密称取本品125mg，置25ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，作为底本溶液。

回收率溶液配制：精密称取本品125mg，置不同25ml量瓶中，分别精密加入回收率贮备液1ml、2ml和3ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为50％、100％和150％回收率溶液。平行配制三份。

分别精密量取上述溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算回收率，结果见表11。

表11 5-异喹啉磺酸甲酯回收率试验结果

表12 5-异喹啉磺酸乙酯回收率试验结果

由上述结果可知，本品3个浓度9样品检测杂质结果均在90.0％～108.0％之间，测得结果的RSD均小于5.0％，说明本方法检测本品的准确度良好。

实施例7、稳定性试验

本品盐酸法舒地尔原料未检出5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，为准确考察在配制成溶液后杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯稳定情况，采用定量加入杂质后方式，对其进行溶液稳定性考察。

供试品溶液配制：精密称取本品125mg，置25ml量瓶中，精密加入杂质贮备液2ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

取上述供试品溶液，在常温放置24小时，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h和24h进样20μl，记录色谱图，以5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的检出量变化情况衡量供试品溶液稳定性。结果见表13。

表13供试品溶液稳定性结果

由上述结果可知，供试品溶液在常温放置24h过程中，5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯检出量变化较小，表明供试品溶液在室温下24h内稳定。

实施例8、耐用性试验

为考察本品色谱条件发生微小变化时，本发明方法对本品检测的耐受程度，对其进行色谱条件耐用性考察，具体参数变化如下：

表14色谱条件变动参数

***适用性溶液配制：取5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯对照品各5mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液。另取盐酸法舒地尔对照品50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相A适量使溶解，精密加入杂质对照品贮备液0.8ml，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为***适用性溶液。

对照溶液配制：取杂质贮备液2ml，置25ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。

供试品溶液配制：精密称取本品125mg，置25ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪，考察各条件耐用性，结果如表15-表20所示：

表15耐用性不同流速-***适用性结果

表16耐用性不同流速-杂质含量结果

表17耐用性不同柱温-***适用性结果

表18耐用性不同柱温-杂质含量结果

表19耐用性不同色谱柱-***适用性结果

表20耐用性不同色谱柱-杂质含量结果

由上述结果可知，对有关物质色谱条件进行微调，不同流速、不同柱温和不同色谱柱条件下，各杂质测定结果基本一致，表明本发明方法的色谱条件中，色谱条件微变对盐酸法舒地尔中基因毒性杂质测定无影响，本发明方法色谱条件耐用性良好。

Claims (1)

1.一种同时检测盐酸法舒地尔中基因毒性杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的方法，包括如下步骤：

采用HPLC检测盐酸法舒地尔中的杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，实现对盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的定性检测或定量检测；

所述HPLC检测的条件如下：

固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

色谱柱：InertSustain AQ-C18，规格为250×4.6mm，5μm；

检测波长：238nm；

流动相A：体积分数为0.5％的三乙胺水溶液，采用磷酸调pH至7.0；

流动相B：甲醇；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序为：

0～18min，流动相A的体积分数为99％；

18～35mim，流动相A的体积分数由99％下降至40％；

35～40mim，流动相A的体积分数保持为40％；

40～41mim，流动相A的体积分数由40％上升至99％；

41～50mim，流动相A的体积分数保持为99％；

流速：1.0±0.1mL/mim；

柱温箱温度：30±5℃；

进样量：20μl；

按照下述步骤实现对盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的定性检测：

若色谱图中出现与5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的对照品保留一致的色谱峰，则待测的盐酸法舒地尔中含有杂质5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯，实现对盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的定性检测；

按照下述步骤实现对盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的定量检测：

(1)将待测的盐酸法舒地尔配制成供试品溶液，将5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯配制成混合对照品溶液；

采用稀释剂配制所述供试品溶液和所述混合对照品溶液，所述稀释剂为体积分数为0.5％的三乙胺水溶液，采用磷酸调pH至7.0；

所述供试品溶液中所述盐酸法舒地尔的浓度为4.5～5.5mg/ml；

所述混合对照品溶液中所述5-异喹啉磺酸甲酯和所述5-异喹啉磺酸乙酯的浓度均为0.072～0.088μg/ml；

(2)将所述混合对照品溶液进行所述HPLC检测，得到所述混合对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的色谱峰面积；

(3)将所述供试品溶液进行所述HPLC检测，得到所述供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的色谱峰面积；

(4)按照式(1)即得到所述供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的含量；

式中，C_x为供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的浓度；C_R为混合对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的浓度；A_X为供试品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的峰面积；A_R为混合对照品溶液中5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯的峰面积。

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